哺乳動(dòng)物精子獲能信號(hào)通路及檢測(cè)方法研究進(jìn)展

毛 飛，程 敏，陳曉良，段 然，孫 洋，李國(guó)俊，王彩云

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014109）

精子從雄性哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)生成并獲得運(yùn)動(dòng)能力后，還需要在雌性動(dòng)物生殖道中經(jīng)歷獲能、頂體反應(yīng)、精卵識(shí)別等過(guò)程才能完成受精。Chang［1］首次報(bào)道了哺乳動(dòng)物精子可以在體外獲能。精子獲能與膽固醇含量和質(zhì)膜穩(wěn)定性等因素有關(guān)，涉及環(huán)磷酸腺苷 （cyclic adenosine monophosphate，cAMP）合成、cAMP 依賴(lài)性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA）的激活和下游的酪氨酸磷酸化等?？梢酝ㄟ^(guò)檢測(cè)精子的sAC-cAMPPKA 通路、質(zhì)膜流動(dòng)性、膽固醇分布、酪氨酸磷酸化水平、頂體完整性和超活化水平判斷其獲能狀態(tài)。精子體外獲能對(duì)成功受精至關(guān)重要。充分了解精子獲能過(guò)程中涉及的主要信號(hào)通路及精子獲能的檢測(cè)方法，對(duì)哺乳動(dòng)物體外受精技術(shù)的成熟運(yùn)用具有指導(dǎo)意義。筆者對(duì)哺乳動(dòng)物精子獲能過(guò)程中涉及的信號(hào)通路、信號(hào)分子、調(diào)節(jié)因子、離子通道以及精子獲能檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并對(duì)未來(lái)主要研究方向進(jìn)行了展望，以期為精子體外培養(yǎng)及輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用等提供參考。

1 哺乳動(dòng)物精子獲能及涉及的信號(hào)通路

哺乳動(dòng)物精子在雌性生殖道獲能后發(fā)生了復(fù)雜的變化，包括一些重要的離子、蛋白改變以及形態(tài)的變化等。這些變化共同參與了信號(hào)通路及對(duì)應(yīng)信號(hào)分子的功能修飾調(diào)節(jié)，為精子細(xì)胞獲能和成功受精奠定了基礎(chǔ)。

1.1 精子獲能

根據(jù)Chang［1］的研究，當(dāng)精子從雄性動(dòng)物的生殖道釋放出來(lái)時(shí)，它們并沒(méi)有受精的能力。精子在雌性動(dòng)物的子宮或輸卵管內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的孵育，才能穿透透明帶，與卵細(xì)胞融合，形成受精卵，這一過(guò)程為獲能。絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物精子必須經(jīng)歷這一階段才能順利識(shí)別卵子并結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)受精。研究表明，在精子成熟過(guò)程中，精子表面的某些物質(zhì)可能是抑制活力的失活因子，如蛋白質(zhì)、肽等［2］，其能量學(xué)本質(zhì)是去除或滅活精子表面的能量因素。精子獲能包含一系列生理生化反應(yīng)過(guò)程，其步驟大致如下。（1）超激活運(yùn)動(dòng)（hyperactivated motility，HAM）：精子鞭毛運(yùn)動(dòng)頻率及運(yùn)動(dòng)方式發(fā)生轉(zhuǎn)變?；盍φＪ遣溉閯?dòng)物精子在雌性生殖道內(nèi)受精并與卵子融合的先決條件。適度的運(yùn)動(dòng)有助于精子進(jìn)入卵子的透明帶并與卵子結(jié)合形成受精卵。自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，超激活運(yùn)動(dòng)已成為生殖研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。（2）獲能：精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及特征發(fā)生變化。（3）頂體反應(yīng)(acrosomal reaction，AR）：精子完成獲能的必要前提［3］。

1.2 獲能時(shí)精子的生理生化變化

精子獲能過(guò)程中發(fā)生的生理生化變化會(huì)引起AR 和HAM，隨后精子尾部振幅增加，鞭毛活動(dòng)頻率加快，運(yùn)動(dòng)趨勢(shì)呈線性下降。獲得受精能力的精子細(xì)胞進(jìn)入卵母細(xì)胞透明帶，完成受精。獲能時(shí)精子發(fā)生的生理生化變化包括：（1）膽固醇流動(dòng)引發(fā)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的改變，主要是質(zhì)膜的通透性與流動(dòng)性發(fā)生改變。（2）精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+和HCO3-濃度上升，使cAMP 水平升高。（3）蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）途徑被激活并誘導(dǎo)部分精子蛋白的酪氨酸磷酸化，從而推動(dòng)精子形成和AR 等重要過(guò)程［4］。

