豬瘟病毒快速檢測(cè)方法研究進(jìn)展

申秋平，王麗群，曹 霞，莊林林

（ 江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400 ）

豬瘟是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。CSFV為單股正鏈RNA病毒，與牛病毒性腹瀉病毒1型（BVDV-1）和2 型（BVDV-2）、羊邊界病病毒（BDV）等同屬于黃病毒科瘟病毒屬，基因組全長(zhǎng)約1.25 kb，編碼一個(gè)開(kāi)放閱讀框，其5'和3'端各有一個(gè)非編碼區(qū)（UTRs）。CSFV目前已被分為3種基因型（1型、2型和3型）[1]，并可進(jìn)一步分為11個(gè)亞型（1.1、1.2、1.3、1.4、2.1、2.2、2.3、3.1、3.2、3.3 和3.4）。CSFV可引起家豬和野豬感染，并可在豬群之間快速傳播。豬瘟已被列為需向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織通報(bào)的疫病，我國(guó)也將其列為一類(lèi)傳染病。近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)快速發(fā)展，CSFV不斷變異，導(dǎo)致經(jīng)典豬瘟向非典型、溫和型豬瘟等演變，同時(shí)臨床中存在多種病原混合感染，提高了臨床診斷難度?；诖?，本文綜述了當(dāng)前國(guó)內(nèi)外CSFV 快速檢測(cè)方法的研究進(jìn)展，以期為我國(guó)獸醫(yī)工作者快速精準(zhǔn)診斷及科學(xué)防控豬瘟提供參考。

1 基于血清學(xué)的快速檢測(cè)方法

1.1 免疫層析試紙條方法

抗體檢測(cè)是目前畜禽疫病快速診斷和防控措施的重要組成部分。由于目前監(jiān)測(cè)抗體（Abs）的方法費(fèi)時(shí)、價(jià)格較高且需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和病毒操作，Xu等[2]以CSFV E2蛋白為標(biāo)記抗原開(kāi)發(fā)了一種免疫層析試紙用于快速檢測(cè)CSFV Abs，該試紙檢測(cè)血清中CSFV Abs 的靈敏度可達(dá)1∶128 000，且與其他豬病毒的Abs 無(wú)交叉反應(yīng)。為實(shí)現(xiàn)CSFV 即時(shí)檢測(cè)，Sambandam 等[3]利用CSFV 1.1 單克隆抗體開(kāi)發(fā)的免疫層析方法可檢測(cè)到樣品中低至36.8 TCID50/mL的CSFV；且與PCR相比，該方法的敏感性和特異性分別為80.36%和87.10%。此外，為提高E2蛋白與CSFV抗體之間的親和力，Bai等[4]基于Bac-to-Bac桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的重組E2 蛋白開(kāi)發(fā)了免疫層析試紙法，靈敏度可達(dá)1∶102 400。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體在載體表面進(jìn)行反應(yīng)的一種方法。Cao等[5]基于重組CSFV E2蛋白開(kāi)發(fā)了一種固相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)方法（solid-phase blocking ELISA，spbELISA）以特異性檢測(cè)豬血清中的CSFV 抗體，結(jié)果表明，spbELISA法可快速檢測(cè)接種CSFV C株的豬的抗體水平，且適用于大規(guī)模篩選。鑒于基于CSFV全長(zhǎng)E2蛋白的ELISA無(wú)法區(qū)分抗CSFV和抗BVDV抗體，Ji等[6]構(gòu)建了一種涵蓋抗原域B、C、D、A（E2B、C、D、A）的重組CSFV E2蛋白，并以此建立了一種增強(qiáng)的間接ELISA方法。使用該方法未觀察到抗BVDV血清的交叉反應(yīng)，并顯示出較高的敏感性（93.7%）和特異性（92.3%）。

使用活體標(biāo)記疫苗進(jìn)行接種是有效控制疫情的重要途徑，但該方案的實(shí)施需以可區(qū)分感染動(dòng)物和接種疫苗動(dòng)物（DIVA）為基礎(chǔ)。由于保護(hù)性免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)多依賴(lài)針對(duì)CSFV E2蛋白的病毒中和抗體，因此優(yōu)選DIVA 策略是基于對(duì)受感染豬群中Erns特異性抗體的檢測(cè)。基于此，Meyer等[7]開(kāi)發(fā)了一種Erns雙抗原ELISA以區(qū)分CSFV標(biāo)記疫苗和野毒株，與常規(guī)CSFV E2 抗體ELISA 相比，該方法可更早地檢測(cè)到血清中的抗體，且靈敏度和特異性分別達(dá)90.2%、93.8%。

