• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立

    2023-03-05 14:04:18趙興坤楊麗云羅麗娟劉攀道
    草地學(xué)報 2023年2期
    關(guān)鍵詞:柱花草毛狀子葉

    趙興坤, 孫 昊, 楊麗云, 羅麗娟*, 劉攀道

    (1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院, 海南 ???570228; 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所, 農(nóng)業(yè)部華南作物 基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室, 海南 ???571101)

    柱花草屬(StylosanthesSw.)植物屬于豆科蝶形花亞科,全屬約有50個種,遺傳多樣性豐富,分布于美洲、非洲和東南亞,其起源中心為巴西和墨西哥[1]。圭亞那柱花草(S.guianensis)是目前世界范圍內(nèi)栽培面積最大的柱花草屬植物,在熱帶與亞熱帶地區(qū),既可作為物草種植,也可作為綠肥作物種植,用于提升土壤肥力和防止水土流失[2]。圭亞那柱花草最早由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院于20世紀(jì)八十年代引入我國,主要用作幼齡橡膠園的覆蓋作物[3]。隨后,中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院又陸續(xù)從國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)引進(jìn)了圭亞那柱花草種質(zhì)200余份,并利用這些種質(zhì)為親本培育了11個圭亞那柱花草的國家審定牧草品種,這些品種在海南、云南、貴州、廣西、廣東等省區(qū)已累計推廣30多萬公頃,圭亞那柱花草已成為我國最重要的熱帶豆科牧草之一[4]。圭亞那柱花草相較于其他柱花草屬植物具有產(chǎn)量高、粗蛋白含量高、飼用品質(zhì)好、對酸性土壤逆境脅迫(低磷、鋁毒害、錳毒害)的適應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)[5-6],也存在莖稈匍匐、抗寒性低、落粒性強(qiáng)缺點(diǎn),因此,利用與近緣種雜交的方式對圭亞那柱花草進(jìn)行改良是今后柱花草育種的主要目標(biāo)[7]。

    細(xì)莖柱花草(S.gracilis)在植物分類學(xué)上原被歸為圭亞那柱花草的變種(S.guianensisvar. gracilis),后來被認(rèn)定為一個新種[8]。細(xì)莖柱花草與圭亞那柱花草在基因組分型上均為GG型二倍體種,在目前發(fā)現(xiàn)的柱花草屬植物中兩者親緣關(guān)系最近,可種間雜交(無生殖隔離)[9]。作為圭亞那柱花草的野生近緣種,細(xì)莖柱花草因產(chǎn)量低、易感炭疽病、木質(zhì)化程度高等缺點(diǎn),未被馴化選育成牧草品種用于生產(chǎn)利用。但是,細(xì)莖柱花草也具有明顯的優(yōu)點(diǎn),如抗旱能力較強(qiáng)、種子產(chǎn)量高(落粒性低)、莖稈直立利于機(jī)械化收割等特點(diǎn)。因此,細(xì)莖柱花草可作為改良現(xiàn)有柱花草品種的理想材料。

    發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)是一種革蘭氏陰性菌,廣泛分布于土壤中,早在20世紀(jì)初科學(xué)家就發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)一部分植物產(chǎn)生毛狀根,其攜帶Ri質(zhì)粒中的T-DNA片段進(jìn)入植物細(xì)胞并整合進(jìn)植物基因組中,能刺激植物產(chǎn)生大量的毛狀根,且產(chǎn)生的毛狀根均由單個的細(xì)胞發(fā)育而來,遺傳性狀穩(wěn)定,無嵌合體[10-11]。毛狀根轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在多種植物中被廣泛應(yīng)用,本文旨在利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo),建立一種適用于細(xì)莖柱花草的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系,為今后的柱花草屬植物的基因功能研究及生物育種提供技術(shù)儲備。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1植物材料與試劑 本研究使用的細(xì)莖柱花草種子材料由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所提供。GFP抗體、山羊抗兔IgG-HRP抗體均采購于美國Cell Signaling Technology公司。

    1.1.2菌株與質(zhì)粒 發(fā)根農(nóng)桿菌ArQua1,K599,MSU440,C58C1和大腸桿菌DH5α均采購于上海唯地生物技術(shù)有限公司;pEGAD為常見的雙元載體,該載體含有綠色熒光蛋白報告基因(GFP),由本實驗室保存并提供。