精子獲能后期階段發(fā)生的主要變化是與HAM和獲能有關(guān)的酪氨酸磷酸化。由于該階段精子的分化程度高，這些變化幾乎不能改變精子基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程。精子獲能與蛋白質(zhì)磷酸化等反應(yīng)之間存在密切聯(lián)系［5］。酪氨酸磷酸化主要發(fā)生在絲氨酸（Ser）、冬氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）殘基上，但精子生成的狀態(tài)也與同型酪氨酸磷酸化的程度有關(guān)。精子獲能可分為2 種類(lèi)型：快速事件和慢速事件，兩者都發(fā)生在雌性生殖系統(tǒng)中。快速事件是指精子一離開(kāi)附睪，鞭毛就猛烈而不對(duì)稱(chēng)地激活。其在分子水平上取決于PKA 的激活和腺苷酸環(huán)化酶，腺苷酸環(huán)化酶由Ca2+和HCO3-激活［6］。PKA 激活是由可溶性腺苷酸環(huán)化酶介導(dǎo)的，隨著腺苷酸環(huán)化酶的激活，PKA 被激活。慢速事件涉及精子運(yùn)動(dòng)模式的變化。蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化是精子獲能的另一個(gè)標(biāo)志，發(fā)生在獲能后期，與cAMP 和PKA 激活的時(shí)間不同。

1.3 精子“去獲能”

研究表明，當(dāng)精子發(fā)生獲能和AR 時(shí)，精子質(zhì)膜發(fā)生紊亂并進(jìn)行重排以適應(yīng)變化，沒(méi)有與卵母細(xì)胞結(jié)合的精子會(huì)死亡。為了更好地防止這種不利于精卵結(jié)合情況的發(fā)生，當(dāng)精子經(jīng)過(guò)附睪時(shí)，附睪會(huì)分泌一些穩(wěn)定因子附著在精子表面，這些穩(wěn)定因子有利于精子質(zhì)膜的穩(wěn)定，保證精子在雌性生殖道中的存活。這些穩(wěn)定因子稱(chēng)為去獲能因子（decapacitation factor，DF）。精子獲能是可逆的，當(dāng)去能因子與已經(jīng)獲能的精子接觸后，精子又變?yōu)槲传@能的狀態(tài)，即“去獲能”［7］。這種可逆性的調(diào)控除信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的參與外，還可能與精子自身的內(nèi)在調(diào)節(jié)有關(guān)。當(dāng)發(fā)生去獲能反應(yīng)時(shí)，精子質(zhì)膜的流動(dòng)性和通透性增加，精子質(zhì)膜趨向更穩(wěn)定的狀態(tài)。精漿中的DF 也附著在精子表面，調(diào)節(jié)獲能的可逆反應(yīng)，使受精卵的數(shù)量減少，提高精子對(duì)外界環(huán)境的抵抗力，防止過(guò)早獲能，但并不能阻止受精的發(fā)生［8］。研究表明，牛、豬、馬、兔和猴等動(dòng)物的精漿中均含有DF，而雞和狗的精漿中不含有DF。