為縮短CSFV 檢測(cè)時(shí)間并簡(jiǎn)化步驟，Conlan 等[8]開(kāi)發(fā)了一種以免疫磁珠（immunomagnetic bead，IMB）為固相載體的抗原捕獲ELISA（IMB-ELISA）方法；結(jié)果表明，IMBELISA的分析靈敏度比常規(guī)ELISA高64倍，靈敏度和特異性均為100%，該方法支持目視判斷，且比常規(guī)ELISA更易操作。此外，為實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)且可靠地檢測(cè)CSFV抗體，趙少若等[9]通過(guò)制備E2 蛋白單克隆抗體建立了一種CSFV 阻斷ELISA 方法。結(jié)果表明，豬瘟疫苗免疫2 周后即可使用該方法檢測(cè)到相應(yīng)的抗體，且與BVDV無(wú)交叉反應(yīng)。

1.3 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法

化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法是基于化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的光輻射而進(jìn)行分析的一種方法，具有靈敏度高、選擇性好、速度快、線(xiàn)性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。麻園等[10]以E2蛋白為包被抗原建立了一種CSFV 化學(xué)發(fā)光抗體檢測(cè)法，該方法可在20 min內(nèi)完成血清中的CSFV 抗體檢測(cè)，且具有良好的特異性和重復(fù)性。為驗(yàn)證CSFV 化學(xué)發(fā)光競(jìng)爭(zhēng)ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用效果，徐璐等[11]通過(guò)對(duì)2 200份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，所用試劑盒與進(jìn)口試劑盒具有高度一致性，且與病毒中和試驗(yàn)結(jié)果接近完全一致。

1.4 生物傳感器方法

隨著生物、物理、化學(xué)等多學(xué)科技術(shù)的融合創(chuàng)新，生物傳感器因其速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已越來(lái)越多地應(yīng)用于病原微生物快速檢測(cè)[12]。其中，磁致彈性（magnetoelastic，ME）傳感器是基于磁致伸縮原理、利用兩個(gè)不同磁場(chǎng)交叉產(chǎn)生應(yīng)變脈沖信號(hào)以測(cè)量位置的一種傳感器。Guo 等[13]利用抗CSFV IgG 構(gòu)建了一種可快速檢測(cè)CSFV 的高敏ME 生物傳感器，該傳感器的諧振頻率可隨CSFV 濃度的增加而增加，檢測(cè)限可達(dá)0.6 mg/L，且在0～2.5 mg/L的范圍內(nèi)共振頻率移動(dòng)與濃度呈線(xiàn)性比例。為進(jìn)一步提升CSFV檢測(cè)能力，該團(tuán)隊(duì)還基于E2蛋白開(kāi)發(fā)了一種無(wú)線(xiàn)ME生物傳感器[14]，檢測(cè)限達(dá)到2.466 μg/L，為E2抗體檢測(cè)提供新的可選工具。

2 基于核酸的快速檢測(cè)方法

2.1 基于逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是結(jié)合RNA 的逆轉(zhuǎn)錄和cDNA 的PCR 反應(yīng)的技術(shù)。目前已發(fā)表的研究主要基于CSFV 5' UTR、E2 糖蛋白基因以及NS非結(jié)構(gòu)性蛋白基因等設(shè)計(jì)通用檢測(cè)及分型引物。CSFV、非典型豬瘟病毒（APPV）和非洲豬瘟病毒（ASFV）給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Liu等[15]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)上述3 種病毒的多重RT-PCR 方法，該方法對(duì)ASFV、CSFV和APPV具有高特異性、敏感性和可重復(fù)性，檢測(cè)CSFV 的靈敏度為6.34×10 copies/μL。Rajkhowa等[16]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)CSFV、豬圓環(huán)病毒2 型（PCV2）和豬細(xì)小病毒（PPV）的三重PCR 方法，該方法靈敏度可達(dá)300 pg/反應(yīng)，為豬DNA和RNA病毒混合感染快速檢測(cè)提供方法參考。