    1.2 試驗方法

    1.2.1菌株的選擇和活化 選取4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌株ArQua1、K599、MSU440、C58C1進(jìn)行試驗。將4種發(fā)根農(nóng)桿菌在含有50 mg·L-1鏈霉素的LB固體培養(yǎng)基上劃線,28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。挑取單菌落分別接種于含有鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中,28℃下200 r·min-1培養(yǎng)12 h。取500 μL菌液轉(zhuǎn)移至50 mL含有鏈霉素的LB液體培養(yǎng)基中,200 r·min-1培養(yǎng)菌液OD600至0.9,5 000 r·min-1離心10 min,棄上清,使用不含抗生素的YEB液體培養(yǎng)基重懸菌體,菌液用于侵染細(xì)莖柱花草外植體。

    1.2.2載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌 采用凍融法將pEGAD質(zhì)粒轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440感受態(tài)。取500 ng質(zhì)粒加入50 μL感受態(tài)中混勻,冰上靜置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min,加入500 μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基,28℃震蕩培養(yǎng)2 h,吸取100 μL菌液涂布于含有50 mg·L-1鏈霉素和50 mg·L-1卡那霉素的LB固體平板上28℃培養(yǎng)48 h,挑取單克隆菌落,進(jìn)行PCR鑒定,選擇陽性克隆菌落保存,用于下一步轉(zhuǎn)化柱花草。

    1.2.3柱花草無菌苗的培育 取適量的細(xì)莖柱花草種子去除外種皮,挑選完整飽滿的種子放置于2 mL離心管中,加入1 mL去離子水,80℃水浴3 min打破種子的休眠,于無菌工作臺中吸取去離子水,75%的酒精浸泡90 s,無菌水洗滌3次,0.1%氯化汞溶液浸泡10 min,無菌水洗滌6次,置于無菌濾紙上吸干。將滅菌后的種子使用無菌的鑷子接種于MS培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)。

    1.2.4外植體的獲得及毛狀根的誘導(dǎo) 使用已滅菌的鑷子將萌發(fā)2 d的無菌苗從培養(yǎng)基上取出,置于鋪有無菌水浸濕濾紙的無菌培養(yǎng)皿上,使用無菌手術(shù)刀從柱花草子葉節(jié)下約1 mm處切去下胚軸,再沿子葉節(jié)將兩片子葉切開,同時在子葉上劃出3個傷口,即獲得侵染所需的子葉外植體。將子葉外植體放入侵染液中侵染15 min,用鑷子將侵染后的外植體放至無菌濾紙上吸干多余菌液,置于MS固體培養(yǎng)基上25℃暗培養(yǎng)2 d;暗培養(yǎng)結(jié)束后使用1/2 MS+特美汀(200 mg·L-1)液體培養(yǎng)基清洗外植體,最后將外植體置于1/2 MS+特美汀固體培養(yǎng)基上25℃、12 h·d-1光照條件下培養(yǎng)。

    圖1 細(xì)莖柱花草子葉毛狀根的誘導(dǎo)Fig.1 Hairy roots of Stylosanthes gracilis induced from its cotyledon注:A~B,待轉(zhuǎn)化細(xì)莖柱花草幼苗;C~G,子葉外植體獲取;H,發(fā)根農(nóng)桿菌侵染;I,共培養(yǎng);J~K,毛狀根誘導(dǎo)培養(yǎng);L,毛狀根脫菌培養(yǎng)Note:Panel A~B display the seedings to be transferred;Panel C~G the acquisition of cotyledon explants;Panel H the Agrobacterium rhizogenes infection;Panel I the co-culture duration;Panel J~K the induced root;Panel L the sterilized culture

    1.2.5不同發(fā)根農(nóng)桿菌侵染實驗 利用OD600=0.6的4種發(fā)根農(nóng)桿菌菌液分別侵染細(xì)莖柱花草的子葉外植體,誘導(dǎo)培養(yǎng)20天后統(tǒng)計毛狀根的誘導(dǎo)率。本試驗共3個重復(fù),每個重復(fù)20個子葉外植體。

    1.2.6菌液濃度、侵染時間及共培養(yǎng)時間正交試驗 基于菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間開展L9(34)正交實驗,菌液濃度分別設(shè)置為OD600=0.3,0.6,0.9;侵染時間設(shè)置為10 min,15 min,30 min;共培養(yǎng)時間設(shè)置為2 d,3 d,4 d。誘導(dǎo)20天后對毛狀根進(jìn)行形態(tài)檢測,使用雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源(LUYOR-3415RG)觀察并統(tǒng)計發(fā)綠色熒光的毛狀根數(shù)目,計算毛狀根轉(zhuǎn)化率,同時對發(fā)綠色熒光的毛狀根進(jìn)行繼代培養(yǎng)。