精子獲能通常由能量底物、膽固醇、NaHCO3、Ca2+、K+和Na+組成。研究表明，小鼠精子獲能的開(kāi)始與膽固醇從精子質(zhì)膜中的流出有關(guān)，這增加了質(zhì)膜對(duì)Na+/HCO3-的滲透性，導(dǎo)致腺苷的激活、cAMP 的產(chǎn)生和PKA 的激活，從而促進(jìn)精子獲能［9］。全能酶PKA 由4 個(gè)亞單位組成，2 個(gè)亞單位是催化亞單位（PKA-C），另外2 個(gè)是亞單位調(diào)節(jié)亞基（PKA-R）。調(diào)節(jié)亞基中的R 亞基之間相互作用形成二聚體，另一端是cAMP 的結(jié)合位點(diǎn)。cAMP 與調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合引發(fā)了催化亞基的解離和激活，可以激活G 蛋白耦聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）來(lái)調(diào)節(jié)精子獲能［10］。有學(xué)者證實(shí)了酪氨酸磷酸化與精子獲能的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)倉(cāng)鼠、豬、馬和刷尾負(fù)鼠的精子獲能期間下游酪氨酸磷酸化水平提高［11］。PKA 抑制劑可以阻斷酪氨酸磷酸化。研究表明，Src 家族蛋白酪氨酸激酶 （Srcfamily protein tyrosine kinase，SFK）可以調(diào)節(jié)小鼠、人和牛精子蛋白的酪氨酸磷酸化水平［12］。在小鼠精子中發(fā)現(xiàn)PKA 與Src 家族共同免疫沉淀，這種相互作用導(dǎo)致Src 家族磷酸化［13］。Kumaresan 等［14］研究表明，輸卵管液可以影響凍存豬精子獲能過(guò)程中的酪氨酸磷酸化，母豬排卵前輸卵管液誘導(dǎo)的磷酸化水平高于排卵后，公豬精子經(jīng)過(guò)酪氨酸磷酸化后生育能力明顯提高。蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化是由酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）調(diào)節(jié)的，而PKA 是調(diào)節(jié)TK 活性的最重要因素之一。目前發(fā)現(xiàn)2 種類(lèi)型的TK，即受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）和非受體酪氨酸激酶（nonreceptor tyrosine kinase，NRTK）［15］。2004 年，研究人員證明了兔、小鼠、大鼠和人的精子中存在RTK。Src 家族的NRTK 主要分布于精子尾部［16］。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，Src 家族也存在于人類(lèi)精子的頭部，應(yīng)用特定的Src 家族和PKA 抑制劑可使合格精子蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化水平顯著降低。最近對(duì)于人和小鼠精子的研究表明，大多數(shù)酪氨酸磷酸化蛋白位于精子尾部［17］。

1.4 去獲能因子的分類(lèi)

1.4.1 精子表面DF

精漿蛋白作為精漿的重要組成部分，不僅參與精子競(jìng)爭(zhēng)、卵子生成和精卵結(jié)合，還參與精子獲能、AR、抗氧化、免疫反應(yīng)和受精等過(guò)程。研究表明，精子獲能后生理功能和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，這些變化主要是由蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化、膽固醇從精子質(zhì)膜流出、產(chǎn)生活性氧、精子質(zhì)膜的超極化以及精子質(zhì)膜內(nèi)外離子濃度差等變化所致。

附睪、前列腺和精囊腺構(gòu)成了雄性哺乳動(dòng)物的附性腺。泌尿生殖腺分泌物是一種復(fù)雜的混合物，pH 值為7.35～7.50，可以保護(hù)精子免受雌性生殖道酸性環(huán)境的影響，是精子生存和進(jìn)入雌性生殖道的必要條件。研究人員通過(guò)體外和體內(nèi)培養(yǎng)從大鼠附睪尾部分離出的HongrES1 蛋白，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有去能因子的特性。該蛋白被激活后，通過(guò)抑制抗血清（HA）而加速獲得活性，HA 可誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流。然而，HongrES1 蛋白［幽門(mén)螺桿菌（Helicobacter pylori，HP），0.25 mg/mL］能有效阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣離子通量，從而提高精子活力，防止生殖功能受損，避免后代胚胎發(fā)育異常［18］。

1.4.2 抑制蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化的DF

研究表明，半胱氨酸分泌蛋白1（cysteine-rich secretory protein 1，CRISP1）抑制酪氨酸磷酸化，隨著劑量的增加，磷酸化水平也越來(lái)越低，其通過(guò)影響精子頭部質(zhì)膜的磷酸化水平以及降低精子結(jié)合透明帶和頂體胞吐能力來(lái)影響獲能［19］。磷脂酶C（phospholipase C，PLC）參與精子獲能并影響頂體細(xì)胞活性。活化后的PLC 與磷脂酰肌醇-PLC（PIPLC）通過(guò)參與胞質(zhì)中膜磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸鹽的水解，從而引起精子質(zhì)膜的融合及AR。研究發(fā)現(xiàn)，人精液中存在PLC 亞型NYD-SP27，對(duì)蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）具有抑制作用，可以對(duì)精子過(guò)早獲能與自發(fā)AR 起到負(fù)調(diào)控的功 能［20］。

2 精子獲能的檢測(cè)方法

根據(jù)獲能精子在運(yùn)動(dòng)形態(tài)和新陳代謝等方面特點(diǎn)的變化，創(chuàng)設(shè)了多種精子獲能的評(píng)價(jià)方法和標(biāo)準(zhǔn)體系。目前比較常用的檢測(cè)方法有sACcAMP-PKA 通路檢測(cè)、質(zhì)膜流動(dòng)性改變檢測(cè)、膽固醇再次分布檢測(cè)、酪氨酸磷酸化檢測(cè)和AR 等。此外，還有去能因子鑒定、精子呼吸能檢測(cè)等方法。由于測(cè)定呼吸能的方法有許多弊端，所以現(xiàn)在已經(jīng)淘汰。