巢式PCR（nested PCR，nPCR）作為PCR 的衍生技術(shù)，通過(guò)兩對(duì)引物進(jìn)行兩輪PCR 反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)高靈敏度和特異性檢測(cè)。魏淑英等[17]根據(jù)CSFV Alfort、Brescia和C株基因組序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物建立了一種逆轉(zhuǎn)錄nPCR（RTnPCR）方法，該方法可快速檢測(cè)待檢樣品中的CSFV。吳旭錦等[18]建立的RT-nPCR 方法檢測(cè)限達(dá)6.7×10-5ng/L。胡建和等[19]開(kāi)發(fā)的nPCR 實(shí)現(xiàn)了CSFV、BVDV 和BDV 快速鑒別。此外，為縮短檢測(cè)時(shí)間，Barlic-Maganja等[20]通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增CSFV RNA后在微孔板中與捕獲探針雜交，并通過(guò)ELISA 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行比色檢測(cè)和區(qū)分，建立的RTPCR-ELISA法比常規(guī)RT-PCR靈敏度高100倍，且具有良好的特異性。

2.2 基于熒光定量PCR的方法

熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技術(shù)以快速、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于微生物鑒定、基因表達(dá)分析等研究。通過(guò)將RNA 先逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 或直接在反應(yīng)體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶，即可實(shí)現(xiàn)RNA 快速定量檢測(cè)。趙建軍等[21]使用CSFV 通用引物和野毒株特異性TaqMan探針，建立的qPCR方法檢測(cè)限低至10 copies/μL，并在108～101范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，此外使用該方法可在表現(xiàn)出豬瘟臨床癥狀前3～4 d檢出CSFV。Zheng等[22]利用SYBR green I 建立的雙重qPCR 方法可同時(shí)檢測(cè)CSFV 和豬圓環(huán)病毒3 型（PCV3），并表現(xiàn)出較高的靈敏度、特異性和可重復(fù)性。Ning等[23]基于NS2基因建立了一種高分辨率熔解曲線(xiàn)分析方法，可用于同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分CSFV 疫苗株和石門(mén)株。為加快核酸擴(kuò)增及提高檢測(cè)能力，Wernike 等[24]評(píng)估了高速qPT-PCR 在檢測(cè)CSFV 中的應(yīng)用性能。結(jié)果表明，高速qPT-PCR 的靈敏度為200 copies/μL，但不同PCR儀的反應(yīng)時(shí)間和靈敏度略有不同。Liu等[25]基于引物-探針能量轉(zhuǎn)移建立了一種qPCR方法以用于CSFV 高效檢測(cè)。該方法檢測(cè)限可達(dá)20 copies/反應(yīng)，并具有高特異性和可重復(fù)性，通過(guò)熔解曲線(xiàn)分析可準(zhǔn)確區(qū)分CSFV野毒株和疫苗株。

為優(yōu)化逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以提高RT-qPCR 的靈敏度，Podgórska等[26]通過(guò)比較不同的逆轉(zhuǎn)錄酶、熱條件和引物組合，發(fā)現(xiàn)使用SuperScript Ⅱ酶、非酰胺和反向、基因特異性引物可獲得最佳的逆轉(zhuǎn)錄效果。與使用AMV酶與隨機(jī)六聚體的方法相比，該組合可將RT-PCR 的靈敏度提高近1 000 倍。此外，為便于快速采樣，Petrini 等[27]通過(guò)采集感染后不同時(shí)間的口腔液和血清進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明使用RT-qPCR 可從口腔液中檢測(cè)到CSFV 的概率與血樣相同甚至更高。為進(jìn)一步簡(jiǎn)化樣本處理過(guò)程，Nishi等[28]開(kāi)發(fā)了一種免核酸提取的多重RT-qPCR 以同時(shí)檢測(cè)ASFV、CSFV和豬內(nèi)源基因，使用血清和組織勻漿作為樣本時(shí)，該方法均顯示出良好的敏感性和特異性?？紤]到5' UTR 作為CSFV檢測(cè)單一靶標(biāo)的局限性，Leifer等[29]使用NS5A基因作為靶標(biāo)，并與β-肌動(dòng)蛋白檢測(cè)系統(tǒng)聯(lián)用建立了一種RT-qPCR 方法。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測(cè)結(jié)果可靠且獨(dú)立于5' UTR，為CSFV精準(zhǔn)檢測(cè)及實(shí)驗(yàn)室排除5' UTR擴(kuò)增產(chǎn)物污染提供了工具支持。

