神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)細(xì)胞在成牙向分化機(jī)制方向的研究進(jìn)展

陳子嫣 趙鶴翔 賈 妮 葛振林

牙齒的缺失常常給人們的口腔健康、功能、美觀造成影響，缺失牙如何修復(fù)一直是口腔研究領(lǐng)域中備受關(guān)注的熱點(diǎn)之一。目前，隨著生物技術(shù)和組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，用干細(xì)胞構(gòu)建組織工程化牙齒，從而實(shí)現(xiàn)牙體組織再生的技術(shù)受到越來越多的青睞和關(guān)注。神經(jīng)嵴細(xì)胞作為胚胎發(fā)育早期出現(xiàn)的高度遷移性干細(xì)胞群，其遷移、分化和牙齒的發(fā)生和發(fā)育密不可分。牙齒的發(fā)育主要與外胚間充質(zhì)細(xì)胞和外胚層表面上皮細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)，這些相互作用主要通過骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、音猬因子同族體超家族（sonic hedgehog， SHH），成纖維生長因子超家族（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF），Wnt 信號(hào)通路等保守的信號(hào)途徑介導(dǎo)[1∽4]，并且與神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移分化及定位息息相關(guān)。發(fā)育生物學(xué)顯示牙本質(zhì)、牙髓等牙齒結(jié)構(gòu)主要來源于由胚胎發(fā)育期出現(xiàn)的神經(jīng)嵴細(xì)胞（neural crest cells，NCCs）所演化成的外胚間充質(zhì)組織[5,6]，這其中主要涉及NCCs 的遷移分化、頜骨定位及復(fù)雜的分子調(diào)控過程。本文主要從神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移分化、頜骨定位等方面系統(tǒng)地回顧了神經(jīng)嵴細(xì)胞在牙齒發(fā)生發(fā)育過程中的作用，并簡要概述了神經(jīng)嵴細(xì)胞在成牙向分化過程中可能的分子通路。

一、神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移分化與牙齒的發(fā)生

NCCs在胚胎發(fā)育的第三周出現(xiàn)，是胚胎發(fā)育過程中短暫出現(xiàn)于神經(jīng)上皮與上皮前體之間的具有高度遷移性的細(xì)胞群，遷移初期NCCs與其他神經(jīng)上皮細(xì)胞失去聯(lián)系，完成部分或完全的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT），形成可以在形態(tài)上識(shí)別的單個(gè)或成群的遷移細(xì)胞，之后沿著確定的路徑遷移并定居于不同的區(qū)域，最終分化成為各種各樣的衍生物[7]。Zhang 等[8]用LacZ 報(bào)告的標(biāo)記NCCs 基因的轉(zhuǎn)基因方法，證明了NCCs 離開神經(jīng)褶皺之后通過腹側(cè)遷移參與第一鰓弓的形成。Yuan 等[9]用單細(xì)胞RNA 測序分析證明了NCCs進(jìn)入第一鰓弓后的動(dòng)態(tài)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，并且通過腹側(cè)的分層遷移實(shí)現(xiàn)了NCCs的分化異質(zhì)性。

牙齒的發(fā)生主要依賴于牙源性上皮與外胚間充質(zhì)的相互作用[6]。通過NCCs 標(biāo)記示蹤法證明了牙髓、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)等外胚間充質(zhì)發(fā)育產(chǎn)物均是由NCCs 衍生細(xì)胞所產(chǎn)生的[5]，同時(shí)在NCCs 所衍生的外胚間充質(zhì)中表達(dá)的同源盒基因的組合作用被認(rèn)為是決定牙齒形態(tài)、大小、位置的因素[10]。

二、神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)細(xì)胞在牙齒發(fā)育過程中的位置確定

在NCCs 遷移形成外胚間充質(zhì)的過程中通過同源盒基因的組合作用來確定上下頜弓的牙區(qū)、無牙區(qū)、磨牙區(qū)、切牙區(qū)的具體位置關(guān)系。