2.1 sAC-cAMP-PKA 通路檢測(cè)

在早期研究中，通常使用放射性酶或免疫分析法檢測(cè)可溶性腺苷酸環(huán)化酶 （soluble adenylate cyclase，sAC）和PKA 的活性以及cAMP 的產(chǎn)量。對(duì)于酶的檢測(cè)，通常使用sAC 或PKA 活性修飾的放射性標(biāo)記底物，利用電離輻射儀器檢測(cè)產(chǎn)物。研究表明在小鼠精子中，利用放射性試驗(yàn)測(cè)定不同條件下sAC 的活性，將內(nèi)源性sAC 底物［α-32P］ATP轉(zhuǎn)化為［32P］cAMP，然后經(jīng)過(guò)層析純化測(cè)定產(chǎn)物水平［21］。在小鼠精子獲能過(guò)程中，利用PKA 磷酸化將放射性的磷酸鹽轉(zhuǎn)移到激酶底物肽（肯普肽）上測(cè)定sAC 的活性［22］。cAMP 的免疫檢測(cè)方法是將放射性標(biāo)記的cAMP 和內(nèi)源性精子cAMP 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合在抗cAMP 抗體上，從而檢測(cè)抗體的含量。這種測(cè)定cAMP 含量的方法，已經(jīng)應(yīng)用于野豬、牛和人等物種的精子獲能檢測(cè)［23］。

2.2 質(zhì)膜流動(dòng)性改變檢測(cè)

由cAMP-PKA 依賴(lài)磷脂的流動(dòng)引起的質(zhì)膜流動(dòng)性變化已被廣泛研究，許多早期研究以公豬為模型物種［24］。研究表明，部花青540（merocyanine 540，熒光染料）在質(zhì)膜的流體相中具有很高的結(jié)合親和力，成為檢測(cè)脂質(zhì)堆積程度的敏感工具。用碳酸氫鹽處理豬精子后，精子質(zhì)膜結(jié)構(gòu)快速變化，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到精子中的部花青540著色增強(qiáng)。用部花青540 檢測(cè)精子質(zhì)膜早期的快速變化已經(jīng)應(yīng)用于公羊、馬和犬等動(dòng)物［25］。

2.3 膽固醇再次分布檢測(cè)

隨著cAMP-PKA 依賴(lài)的磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)的激活和細(xì)胞膜流動(dòng)性的增加，在質(zhì)膜中均勻分布的膽固醇集中到精子頭部頂端［26］。研究發(fā)現(xiàn)，利用Filipin標(biāo)記技術(shù)可以直觀地觀察到膽固醇向精子頭部運(yùn)動(dòng)，F(xiàn)ilipin 是由鏈霉菌產(chǎn)生的多聚體類(lèi)化合物，最常用的亞型是Filipin Ⅲ型。這種蛋白異構(gòu)體能夠與細(xì)胞膜內(nèi)的內(nèi)源性膽固醇形成復(fù)合物，具有熒光特性［27］。該技術(shù)已應(yīng)用于豬、馬等動(dòng)物的精子獲能檢測(cè)。

2.4 酪氨酸磷酸化檢測(cè)

有2 種常見(jiàn)的方法用于檢測(cè)精子蛋白質(zhì)的酪氨酸磷酸化：一種是免疫熒光法，另一種是免疫印跡法。免疫熒光法使用熒光基團(tuán)，如異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）與酪氨酸磷酸化的蛋白質(zhì)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)磷酸化蛋白質(zhì)的定位［28］。這種方法能直觀地看到獲能過(guò)程中蛋白質(zhì)磷酸化的變化以及不同功能之間的聯(lián)系。研究表明，用15%的抗酪氨酸標(biāo)記小鼠精子后，在熒光未激發(fā)時(shí)顯示部分或全部熒光。精子被激發(fā)并與卵子透明帶接觸時(shí)，熒光完全轉(zhuǎn)向鞭毛的精子占90%。免疫熒光被用來(lái)區(qū)分無(wú)法與輸卵管細(xì)胞結(jié)合的精子，依據(jù)是它們?cè)诔嗟绤^(qū)域和頂體區(qū)域發(fā)生磷酸化。鑒定特異性磷酸化的蛋白質(zhì)只能通過(guò)免疫印跡（Western blotting）。精子蛋白磷酸化的分析已被廣泛用于幾個(gè)物種中。對(duì)酪氨酸磷酸化的免疫印跡和免疫熒光分析篩選出了小鼠精子中的2 種分子伴侶，即熱休克蛋白60 和90 家族ERP99 蛋白，它們只在受精條件下被磷酸化，并與精子區(qū)域識(shí)別有關(guān)。為了更全面地分析精子的蛋白質(zhì)，可以在蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移之前用2D-SDS-PAGE 進(jìn)行分離，隨后用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)凝膠中的分離蛋白［29］。

