面向3D打印多孔陶瓷材料外科植入物宏微觀結(jié)構(gòu)特征的分析評價方法

張晨，董雙鵬，張述，馬會，董恩純，康建峰，李滌塵，王玲

1.國家食品藥品監(jiān)督管理局天津醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，天津 300384；2.無源植入器械質(zhì)量評價重點實驗室，天津300384；3.西安交通大學機械制造系統(tǒng)工程國家重點實驗室，陜西 西安 710049；4.國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)用增材制造器械研究與評價重點實驗室，陜西 西安 710054

引言

3D打印技術(shù)又稱增材制造技術(shù)，是一種通過簡單的二維逐層累加材料的方式直接成型三維復雜結(jié)構(gòu)的數(shù)字制造技術(shù)[1]，其可實現(xiàn)內(nèi)部復雜結(jié)構(gòu)、外部幾何形狀的自由制造，因此廣泛應用于醫(yī)療領(lǐng)域[2-4]。3D打印陶瓷技術(shù)主要包括光固化成形、三維印刷、選擇性激光燒結(jié)、分層實體制造和擠出成形等打印工藝[5-6]?？晒┐蛴〉尼t(yī)用生物陶瓷材料，根據(jù)生理環(huán)境中所發(fā)生的生物化學反應可分為生物惰性陶瓷（如氧化鋁、氧化鋯、氧化鈦、氧化硅等，特點為耐腐蝕、耐磨損、不降解，適用于制備義齒、人工關(guān)節(jié)等，圖1a）[7]、生物活性陶瓷（如羥基磷灰石陶瓷，對骨細胞生長有一定的引導誘發(fā)作用，能促進缺損骨組織的修復，圖1b）[8]、生物降解陶瓷（如β-磷酸三鈣，在體內(nèi)溶解度較大，溶解產(chǎn)物進入體液，隨血液循環(huán)參與機體的新陳代謝，在種植體部位重新產(chǎn)生新的組織，可用于骨填充塊或人工關(guān)節(jié)涂層，圖1c）[9]。

圖1 3D打印陶瓷材料外科植入物[7-9]

3D打印用的陶瓷粉末是陶瓷粉末和某一種粘結(jié)劑粉末所組成的混合物[10]。由于粘結(jié)劑粉末的熔點較低，激光燒結(jié)時只是將粘結(jié)劑粉末熔化而使陶瓷粉末粘結(jié)在一起。在激光燒結(jié)之后，需要將陶瓷制品放入到溫控爐中，在較高的溫度下進行后處理，其制備的樣品特征為既呈現(xiàn)孔徑＞10 μm的宏孔如圖2a中黃色大圈所示，內(nèi)連接如圖2a中紅色小圈所示，又存在孔徑≤10 μm的微孔如圖2b中紅圈內(nèi)所示。這與3D打印金屬材料的多孔特征均為宏孔存在顯著不同（圖3）[11]，因此，針對多孔生物陶瓷支架需從宏觀和微觀2個方面進行特征分析。

圖2 3D打印多孔陶瓷的宏孔、內(nèi)連接（a）和微孔（b）

圖3 3D打印金屬多孔樣件與CT掃描圖像[11]

在3D打印陶瓷材料的外科植入物中，以羥基磷灰石和β-磷酸三鈣陶瓷材料的使用最廣泛[12]，該材料的骨替代物是目前公認的自體骨和同種異體骨移植替代品[13-15]，其主要優(yōu)點如下：① β-磷酸三鈣為合成材料，可以避免傳染性疾病感染患者；② 該材料在骨植入部位顯示出骨傳導作用，可促使材料表面愈合，且生物相容性較好[16]；③ β-磷酸三鈣骨替代物的愈合過程與其多孔結(jié)構(gòu)相關(guān)，足夠大的孔和內(nèi)部連接可以使新骨長入整個植入物，且孔隙率也會影響陶瓷的吸收水平，微孔量越多，溶解率越高[17-18]。有研究表明，多孔結(jié)構(gòu)對于骨替代物的有效性有重要影響[18]，當孔徑在300～600 μm時，利于細胞長入和血供，并最終形成礦化骨[19]。陶瓷的微結(jié)構(gòu)還會對力學性能產(chǎn)生影響：當內(nèi)連接徑不變、孔徑增大時，孔隙率下降，力學性能增強；孔徑不變時、內(nèi)連接徑增大，孔隙率變大，力學性能下降。因此，針對多孔3D打印陶瓷件的孔隙結(jié)構(gòu)特征進行分析是器械臨床前性能評價的必要步驟。