    1.2.7轉(zhuǎn)基因毛狀根的DNA分子鑒定 使用雙波長便攜式熒光蛋白激發(fā)光源觀察GFP的表達(dá)情況,初步篩選出陽性毛狀根。取0.1 g毛狀根樣品,液氮研磨,通過CTAB法[12]提取DNA。以DNA為模板,通過四對基因特異引物進(jìn)行PCR驗證,其中rolB為發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的毛狀根誘導(dǎo)基因,其上游引物為GCTCTTGCAGTGCTAGATTT(引物方向5′→3′,下同),下游引物為GAAGGTGCAAGCTACCTCTC,PCR產(chǎn)物長度為423 bp;GFP為pEGAD載體上T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的綠色熒光蛋白基因,其上游引物為TCGTGACCACCCTGACCTAC,下游引物為GACCATGTGATCGCGCTTCT,PCR產(chǎn)物長度為478 bp;Bar為pEGAD載體上T-DNA插入?yún)^(qū)內(nèi)的抗除草劑基因,其上游引物為GGTCTGCACCATCGTCAACC,下游引物為CCCACGTCATGCCAGTTCC,PCR產(chǎn)物長度為426 bp;UBCE1(ubiquitin-conjugating enzyme 1)為柱花草內(nèi)參基因,其上游引物為CAGATCAAGCTGCTGACGAA,下游引物為GAACAAGCGATCATCAGGTTT,PCR產(chǎn)物長度為127 bp。

    1.2.8蛋白質(zhì)印跡法(Western blot) 取0.5 g柱花草毛狀根樣品,液氮研磨后加入50 μl 2.5×SDS-PAGE loading buffer,65℃水浴7 min,12 000 r·min-1離心10 min,取上清即為蛋白樣品。取10 μl樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳,濃縮膠恒壓80V約60 min,分離膠恒壓120V,通過預(yù)染蛋白Marker確定電泳終止時間。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜,恒壓60V約120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,PVDF膜用1× TBST清洗4次,每次10 min,清洗后加入2%的脫脂牛奶封閉60 min。按照1∶1 000的比例將10 μl GFP抗體加入到10 ml的2%脫脂牛奶中,4℃搖床孵育過夜。用1× TBST清洗4次,每次10 min以洗去未結(jié)合的抗體,按照1∶10 000的比例稀釋二抗,室溫孵育60 min后用1× TBST清洗4次。加入等比例顯色液A和B,利用Image Quant LAS 4000 mini (Cytiva美國) 在化學(xué)發(fā)光下采集圖像。

    1.2.8數(shù)據(jù)處理 采用Microsoft Office 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同發(fā)根農(nóng)桿菌毛狀根誘導(dǎo)效率的比較

    發(fā)根農(nóng)桿菌K599在侵染細(xì)莖柱花草子葉后,無法誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根(圖2)。發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1和Arqua1的誘導(dǎo)效率均低于60%,而MSU440的誘導(dǎo)效率高于80%。因此,發(fā)根農(nóng)桿菌MSU440是誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根的最佳菌株,本研究選取該菌株進(jìn)行后續(xù)試驗。

    2.2 不同侵染條件對細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化率的影響

    在毛狀根誘導(dǎo)20天后,將外植體在綠色熒光蛋白激發(fā)光源下觀察發(fā)光情況并記錄。圖3所示,新生的毛狀根在激發(fā)光下觀察到綠色熒光,證明外源基因成功轉(zhuǎn)入。對正交試驗結(jié)果(表1)進(jìn)行分析可知,在試驗處理水平的選擇范圍內(nèi),菌液濃度對于轉(zhuǎn)化效率的影響最大,極差為17.63,其次為共培養(yǎng)時間,而農(nóng)桿菌侵染時間對于轉(zhuǎn)化效率的影響最小。最優(yōu)組合菌液濃度為0.3,侵染15 min,共培養(yǎng)4 d,轉(zhuǎn)化效率最高為34.72%。

    圖2 不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株毛狀根誘導(dǎo)效率的比較Fig.2 Induction efficiency of the hairy roots of Stylosanthes gracilis by different Agrobacterium rhizogenes strains注:圖中不同字母表示不同菌株間差異顯著(P<0.05)Note:Different letters indicate significant differences among different strains (P<0.05)