1.牙板位置的確定

對(duì)控制牙板發(fā)育的空間模式和細(xì)胞機(jī)制現(xiàn)有研究較少。在小鼠牙齒模型中，胚胎發(fā)育第9 天，在FGF8 的誘導(dǎo)下Lhx6和Lhx7作為牙齒形成的原始標(biāo)記僅表達(dá)于第一鰓弓口部的外胚層中[11]；胚胎發(fā)育第11 天，口腔上皮增厚，牙軸在第一鰓弓上形成。在牙齒發(fā)育跡象出現(xiàn)前Pixt2作為牙齒發(fā)育的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄標(biāo)記在上下頜弓近遠(yuǎn)端和口腔外胚層中出現(xiàn)[12,13]，當(dāng)Pax9高表達(dá)的區(qū)域限制性出現(xiàn)成排排列的牙板結(jié)構(gòu)形成未來牙弓后定位于牙齒形成的部位[14]，Pixt2和Pax9均與FGF8 和BMP4 的拮抗作用調(diào)節(jié)有關(guān)，由此推斷牙板位置可能是由兩種不同類型的信號(hào)分子的組合共同決定的。同時(shí)在對(duì)乳腺的發(fā)育研究中表明，未來腺體的正確定位取決于沿背腹軸存在的不同發(fā)育閾值的各種分子網(wǎng)絡(luò)[15]，由此Balic 認(rèn)為[3]牙板的發(fā)育的空間模式也受到類似的分子機(jī)制調(diào)控，即在發(fā)育中的頜骨沿背腹軸形成梯度來確定未來牙列的位置。

2.牙齒類型的確定

關(guān)于牙齒類型的確定在早期的研究中有兩種理論：發(fā)生域理論（在頜骨未來牙弓所在的位置上存在近端磨牙，遠(yuǎn)端切牙的牙軸，牙齒的類型沿這個(gè)牙軸確定）[16]和克隆理論（預(yù)編程細(xì)胞的單個(gè)克隆可以通過誘導(dǎo)牙板啟動(dòng)特定類別的所有牙齒的發(fā)育，隨著細(xì)胞克隆向遠(yuǎn)端增長的過程中，牙蕾形成，其周圍被抑制圈環(huán)繞，以限制其他牙齒的發(fā)育，直到克隆細(xì)胞充分移動(dòng)為止）[17]。但隨著同源盒基因的研究不斷進(jìn)展[10]，可以認(rèn)為發(fā)生域理論和克隆理論應(yīng)該是相輔相成的，與之相關(guān)的有Dlx、Barx、Msx、Alx等基因家族[10,18,19]。其中Dlx基因家族在上、下頜骨的結(jié)構(gòu)區(qū)分及磨牙的發(fā)育中起到重要的作用。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，上頜弓Dlx1/Dlx2表達(dá)陽性，Dlx5/Dlx6表達(dá)陰性，下頜弓Dlx1/Dlx2和Dlx5/Dlx6均表達(dá)陽性，當(dāng)敲除Dlx1/Dlx2時(shí)上頜磨牙完全缺失，但下頜磨牙及切牙完好[18]，因此推斷Dlx1/Dlx2基因?qū)τ谏项M磨牙的影響更大，下頜磨牙的完好有可能是Dlx5/Dlx6基因的補(bǔ)償作用[12]。Barx基因家族與磨牙的形成有關(guān)—主要是Barx1，在前磨牙和磨牙的結(jié)構(gòu)域中均有Barx1的表達(dá)，同時(shí)在雪豹胚胎實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)Barx1的遠(yuǎn)端極限接近頜弓遠(yuǎn)端，相對(duì)的Barx1陰性區(qū)域較小，由此推斷Barx1與食肉動(dòng)物的進(jìn)化趨勢有關(guān)[10]。Msx 基因家族對(duì)NCCs 的增殖分化及牙齒的正常發(fā)育至關(guān)重要。當(dāng)敲除Msx1和Msx2之后磨牙和前牙的發(fā)育均會(huì)停止[12]，并且Msx1缺失的患者以第二前磨牙的缺失為主要表現(xiàn)[20]。Alx基因家族在NCCs 的早期遷移及切牙發(fā)育相關(guān)。Alx3在額鼻突中表達(dá)明顯[19]，且在切牙的結(jié)構(gòu)域顯示Alx3陽性[10]。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)這些基因之間的存在與否對(duì)于牙齒類型的確定同樣重要，并且不同基因之間存在重疊區(qū)域，共同決定一定區(qū)域中牙齒的結(jié)構(gòu)形態(tài)[10]。而在間質(zhì)中BMP4 調(diào)節(jié)的Wnt∕β-catenin 信號(hào)，對(duì)于早期牙齒形態(tài)和順序牙齒的形成至關(guān)重要[3]，并且Jarvinen等[21]研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)中的低Wnt∕β-catenin 信號(hào)是繼發(fā)牙齒萌芽的先決條件。