2.5 頂體完整性檢測(cè)

除上述方法外，顯微鏡觀察法也是研究獲能的一種手段，用來(lái)檢查獲能精子中頂體的變化。金霉素（CTC）試驗(yàn)是一種利用熒光評(píng)估頂體反應(yīng)的方法，已被用于多種動(dòng)物（馬、羊和犬）精子激活的各個(gè)階段的檢測(cè)。CTC 可與細(xì)胞膜上的Ca2+結(jié)合，目前還沒(méi)有明確的機(jī)制可以解釋其在激活過(guò)程中的分子水平分布［30］。在獲能成功后，量化頂體變化的最常見(jiàn)方法之一是使用凝集素或抗體在細(xì)胞外暴露后與頂體膜結(jié)合。頂體外膜的暴露使糖基化的蛋白質(zhì)很容易與特定的凝集素或針對(duì)熒光體的抗體結(jié)合，因此，可以通過(guò)熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀檢測(cè)新暴露的糖蛋白的表達(dá)和分布。有許多凝集素能夠檢測(cè)頂體反應(yīng)，而且每種凝集素都有不同的效果。花生凝集素（peanut agglutinin，PNA）是一種經(jīng)常用于檢測(cè)頂體反應(yīng)的凝集素。與細(xì)胞表面補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白（CD46，位于頂體膜內(nèi)）的抗體相比，PNA 已被證明具有更好的結(jié)合能力，并且不影響精子活力或質(zhì)膜的完整性。由于頂體囊泡擴(kuò)散暴露了頂體內(nèi)膜，PNA 比頂體囊泡的抗體CRB9和豌豆凝集素能更好地捕捉人類(lèi)精子的頂體反應(yīng)速度［31］。

2.6 精子超激活

精子過(guò)度激活是受精能力的特征之一。最初，研究人員通過(guò)顯微鏡圖像觀察一段時(shí)間內(nèi)可識(shí)別的超激活運(yùn)動(dòng)特征來(lái)確定表達(dá)該運(yùn)動(dòng)的精子百分比，或通過(guò)手動(dòng)重建精子運(yùn)動(dòng)軌跡來(lái)確定精子超激活的具體運(yùn)動(dòng)參數(shù)。運(yùn)動(dòng)參數(shù)可以從不同角度解釋高活性精子的運(yùn)動(dòng)軌跡，特別是精子頭部側(cè)擺 幅 度 （amplitude of lateral head displacement，ALH）和低速直線曲線（curvilinear velocity，VCL）。由于技術(shù)創(chuàng)新，計(jì)算機(jī)輔助精液分析（computerassisted sperm analysis，CASA）已經(jīng)取代了人工重建精子運(yùn)動(dòng)能力分析，并且比人工重建更加客觀。研究表明，不同物種精子的超活化現(xiàn)象差異很大，這可能與鞭毛結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，因此，不同物種有不同的精子過(guò)度活躍的閾值和運(yùn)動(dòng)能力參數(shù)［32］。研究表明，過(guò)度活躍的公豬精子的ALH＞3.5 μm、VCL＞97 μm/s 和LIN（linearity）＜32%，而公羊精子則極為活躍，ALH＞9 μm，VCL＞250 μm/s，LIN≤30%［33］。

3 小結(jié)與展望

哺乳動(dòng)物精子獲能是受精過(guò)程的一個(gè)關(guān)鍵組成部分，可以衡量精子與透明帶結(jié)合并使卵細(xì)胞受精的能力。精子獲能涉及許多種復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，其中，cAMP 和酪氨酸磷酸化受PKA 介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)節(jié)。影響精子生成的因素包括各種離子的變化、質(zhì)膜蛋白的重組、膜磷脂的代謝、膽固醇水平、頂體反應(yīng)和過(guò)度激活。隨著胚胎工程技術(shù)的進(jìn)步以及各相關(guān)學(xué)科的發(fā)展與融合，精子獲取技術(shù)將取得新的突破，精子生育能力評(píng)估技術(shù)將不斷創(chuàng)新。