    圖3 毛狀根熒光檢測Fig.3 The hairy root detected by fluorescence注:A,明場下的轉(zhuǎn)基因毛狀根;B,轉(zhuǎn)基因毛狀根熒光檢測;C,明場下的未轉(zhuǎn)基因根;D,未轉(zhuǎn)基因根熒光檢測Note:Panel A displays the transgenic hairy root under natural light;Panel B the transgenic hairy roots detected by fluorescence;Panel C the non-transgenic root under natural light;Panel D the non-transgenic hairy roots detected by fluorescence

    表1 不同侵染條件對毛狀根轉(zhuǎn)化效率的影響Table 1 Effects of different infection conditions on transformation efficiency of hairy roots

    2.3 轉(zhuǎn)基因毛狀根的鑒定

    為進(jìn)一步驗證發(fā)根農(nóng)桿菌的相關(guān)基因以及植物表達(dá)載體pEGAD是否成功整合到細(xì)莖柱花草毛狀根的基因組,以5個發(fā)綠色熒光毛狀根的基因組DNA為模板利用PCR技術(shù)檢測GFP,Bar,rolB,UBCE1基因,以野生型柱花草根系基因組和ddH2O作為陰性對照模板,以轉(zhuǎn)入pEGAD質(zhì)粒的MSU440菌液作為陽性對照模板。圖4A可知,ddH2O和陽性對照未擴(kuò)增出UBCE1片段,而在6個柱花草根系樣品中均擴(kuò)增出UBCE1條帶且大小一致,表明樣品可靠。5個轉(zhuǎn)基因毛狀根中均擴(kuò)增出Bar,rolB,GFP條帶且與陽性對照條帶大小一致,陰性對照未擴(kuò)增出條帶,表明Bar,rolB,GFP均成功整合到細(xì)莖柱花草毛狀根基因組中。此外,利用Western blot對這5個轉(zhuǎn)基因毛狀根中GFP的表達(dá)進(jìn)行蛋白水平的鑒定,用野生型柱花草根系作為陰性對照。圖4B可知,5個轉(zhuǎn)基因毛狀根樣品均有明顯條帶條帶大小正確,且陰性對照未出現(xiàn)條帶,表明GFP在柱花草毛狀根中正常表達(dá)。

    圖4 轉(zhuǎn)化毛狀根的分子檢測Fig.4 Molecular detection of transformed hairy roots注:A,轉(zhuǎn)化毛狀根PCR檢測;WT,野生型柱花草根系;d,ddH2O;P,轉(zhuǎn)入pEGAD質(zhì)粒的MSU440菌液,T1~T5,轉(zhuǎn)GFP基因毛狀根株系;M,Maker B:轉(zhuǎn)化毛狀根Western Blot檢測;WT:野生型柱花草根系;T1~T5:轉(zhuǎn)GFP基因毛狀根株系;M:MakerNote:Panel A displays the PCR detection of hairy roots. WT stands for the negative controls;d ddH2O;P the positive controls;T1~T5 the transgenic hairy roots;M:Maker. The same as below. Panel B displays the Western Blot detection of hairy roots

    3 討論

    在發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化體系中,毛狀根的誘導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)化效率受到菌株類型、菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間等多種因素的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根時,不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生毛狀根的效率存在顯著差異。菌株K599無法誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根,這與在白花草木樨[12]、小扁豆[13]、白羽扇豆[14]等豆科植物中的研究結(jié)果存在差異,這可能與物種之間的差異有關(guān)。ArQua1,MSU440,C58C1這3種均能誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草產(chǎn)生毛狀根,其中MSU440菌株的誘導(dǎo)能力顯著高于其它兩個菌株,且毛狀根生長狀態(tài)良好,因此,MSU440是最適用于細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系建立的菌株。羅萍等[15]發(fā)現(xiàn)MSU440菌株對尾巨桉的毛狀根誘導(dǎo)率高達(dá)80.1%,這與本試驗研究結(jié)果一致。侵染所用的菌液濃度、侵染時間、共培養(yǎng)時間也是影響毛狀根的轉(zhuǎn)化效率的重要因素。本研究結(jié)果表明,菌液OD600為0.3、侵染時間為15 min以及共培養(yǎng)4 d時毛狀根轉(zhuǎn)化效率最高,是發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)細(xì)莖柱花草子葉產(chǎn)生毛狀根時最佳侵染條件(表1)。過高的菌液濃度和較長的侵染時間都會降低毛狀根的轉(zhuǎn)化效率,這可能是發(fā)根農(nóng)桿菌大量附著在細(xì)莖柱花草子葉表面,后期共培養(yǎng)階段菌大量繁殖,導(dǎo)致子葉褐化死亡,無法誘導(dǎo)產(chǎn)生較多毛狀根。