三、神經(jīng)嵴來源的外胚間充質(zhì)細(xì)胞在形成相關(guān)牙性組織過程中的信號(hào)通路

1.FGF信號(hào)通路

成纖維生長因子超家族（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是一種含有保守氨基酸序列的多肽類物質(zhì)，在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中大約檢測出了23個(gè)相關(guān)成員，大部分成員均參與了牙齒的發(fā)育過程，其中FGF3、FGF4、FGF8、FGF9、FGF10 是牙齒發(fā)生的關(guān)鍵信號(hào)分子[2,22]。FGF3 和FGF10 主要參與牙胚從蕾狀期向帽狀期的轉(zhuǎn)變過程，缺失FGF3和FGF10的小鼠模型多表現(xiàn)出牙齒體積減少，牙尖數(shù)量減少，頸環(huán)結(jié)構(gòu)無法形成等癥狀；FGF8是誘導(dǎo)牙胚發(fā)育的起始因子之一，參與誘導(dǎo)Lhx6、Lhx7、Pax9、Pitx2等基因的表達(dá)[22]，敲除FGF8的小鼠第一鰓弓大部分結(jié)構(gòu)缺失，而外源性FGF8 可以誘導(dǎo)退化牙胚體外成牙[23]；FGF4、FGF9 和FGF20 參與釉結(jié)的形成，調(diào)控牙齒的形態(tài)和牙尖的形成[22]。此外也有研究表明在NCCs 向外胚間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程中可能存在有來自咽上皮的FGF 信號(hào)分子的參與，但具體的分子通路還尚不明確[24]。

2.BMP信號(hào)通路

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是少數(shù)在上皮和間充質(zhì)組織之間傳遞雙向信號(hào)信號(hào)通路之一，在牙齒的的多個(gè)階段都起著重要的的作用。BMP 的傳導(dǎo)途徑有依賴Smad 的經(jīng)典通路和不依賴Smad 的非經(jīng)典通路兩種[25]。在小鼠實(shí)驗(yàn)研究中，發(fā)現(xiàn)BMP2、BMP4 協(xié)同F(xiàn)GF8 共同作用誘導(dǎo)Pax9，Pitx2 等基因的表達(dá)，參與牙胚在頜骨上的定位；在牙胚發(fā)育初期BMP4 調(diào)節(jié)Msx1、Msx2的表達(dá)，激活Tbx2從而誘導(dǎo)BMP4向間充質(zhì)轉(zhuǎn)移表達(dá)，以激活NCCs 衍生間充質(zhì)的牙源性潛力[3]。在牙胚自蕾狀期向帽狀期轉(zhuǎn)變的過程中，與BMP4 相似，BMP3 和BMP7 同樣表達(dá)上調(diào)[26]，BMP4、BMP3 和BMP7 的上調(diào)表達(dá)提示其活躍表達(dá)與牙胚的發(fā)育相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)顯示，在牙齒的早期礦化期間BMP2 的存在與否與成釉細(xì)胞的分化及成牙本質(zhì)細(xì)胞的組織分化存在一定的聯(lián)系，并且BMP2 的缺失會(huì)導(dǎo)致成熟牙齒牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)的量減少[27]。Mu 等[28]發(fā)現(xiàn)BMP2 和BMP4 在維持牙根發(fā)育過程中上皮-間充質(zhì)之間的相互作用至關(guān)重要，并且這是保證形成牙本質(zhì)細(xì)胞分化和成熟所必須的。