2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）

LAMP 是2000 年由Notomi 等[30]發(fā)明的一種核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)的特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條擴(kuò)增引物（其中兩條為長(zhǎng)引物），在鏈置換DNA 聚合酶的作用下，60～65 ℃、60 min 內(nèi)可擴(kuò)增出109～1010個(gè)靶序列，具有擴(kuò)增效率高、支持目視判斷等優(yōu)點(diǎn)。Chen 等[31]基于CSFV 5' UTR開(kāi)發(fā)的RT-LAMP 方法可在65 ℃、60 min內(nèi)完成檢測(cè)，該方法檢測(cè)限可達(dá)5 copies/反應(yīng)，并顯示出比RT-PCR 和病毒分離更高的檢測(cè)率。Yin 等[32]建立的RTLAMP 方法可在50 min 內(nèi)完成CSFV 檢測(cè)，且靈敏度和實(shí)際檢測(cè)性能均優(yōu)于常規(guī)RT-PCR。

為實(shí)現(xiàn)LAMP 結(jié)果可視化，Zhang 等[33]在反應(yīng)體系中加入SYBR Green I，可根據(jù)反應(yīng)前后顏色變化進(jìn)行判斷，并實(shí)現(xiàn)與RT-qPCR 相當(dāng)?shù)臋z測(cè)性能。Zhang 等[34]應(yīng)用SYBR Green I 建立的可視化LAMP 方法靈敏度達(dá)5 copies/反應(yīng)，并可特異性檢測(cè)CSFV疫苗株（HCLV）。此外，鑒于免疫層析試紙條簡(jiǎn)單、快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，Chowdry 等[35]結(jié)合LAMP 與免疫層析試紙建立了一種可用于CSFV 快速檢測(cè)的方法，使用試紙可在2～5 min 內(nèi)讀取擴(kuò)增結(jié)果，分析靈敏度約為100 copies/反應(yīng)。

2.4 基于重組酶的核酸擴(kuò)增方法

重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）是近年來(lái)發(fā)展的一種核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可在37～42 ℃恒溫條件下實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列快速擴(kuò)增，具有反應(yīng)條件溫和、擴(kuò)增效率高等優(yōu)點(diǎn)。楊俊等[36]基于CSFV 5'端UTR 設(shè)計(jì)引物和exo 探針，建立的實(shí)時(shí)熒光RPA 方法可在30 min 內(nèi)完成CSFV 檢測(cè)，針對(duì)CSFV 重組質(zhì)粒的檢測(cè)限為8.3×102copies/μL，且具有良好的特異性。Tu 等[37]開(kāi)發(fā)了一種基于熒光探針的實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄重組酶介導(dǎo)核酸擴(kuò)增方法（real-time reverse transcription recombinase-aided amplification，rRT-RAA），該方法對(duì)CSFV 表現(xiàn)出良好的特異性和可重復(fù)性，靈敏度達(dá)2 TCID50/反應(yīng)，與RT-qPCR 方法的重合率為98.5%。同時(shí)，rRT-RAA結(jié)果可通過(guò)藍(lán)光成像儀直接肉眼觀察。

為區(qū)分CSFV 野毒株和疫苗株，Zhang 等[38]聯(lián)合RTRAA 和CRISPR/Cas13a 建立的快速診斷方法檢測(cè)限可達(dá)3.0×102copies/μL。同時(shí)，通過(guò)引入加熱未提取的診斷樣品以滅活核酸酶處理方法，敏感性比抗原ELISA 高100倍。薛俊欣等[39]基于Cas13a建立的RAA-Cas13a方法將檢測(cè)靈敏度提高至102copies/μL，并具有良好的特異性和可重復(fù)性。

2.5 微陣列方法

基因微陣列是近年來(lái)發(fā)展的一種分子技術(shù)，可通過(guò)成千上萬(wàn)個(gè)DNA 片段密集排列于硅片、玻片或尼龍膜等固相載體上，在特定條件下與樣品靶序列雜交，通過(guò)熒光顯微鏡等設(shè)備獲取圖像后進(jìn)行信息分析，該技術(shù)具有高效率、高通量等優(yōu)勢(shì)，適于大規(guī)模檢測(cè)。Xia等[40]開(kāi)發(fā)了一種基于四重PCR的微陣列方法，可一步法區(qū)分CSFV野毒株和疫苗株、ASFV 以及APPV；該方法對(duì)CSFV 野毒株和疫苗株的檢測(cè)限分別為6.98 和6.92 copies/μL。為快速準(zhǔn)確鑒別CSFV 的3 種基因型，Kim 等[41]開(kāi)發(fā)了一種CSFV DNA芯片方法，擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片上的探針進(jìn)行雜交后通過(guò)熒光掃描進(jìn)行檢測(cè)；該方法檢測(cè)限可達(dá)1 TCID50/100 μL，且檢測(cè)結(jié)果與序列分析結(jié)果一致。為實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)，王溫田等[42]將生物素標(biāo)記PCR 產(chǎn)物后與基因芯片進(jìn)行特異性逆向點(diǎn)雜交，通過(guò)芯片掃描實(shí)現(xiàn)對(duì)病原的檢測(cè)和分析。結(jié)果表明，目標(biāo)核酸與芯片雜交后可顯示明顯的陽(yáng)性信號(hào)，且重復(fù)性良好。