    確定合適的篩選壓是成功獲得植物轉(zhuǎn)基因材料的關(guān)鍵步驟,對轉(zhuǎn)化效率有極大影響。本試驗參照本課題組前期實驗結(jié)果,選擇0.6 mg·L-1Basta?進(jìn)行篩選,獲得了34.72%的轉(zhuǎn)化效率,轉(zhuǎn)化效率仍待進(jìn)一步提高[9]。周玲燕等[16]研究發(fā)現(xiàn)在水稻的轉(zhuǎn)基因過程中使用潮霉素作為篩選劑優(yōu)于Basta,具有較少的假陽性,能顯著提高陽性率。韓秀麗等[17]在大麥的遺傳轉(zhuǎn)化研究中也發(fā)現(xiàn)潮霉素較草丁膦更適于作為篩選劑。因此,為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率,減少假陽性,后續(xù)研究可使用不同的篩選劑,確定最適的篩選壓。

    目前,發(fā)根農(nóng)桿菌因其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根分化程度高、遺傳性狀穩(wěn)定以及操作簡易等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于蛋白定位、蛋白互作等,Meng等[18]采用雙分子熒光互補(bǔ)實驗在木豆(Cajanuscajan)毛狀根中驗證了CBLs與CIPKs相互作用;程媛媛等[19]在大豆中利用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆毛狀根技術(shù)成功進(jìn)行了CRISPR/Cas9基因編輯、亞細(xì)胞定位及蛋白-蛋白互作分析,且發(fā)現(xiàn)互作的兩種蛋白在煙草葉片細(xì)胞和大豆毛狀根中的表達(dá)量存在差異,表明毛狀根可能更利于準(zhǔn)確預(yù)測基因的功能。此外,發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的離體毛狀根也是叢枝菌根真菌雙重培養(yǎng)的理想宿主材料,對于研究AM真菌于植物根系的共生及相關(guān)分子機(jī)制有極大的輔助作用怕[20];同時,離體毛狀根在無激素的液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng),一個月可增殖數(shù)千倍,因此,可作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物[21],在藥用植物有效成分工業(yè)化生產(chǎn)具有廣泛的應(yīng)用前景。本試驗后續(xù)將探索細(xì)莖柱花草毛狀根的離體培養(yǎng)體系,助力代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。

    4 結(jié)論

    本研究以細(xì)莖柱花草為材料,采用子葉節(jié)侵染法建立了一種細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系。通過比較毛狀根誘導(dǎo)率篩選出最適于細(xì)莖柱花草毛狀根誘導(dǎo)的菌株MSU440,并確定了其侵染細(xì)莖柱花草的最佳條件,成功獲得了表達(dá)GFP蛋白的毛狀根,轉(zhuǎn)化效率為34.72%。細(xì)莖柱花草毛狀根轉(zhuǎn)化體系的建立為柱花草屬物種的基因功能研究提供了強(qiáng)有力的手段,為以后柱花草的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