根據(jù)食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布的《鈣磷/硅類骨填充材料等3項注冊技術(shù)審查指導原則》[20]中對3D打印多孔陶瓷的多孔特征進行分析的要求為：對于多孔結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品或者固化后為多孔結(jié)構(gòu)的產(chǎn)品，描述產(chǎn)品內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)幾何特征，包括總孔隙率、開孔孔隙率和/或孔連通率、平均孔徑、孔徑分布等。但指導原則中未提及相應的測試方法。在2018年1月1日實施的YY/T 1558.3-2017《外科植入物 磷酸鈣 第3部分：羥基磷灰石和β-磷酸三鈣骨替代物》[21]標準中明確了多孔結(jié)構(gòu)形貌技術(shù)指標為總孔隙率、微孔、宏孔和內(nèi)連接徑?；诖?，本文旨在針對多孔結(jié)構(gòu)的宏微觀技術(shù)指標提出相應的測定方法、檢測難點及最終解決方案。

1 材料與方法

1.1 測試樣品

3D打印β-磷酸三鈣陶瓷材料骨替代物樣品如圖4所示，規(guī)格為直徑10 mm×高度5 mm。

圖4 3D打印β-磷酸三鈣陶瓷材料骨替代物樣品注：a.樣品放大細節(jié)圖；b.微孔測試用包埋試樣。

1.2 測試設備

使用微米X射線CT（Micro-CT，Y.Cheetah，德國）對多孔樣件進行掃描，掃描時使用錐形束螺旋式掃描方式，掃描電壓為90 kV，掃描層厚為0.011 mm。完成掃描后輸出Dicom數(shù)據(jù)以開展相關(guān)數(shù)據(jù)分析。樣件微孔孔徑檢測設備為場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SU-8010，日本）。

CT掃描參考GB/T 36984-2018《外科植入物用多孔金屬材料X射線CT檢測方法》[22]，但該標準僅界定了相關(guān)結(jié)構(gòu)特征參數(shù)的含義，具體實施方法尚不明確。為此，還需基于多孔樣件掃描圖像數(shù)據(jù)，結(jié)合統(tǒng)計學方法基本原理，建立測試參數(shù)及相關(guān)數(shù)據(jù)處理方法。

1.3 測試方法

通過對YY/T 1558.3-2017[21]中總孔隙率、宏孔、微孔和內(nèi)連接徑的測試方法進行分析后，本文將各種方法的檢測難點和解決方案進行歸納和總結(jié)（表1）[23-24]，通過表1對比發(fā)現(xiàn)，使用Micro-CT可以對樣件直接進行無損檢測，并且可以觀察樣件三維特征，對掃描數(shù)據(jù)處理可以同時得到孔隙率、宏孔孔徑與內(nèi)連接參數(shù)，因此對以上參數(shù)特征選取該方法進行檢測。而對于微孔孔徑特征，選擇使用掃描電鏡進行觀測。

表1 依據(jù)YY/T 1558.3-2017的陶瓷多孔結(jié)構(gòu)的測試方法[23-24]

2 測試步驟

為消除樣件擺放位置和邊緣陰影對分析結(jié)果的影響，將掃描后的多孔樣件在中間截取直徑8 mm×高度3 mm的圓柱體?；趻呙钄?shù)據(jù)對多孔結(jié)構(gòu)特征進行檢測，測試數(shù)據(jù)如下。

2.1 總孔隙率

包括單張圖像孔隙率，所有圖像的平均孔隙率、三維孔隙率。在軟件Mimics 16.0中設定材料的灰度閾值提取實體材料，并輸出沿圓柱軸向所有圖像的實體面積，計算出每張圖像的孔隙率。在軟件VG Studio MAX 3.0中設定材料的灰度閾值提取實體材料，使用雜物分析功能計算樣件的三維孔隙率。

2.2 微孔孔徑

使用掃描電子顯微鏡對樣件微孔孔徑進行測量，測量時隨機選取一個視場，調(diào)整合適放大倍數(shù)，測量其中孔徑小于10 μm的5個孔的橫向和縱向數(shù)值，獲得微孔孔徑的測量值。

2.3 宏孔孔徑

采用內(nèi)切圓方法進行宏孔孔徑分析，在垂直于圓柱軸線方向等距選擇5個截面，然后在每個截面內(nèi)選擇四周和中心5個樣本點進行取樣，取樣時避免選取周邊位置，減少樣件擺放位置與邊緣陰影影響（圖5）。