2.6 其他快速檢測(cè)方法

絕緣等溫PCR（insulated isothermal PCR，iiPCR）是利用反應(yīng)容器下的單一熱源，通過(guò)瑞利-貝納德對(duì)流產(chǎn)生溫度梯度的一種PCR 方法。Lung 等[43]基于逆轉(zhuǎn)錄iiPCR（iiRT-PCR）技術(shù)，采用POCKIT?核酸分析儀檢測(cè)來(lái)自目標(biāo)特異性熒光標(biāo)記探針的光學(xué)信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)CSFV 高靈敏度和特異性的檢測(cè)。此外，iiRT-PCR 法可從病毒接種2 d后的血清中檢出CSFV，顯示出其具有早期診斷應(yīng)用價(jià)值。

G-四聚體DNA 酶已成為可視化DNA 檢測(cè)的重要可選工具。Lu 等[44]聯(lián)合比色G-四聚體DNA 酶與依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增方法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）建立了一種可目視檢測(cè)CSFV 石門(mén)株和HCLV 株的方法，該方法可在3 h 內(nèi)檢測(cè)到血清中低至10 copies/mL 的CSFV。隨著RNA 原位雜交方法的發(fā)展，病毒RNA 分子在培養(yǎng)細(xì)胞或組織切片中的定量、定位和可視化成為研究致病性的重要手段。Zhang 等[45]設(shè)計(jì)CSFV 和β-actin 探針，建立了一種RNA 原位雜交方法可監(jiān)測(cè)RNA 在感染細(xì)胞中的相對(duì)位置，該方法可特異性檢測(cè)CSFV 1.1、2.1、2.2 和2.3 亞型，且最早可在感染后0.5 h檢測(cè)到病毒RNA。此外，為提高CSFV檢測(cè)效率并簡(jiǎn)化步驟，Ning 等[46]設(shè)計(jì)了一種DNA 序列共軛修飾的金納米（CSFV-AuNP）探針以實(shí)時(shí)檢測(cè)CSFV，修飾的DNA 序列能夠特異性識(shí)別和捕獲CSFV RNA 并產(chǎn)生熒光信號(hào)以實(shí)現(xiàn)定量分析。

3 展望

鑒于目前豬瘟越來(lái)越多地表現(xiàn)為非典型、溫和型以及混合感染等復(fù)雜形式，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)已成為豬瘟確診的重要輔助手段。多種檢測(cè)方法中，病毒分離培養(yǎng)結(jié)果準(zhǔn)確，但煩瑣費(fèi)時(shí)，難以滿(mǎn)足病原確認(rèn)的時(shí)效性需求。基于免疫學(xué)和核酸的檢測(cè)方法具有方便快速、方案設(shè)計(jì)靈活多樣等優(yōu)勢(shì)，已成為常用的CSFV檢測(cè)方法，但免疫學(xué)檢測(cè)方法敏感性有待提高，且具有一定的滯后性。基于核酸的檢測(cè)方法快速、靈敏、特異，且病毒核酸可以在宿主感染后更早地被檢測(cè)到，但目前以PCR為代表的核酸技術(shù)或依賴(lài)存在安全威脅的電泳試驗(yàn)，或需使用成本較高的試劑及儀器，難以推廣至資源條件有限的用戶(hù)。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)為核酸檢測(cè)提供新的工具支持，但目前在引物（探針）設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系成熟度等方面仍存在一定局限性，且綜合性能（包括靈敏度、特異性及可重復(fù)性等）仍有待提升。隨著多學(xué)科技術(shù)的發(fā)展與融合創(chuàng)新，期待未來(lái)能夠出現(xiàn)更多簡(jiǎn)單快速、成本可控且用戶(hù)友好的新興技術(shù)以更好地滿(mǎn)足即時(shí)檢測(cè)、欄邊檢測(cè)以及超多重檢測(cè)等多樣化需求。