    猜你喜歡
    柱花草毛狀子葉
    懸鈴木幼苗的初生維管系統(tǒng)演化結(jié)構(gòu)研究
    黑山羊胎盤子葉性狀結(jié)構(gòu)與繁殖性能的相關(guān)性
    基于SSR標(biāo)記的柱花草種質(zhì)資源遺傳多樣性與群體結(jié)構(gòu)分析
    低溫脅迫對細(xì)莖柱花草與TPRC2001-1柱花草抗寒生理指標(biāo)的影響
    金鐵鎖多倍體毛狀根的誘導(dǎo)及性質(zhì)
    4種柱花草種子發(fā)育研究
    種子(2016年1期)2016-01-15 05:26:17
    投籃高手
    柱花草種間親緣關(guān)系SSR分析
    6-芐氨基腺嘌呤和萘乙酸對三裂葉野葛毛狀根生長和異黃酮含量的影響
    不同因子對藥用植物毛狀根產(chǎn)量和次生代謝產(chǎn)物積累影響的研究進(jìn)展△
    亚洲精品在线观看二区| 免费看日本二区| 在现免费观看毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 极品教师在线视频| 观看免费一级毛片| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品电影一区二区三区| 97热精品久久久久久| 精品免费久久久久久久清纯| 国产高清视频在线观看网站| 精品久久国产蜜桃| 亚洲18禁久久av| 天堂动漫精品| 亚洲内射少妇av| 色哟哟·www| 久久久久久大精品| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久草成人影院| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 99热6这里只有精品| 欧美潮喷喷水| 男女啪啪激烈高潮av片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲最大成人手机在线| 午夜久久久久精精品| 国语自产精品视频在线第100页| eeuss影院久久| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲不卡免费看| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产男靠女视频免费网站| a级毛片免费高清观看在线播放| 最近在线观看免费完整版| 最近最新中文字幕大全电影3| 麻豆成人av在线观看| 久久亚洲精品不卡| 免费搜索国产男女视频| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 日本色播在线视频| 日本爱情动作片www.在线观看 | 伦精品一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 偷拍熟女少妇极品色| 国产中年淑女户外野战色| 国产伦精品一区二区三区四那| 1000部很黄的大片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 禁无遮挡网站| 波多野结衣巨乳人妻| 国产乱人视频| 免费观看人在逋| 色视频www国产| 欧美日韩国产亚洲二区| 成人三级黄色视频| 亚洲av熟女| 国产av一区在线观看免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产极品精品免费视频能看的| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 国产美女午夜福利| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲最大成人av| 午夜激情欧美在线| 18+在线观看网站| 日本五十路高清| 深爱激情五月婷婷| 啦啦啦啦在线视频资源| 中文资源天堂在线| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 亚洲欧美日韩无卡精品| 久久久久久久久大av| 国产av不卡久久| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 嫁个100分男人电影在线观看| 很黄的视频免费| 色视频www国产| 国产在视频线在精品| 窝窝影院91人妻| 国产亚洲精品av在线| 99久久九九国产精品国产免费| 日本-黄色视频高清免费观看| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品,欧美在线| 免费观看的影片在线观看| 国内精品久久久久精免费| 91久久精品电影网| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 欧美在线一区亚洲| 韩国av在线不卡| 成人美女网站在线观看视频| 99久久无色码亚洲精品果冻| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 动漫黄色视频在线观看| 有码 亚洲区| 在线免费观看不下载黄p国产 | 国产高清有码在线观看视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 此物有八面人人有两片| 九色国产91popny在线| 国产精品一区二区性色av| 亚洲国产欧美人成| 日本黄色片子视频| 伦理电影大哥的女人| 久久99热这里只有精品18| 桃红色精品国产亚洲av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 永久网站在线| 国产91精品成人一区二区三区| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 午夜老司机福利剧场| 美女 人体艺术 gogo| 成人亚洲精品av一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲,欧美,日韩| 黄色日韩在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99在线人妻在线中文字幕| 免费观看人在逋| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 小说图片视频综合网站| 午夜福利欧美成人| 在线观看午夜福利视频| 可以在线观看毛片的网站| 久久久午夜欧美精品| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲男人的天堂狠狠| 女同久久另类99精品国产91| 色综合站精品国产| 国产v大片淫在线免费观看| 在线观看66精品国产| 久久人人爽人人爽人人片va| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 熟女人妻精品中文字幕| 伦精品一区二区三区| 国产精品av视频在线免费观看| 男人的好看免费观看在线视频| 日日夜夜操网爽| 国产精品福利在线免费观看| www.www免费av| 99热精品在线国产| 国产av在哪里看| 日本免费a在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 网址你懂的国产日韩在线| 日韩欧美三级三区| 99在线视频只有这里精品首页| 91在线观看av| 国产精品免费一区二区三区在线| 51国产日韩欧美| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| x7x7x7水蜜桃| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 中出人妻视频一区二区| 亚洲中文字幕日韩| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美高清性xxxxhd video| 不卡一级毛片| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美区成人在线视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 欧美国产日韩亚洲一区| 日韩一本色道免费dvd| 69人妻影院| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 一进一出抽搐gif免费好疼| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 直男gayav资源| 我的老师免费观看完整版| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| av在线老鸭窝| 搡老岳熟女国产| 男人的好看免费观看在线视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 日韩欧美三级三区| 桃色一区二区三区在线观看| 色哟哟哟哟哟哟| 欧美日韩乱码在线| 