圖5 多孔樣件宏孔孔徑采樣點位置分布

2.4 內(nèi)連接

2.4.1 內(nèi)連接徑

內(nèi)連接徑為相鄰多孔結(jié)構(gòu)連接部位的尺寸，反映了多孔結(jié)構(gòu)之間的相互連通情況。按照上述宏孔孔徑的采樣方式分別對多孔樣件孔內(nèi)連接徑進行測量，測量示意圖如圖6所示。

圖6 孔內(nèi)連接徑測量示意圖

2.4.2 連通性

使用Mimics 16.0軟件中孔分析功能，對多孔樣件的連通性進行分析。

2.5 開/閉孔率

開/閉孔率在YY/T 1558.3-2017[21]中未涉及，使用VG Studio MAX 3.0軟件中雜物分析功能對樣件的開/閉孔體積進行分析，樣件開孔率計算方式如公式（1）所示，樣件閉孔計算率如公式（2）所示。

式中，P開為開孔率，V開為開孔區(qū)域體積，V總為樣本總體積。

式中，P閉為閉孔率，V閉為閉孔區(qū)域體積，V總為樣本總體積。

3 結(jié)果

3.1 孔隙率

3.1.1 單張圖像的孔隙率

單張圖像的孔隙率及孔隙率頻數(shù)統(tǒng)計如圖7所示，樣件軸向方向孔隙率變化范圍為0.564～0.612。

圖7 軸向方向所有片子孔隙率的分布（a）和頻數(shù)（b）

3.1.2 所有掃描圖像平均孔隙率及孔隙分布均勻性

對樣件軸向方向圖像孔隙率進行統(tǒng)計分析，共計279張片子的孔隙率為58.5%±1.9%。

3.1.3 三維孔隙率

在軟件VG Studio MAX 3.0中通過閾值劃分，區(qū)分圖像中的空氣與實體部分的邊界，對該區(qū)域進行三維重建，重建效果如圖8所示，灰色區(qū)域為多孔實體部分，其余為空隙。通過軟件中的空隙/雜物分析功能計算得到多孔樣件的三維孔隙率為64.55%（圖9）。

圖8 多孔樣件三維重建示意圖

圖9 多孔樣件孔隙率計算結(jié)果

為驗證該方法，通過對稱重數(shù)據(jù)處理所得的孔隙率實測值為64.90%。2種方法計算結(jié)果的相對誤差為0.35%。

3.2 微孔孔徑

多孔樣件微孔觀測圖像如圖10所示，取樣位置為左圖樣品上紅框處，右圖為放大4000倍下的掃描電鏡圖，紅圈處為隨機選取的5個微孔1#～5#，微孔孔徑的采集數(shù)據(jù)結(jié)果如表2所示，經(jīng)計算，微孔孔徑均值為（1.827±0.969）μm。

表2 多孔樣件微孔孔徑測量結(jié)果（μm）

圖10 微孔觀測圖像

3.3 宏孔孔徑

按照圖5選擇宏孔孔徑的測量位置，測量數(shù)據(jù)共計25個，內(nèi)切圓宏孔孔徑的采集數(shù)據(jù)結(jié)果如表3所示，經(jīng)計算，內(nèi)切圓宏孔孔徑均值為（0.358±0.172）mm。宏孔孔徑分布如圖11所示，統(tǒng)計圖中統(tǒng)計了25個數(shù)據(jù)的分布情況，其中，孔徑尺寸主要集中在0.1～0.5 mm之間。

圖11 宏孔孔徑分布示意圖

表3 多孔樣件各平面的內(nèi)切圓宏孔孔徑測量結(jié)果（mm）

3.4 內(nèi)連接

3.4.1 內(nèi)連接徑

按照圖5選擇內(nèi)連接徑的測量位置，測量數(shù)據(jù)共計25個，不同平面孔內(nèi)連接徑的采集數(shù)據(jù)結(jié)果如表4所示，經(jīng)計算，孔內(nèi)連接徑均值為（0.137±0.090）mm?？變?nèi)連接徑分布如圖12所示，統(tǒng)計圖中統(tǒng)計了25個數(shù)據(jù)的分布情況，其中，內(nèi)連接徑尺寸主要集中在0.05～0.20 mm 之間。