国产成人a区在线观看| 国产精品福利在线免费观看| a在线观看视频网站| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产精品合色在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产中年淑女户外野战色| 国语自产精品视频在线第100页| 有码 亚洲区| 99热这里只有精品一区| 精品人妻偷拍中文字幕| 色播亚洲综合网| 国产激情偷乱视频一区二区| 一进一出好大好爽视频| 国产成人aa在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲美女搞黄在线观看 | 久久精品综合一区二区三区| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲精品在线观看二区| 男人的好看免费观看在线视频| 中文资源天堂在线| 日韩欧美三级三区| 精品日产1卡2卡| 国产精品综合久久久久久久免费| 夜夜爽天天搞| 欧美激情国产日韩精品一区| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 精品久久久久久成人av| 神马国产精品三级电影在线观看| 最近在线观看免费完整版| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 色吧在线观看| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲男人的天堂狠狠| 免费看av在线观看网站| 尾随美女入室| 国产三级中文精品| 黄色视频,在线免费观看| 午夜激情福利司机影院| 人人妻人人看人人澡| 2021天堂中文幕一二区在线观| 成人午夜高清在线视频| 内地一区二区视频在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 黄色日韩在线| 99在线人妻在线中文字幕| 免费看av在线观看网站| av福利片在线观看| 精品久久国产蜜桃| 国产精品伦人一区二区| 伊人久久精品亚洲午夜| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲七黄色美女视频| 精品久久久噜噜| 午夜免费成人在线视频| 亚洲七黄色美女视频| 内地一区二区视频在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 久久中文看片网| 美女cb高潮喷水在线观看| 赤兔流量卡办理| 99国产极品粉嫩在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 欧美极品一区二区三区四区| 国产乱人伦免费视频| 国产高清视频在线观看网站| 国内精品久久久久久久电影| 一个人看视频在线观看www免费| 午夜福利18| 男插女下体视频免费在线播放| 成人美女网站在线观看视频| 午夜影院日韩av| 性色avwww在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 男人舔奶头视频| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲在线自拍视频| 大型黄色视频在线免费观看| 一个人免费在线观看电影| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品久久久久久久久久免费视频| 动漫黄色视频在线观看| 长腿黑丝高跟| 无人区码免费观看不卡| 在线播放无遮挡| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚州av有码| 好男人在线观看高清免费视频| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 少妇人妻精品综合一区二区 | 久久这里只有精品中国| 毛片女人毛片| 中文字幕久久专区| 国产精品综合久久久久久久免费| 成年女人永久免费观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久久久久中文| 嫩草影视91久久| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲经典国产精华液单| 日韩欧美三级三区| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 午夜日韩欧美国产| 在线观看一区二区三区| 男插女下体视频免费在线播放| 欧美潮喷喷水| 少妇被粗大猛烈的视频| 春色校园在线视频观看| 美女被艹到高潮喷水动态| 亚洲精品成人久久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 午夜视频国产福利| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 色综合婷婷激情| 深夜a级毛片| 毛片一级片免费看久久久久 | 亚洲色图av天堂| 亚洲av美国av| 亚洲国产色片| 欧美人与善性xxx| 深夜精品福利| 给我免费播放毛片高清在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 熟女电影av网| 久久精品综合一区二区三区| 极品教师在线视频| 国产熟女欧美一区二区| 麻豆国产97在线/欧美| 99热6这里只有精品| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日日撸夜夜添| 简卡轻食公司| 亚洲经典国产精华液单| 亚洲精品影视一区二区三区av| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 91久久精品国产一区二区成人| 最近视频中文字幕2019在线8| 91麻豆精品激情在线观看国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 午夜视频国产福利| 国产不卡一卡二| 能在线免费观看的黄片| 国内精品一区二区在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 成人亚洲精品av一区二区| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 国产欧美日韩精品一区二区| 精品人妻1区二区| 久久6这里有精品| 久久人人精品亚洲av| 国产亚洲91精品色在线| 一级av片app| 日本-黄色视频高清免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产精品女同一区二区软件 | 草草在线视频免费看| 校园人妻丝袜中文字幕| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品综合久久久久久久免费| 最近视频中文字幕2019在线8| 直男gayav资源| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲国产精品成人综合色| 精品一区二区三区av网在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲在线观看片| 免费看a级黄色片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 99久久精品一区二区三区| 2021天堂中文幕一二区在线观| 有码 亚洲区| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品一及| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 亚州av有码| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 欧美日本视频| 最近中文字幕高清免费大全6 | 久久久精品欧美日韩精品| 在线播放无遮挡| 欧美一区二区亚洲| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 两个人视频免费观看高清| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 亚洲av熟女| 精品福利观看| 国产成人影院久久av| 动漫黄色视频在线观看| 乱系列少妇在线播放| 午夜福利高清视频| 桃色一区二区三区在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 又爽又黄a免费视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| av在线老鸭窝| 欧美一区二区国产精品久久精品| 人人妻人人看人人澡| 听说在线观看完整版免费高清| 久久久久久久久久成人| 久久亚洲真实| 999久久久精品免费观看国产| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美3d第一页| 国产精品av视频在线免费观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产高清视频在线观看网站| 午夜日韩欧美国产| 最近中文字幕高清免费大全6 | 日韩欧美免费精品| 成年版毛片免费区| 国内精品宾馆在线| 波多野结衣高清无吗| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 久久久久久久久大av| 久久久精品大字幕| 露出奶头的视频| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲第一区二区三区不卡| 在线免费十八禁| 男人舔奶头视频| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| eeuss影院久久| 精品久久久久久久久久久久久| 97超视频在线观看视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 校园人妻丝袜中文字幕| 小说图片视频综合网站| 人妻少妇偷人精品九色| 精品人妻视频免费看| 欧美极品一区二区三区四区| 毛片一级片免费看久久久久 | 久久精品综合一区二区三区| 老司机深夜福利视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 女同久久另类99精品国产91| 久99久视频精品免费| 2021天堂中文幕一二区在线观| 老司机福利观看| 我的女老师完整版在线观看| 看片在线看免费视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 精品福利观看| 国产淫片久久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美极品一区二区三区四区| 国产成年人精品一区二区| 国产av麻豆久久久久久久| 18禁在线播放成人免费| av福利片在线观看| 精品人妻熟女av久视频| 少妇人妻一区二区三区视频| 高清在线国产一区| 国产精品日韩av在线免费观看| 特级一级黄色大片| 一本久久中文字幕| 久久久午夜欧美精品| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲18禁久久av| 国产亚洲精品av在线| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 麻豆国产av国片精品| 免费看a级黄色片| 国产久久久一区二区三区| 亚洲av成人av| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 最近中文字幕高清免费大全6 | 色播亚洲综合网| 国产极品精品免费视频能看的| 在线免费观看不下载黄p国产 | 中文字幕久久专区| 午夜亚洲福利在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 在线看三级毛片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 老司机深夜福利视频在线观看| 国模一区二区三区四区视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 久久精品影院6| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产精品女同一区二区软件 | 国产黄色小视频在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产精品人妻久久久影院| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 欧美区成人在线视频| 日韩av在线大香蕉| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲av不卡在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 国产精品一区二区免费欧美| 麻豆国产97在线/欧美| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 久久精品国产99精品国产亚洲性色| eeuss影院久久| 日韩亚洲欧美综合| 国产高潮美女av| 99热6这里只有精品| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 成人国产一区最新在线观看| 久久九九热精品免费| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美性猛交黑人性爽| 久久久久免费精品人妻一区二区| 日本a在线网址| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 丝袜美腿在线中文| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成年女人永久免费观看视频| 色av中文字幕| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产三级在线视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久精品人妻少妇| 啦啦啦啦在线视频资源| 黄片wwwwww| 99久久成人亚洲精品观看| 久久久久久久久久黄片| 联通29元200g的流量卡| 亚洲性夜色夜夜综合| 99久久九九国产精品国产免费| 色精品久久人妻99蜜桃| 国产精品一区二区性色av| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲欧美日韩无卡精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产精品,欧美在线| 看片在线看免费视频| 免费看美女性在线毛片视频| 少妇高潮的动态图| www.www免费av| 身体一侧抽搐| 一级黄片播放器| 男女下面进入的视频免费午夜| 观看免费一级毛片| 色哟哟·www| 内射极品少妇av片p| 色精品久久人妻99蜜桃| 日本黄大片高清| 国产日本99.免费观看| 一a级毛片在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 九色成人免费人妻av| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲国产精品合色在线| 国产精品久久久久久av不卡| 欧美区成人在线视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产精品福利在线免费观看| 91精品国产九色| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲人成网站高清观看| 露出奶头的视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 一本久久中文字幕| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产视频内射| 国产伦精品一区二区三区视频9| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品99久久久久久久久| 亚洲五月天丁香| ponron亚洲| 性欧美人与动物交配| 亚洲综合色惰| 联通29元200g的流量卡| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产毛片a区久久久久| 毛片女人毛片| 最好的美女福利视频网| 内地一区二区视频在线| 国产精品,欧美在线| 国产在线男女| 欧美激情在线99| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精华霜和精华液先用哪个| 日韩欧美国产在线观看| 哪里可以看免费的av片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 欧美精品啪啪一区二区三区| 午夜老司机福利剧场| 国内精品美女久久久久久| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av一区综合| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产中年淑女户外野战色| 99久久精品热视频| 麻豆一二三区av精品| 亚洲黑人精品在线| 免费在线观看影片大全网站| 中出人妻视频一区二区| 国产精品人妻久久久影院| 欧美人与善性xxx| 桃红色精品国产亚洲av| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 五月玫瑰六月丁香| 欧美激情国产日韩精品一区|