圖12 內(nèi)連接徑分布示意圖

表4 多孔樣件各平面孔內(nèi)連接徑測量結(jié)果（mm）

3.4.2 連通性

采用Mimics 16.0軟件中孔分析功能計算多孔樣件連通率為99.38%。

3.5 開/閉孔率

采用VG Studio MAX 3.0軟件中雜物分析功能得到樣件閉孔分布如圖13所示。計算多孔樣件開孔率為64.40%，閉孔率為0.15%。

圖13 樣件開/閉孔分布

4 討論

3D打印外科植入物多孔結(jié)構(gòu)幾何特征參數(shù)對其在體內(nèi)的服役性能的影響至關(guān)重要，在充分調(diào)研國際及國內(nèi)相關(guān)測試方法后，發(fā)現(xiàn)相關(guān)標準雖然提到了測試方法，但僅說明了可能采用的相關(guān)測試設備，并無明確的測試步驟，同時對每種測試設備的測試難點及是否可行沒有明確的結(jié)論，且目前國內(nèi)鮮見具體測試方法的研究?；诖?，本文開展了多孔結(jié)構(gòu)的孔隙率、微孔孔徑、宏孔孔徑、連通性測試方法的研究，測試方法參考了YY/T 1558.3-2017[21]和GB/T 36984-2018[22]。通過對測試方法中檢測難點的剖析，形成了一套多孔結(jié)構(gòu)形貌的具體量化測試方法，且該方法具有科學性和可操作性，可適用于大部分多孔結(jié)構(gòu)樣件。

在孔隙率的測試方法上，本文還對Micro-CT掃描數(shù)據(jù)分析得到的三維孔隙率和稱重法實測測量值進行比較，結(jié)果顯示，三維孔隙率和稱重法所得孔隙率分別為64.55%和64.90%，2種方法計算結(jié)果的相對誤差為0.35%，表明通過三維分析能有效反映多孔結(jié)構(gòu)孔隙率。相比以上2種測試方法，Micro-CT掃描數(shù)據(jù)分析法無需分別提供實體和多孔樣塊，且無需考慮樣品干燥程度、空氣濕度等因素的影響，更為便捷有效。

同時對YY/T 1558.3-2017[21]中未涉及的開/閉孔率進行了測試方法研究。開/閉孔率作為多孔結(jié)構(gòu)的重要評價指標之一，食品藥品監(jiān)管總局發(fā)布的《總局關(guān)于發(fā)布鈣磷/硅類骨填充材料等3項注冊技術(shù)審查指導原則》[20]中也提及了該內(nèi)容，因閉孔對于骨長入是無效的，則該項目可作為多孔結(jié)構(gòu)性能評價的研究內(nèi)容之一，利于幫助制造商更好地提高制造水平。

3D打印陶瓷樣件在高溫脫脂燒結(jié)過程，表面會形成微米級的多孔結(jié)構(gòu)，Micro-CT目前可以最小分辨亞微米級的結(jié)構(gòu)，但受分辨率限制，需要嚴格限制送檢樣件的宏觀尺寸以達到良好的觀測效果，如期望最小觀察1 μm左右的微孔結(jié)構(gòu)，需要將樣件尺寸限制在1 mm以下，即樣件最大宏觀尺寸不宜超過最小微觀特征的1000倍，這給樣件制備帶來較大困難[25]。而使用掃描電鏡觀察微孔結(jié)構(gòu)時，受設備限制，觀測樣件以薄片效果最佳，并且僅可觀察樣件表面形貌，無法觀察樣件內(nèi)部微結(jié)構(gòu)形態(tài)。因此目前對于3D打印陶瓷樣件內(nèi)部微孔的檢測，仍存在諸多困難，具體檢測方法的選擇應根據(jù)樣件具體性能及特征尺度觀測需求進行合理選擇。

5 結(jié)論

本研究主要面向3D打印多孔結(jié)構(gòu)陶瓷材料外科植入物，通過對不同測試方法的理論對比和可行性分析，提出了基于Micro-CT和掃描電鏡掃描成像方法進行3D打印多孔結(jié)構(gòu)陶瓷樣件的孔隙結(jié)構(gòu)的宏微觀特征表征和分析的統(tǒng)計方法，形成了一套3D打印多孔結(jié)構(gòu)陶瓷材料外科植入物形貌宏微結(jié)構(gòu)尺寸特征的有效的測量和評價方法。本文提出的方法，有利于實現(xiàn)多孔結(jié)構(gòu)宏微觀特征的相關(guān)測試內(nèi)容和試驗過程的規(guī)范統(tǒng)一，確保測試過程方法有據(jù)可依，結(jié)果評價準確有效，有利于提升產(chǎn)品的加工精度，便于不同企業(yè)同種工藝制造的多孔結(jié)構(gòu)特征參數(shù)之間等同比較，并可為醫(yī)療器械行業(yè)多孔結(jié)構(gòu)宏微觀特征的數(shù)據(jù)積累奠定基礎，有利于提高與人體生命安全息息相關(guān)的外科植入物產(chǎn)品的研發(fā)和制造水平。