3.Wnt信號(hào)通路

Wnt 信號(hào)通路在組織、器官的生長發(fā)育過程中的作用十分重要，參與細(xì)胞的增殖，分化，凋亡等基本活動(dòng)。在牙齒發(fā)育過程中，Wnt主要在參與上皮-間充質(zhì)之間的信息傳導(dǎo)并參與調(diào)控牙齒的形態(tài)和數(shù)量[29]。在哺乳動(dòng)物牙胚從蕾狀期向帽狀期發(fā)育的過程中，牙源性上皮中的Wnt2，LEF1，TCF7 等Wnt 信號(hào)通路的成員的上調(diào)表達(dá)較其他信號(hào)通路多，同時(shí)Wnt信號(hào)通路的抑制性成員的表達(dá)下調(diào)[26]，提示W(wǎng)nt信號(hào)通路對(duì)于牙胚發(fā)育早期有著關(guān)鍵作用；在牙胚從鐘狀早期向鐘狀末期的發(fā)育過程中，Wnt2 的上調(diào)和Wnt9 的下調(diào)對(duì)于牙齒形態(tài)的發(fā)生也起著積極的作用，并且Wnt 通路信號(hào)部分成員不對(duì)稱分布造成的微調(diào)作用也許與牙齒頰舌側(cè)位置的確定相關(guān)[2,26]。在小鼠模型中顯示NCCs 衍生的間充質(zhì)中Wnt∕βcatenin 信號(hào)的低表達(dá)與牙列的延續(xù)性發(fā)展緊密相關(guān)，強(qiáng)行激活Wnt∕β-catenin 通路會(huì)導(dǎo)致第二磨牙及第三磨牙的缺失[21]。在NCCs的體外成牙試驗(yàn)中，成牙組也檢測到了Wnt 通路的表達(dá)[30]，進(jìn)一步證實(shí)了Wnt信號(hào)通路在牙齒發(fā)育過程中起到重要的作用。

4.SHH信號(hào)通路

SHH 信號(hào)是HH 家族中的一種分泌型多肽，SHH 也是通過上皮-間質(zhì)間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)牙齒的形態(tài)發(fā)生[31]，并在牙齒發(fā)育的不同階段扮演著不同的角色。Dacosta 等[32]在鵪鶉胚胎視線中發(fā)現(xiàn)，在NCCs遷移至第一鰓弓過程中，SHH參與協(xié)調(diào)并促進(jìn)NCCs 的存活及其多能性的維持。在牙齒發(fā)育的開始階段，可以在增厚的上皮組織中檢測到SHH 的高表達(dá)[33]。在牙冠形成階段，抑制SHH 信號(hào)的同時(shí)成釉細(xì)胞的分化也會(huì)受到抑制，從而導(dǎo)致正常牙齒形態(tài)的破壞[34]。也有研究表明，牙冠的大小取決于表達(dá)SHH 的內(nèi)釉上皮和間充質(zhì)之間的接觸面積大小[35]。在牙根形成階段，SHH 信號(hào)的缺失會(huì)造成牙根牙本質(zhì)的形成失敗，進(jìn)而導(dǎo)致牙根形成缺陷[36]。有研究表明當(dāng)GAS1 缺乏時(shí)可導(dǎo)致SHH 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致多生牙的形成[3]，因此，對(duì)于SHH 信號(hào)在牙齒形成過程中的具體作用仍然還需要進(jìn)一步探究。

5.其他信號(hào)通路

Hippo 通路主要通過負(fù)調(diào)節(jié)Yap 效應(yīng)器和Taz（轉(zhuǎn)錄共激活因子）參與神經(jīng)嵴細(xì)胞的分化和牙齒形態(tài)的調(diào)節(jié)。小鼠模型中顯示Yap 和Taz 的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致牙齒形態(tài)的缺陷，而敲除Yap 的小鼠表現(xiàn)出神經(jīng)嵴細(xì)胞的異常分化[37]。同時(shí)，在NCCs的體外成牙實(shí)驗(yàn)中也檢測出Hippo 通路的表達(dá)[30]。Smad4 是TGF-β∕BMP 的共同介質(zhì)，其參與NCCs 向成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化、牙本質(zhì)的形成及TGF-β∕BMP 與Wnt信號(hào)之間的相互作用[38]。NCCs 來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)外的成牙能力較非神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)干細(xì)胞更好，也有可能是由以Smad4 為核心的TGF-β∕Smad4 信號(hào)介導(dǎo)所導(dǎo)致[39]。Runx2 與BMP、Wnt 等信號(hào)通路的信號(hào)傳遞有著密切的關(guān)系[40]，Yu 等[13]發(fā)現(xiàn)BMP信號(hào)可通過Runx2依賴途徑影響牙齒的正常發(fā)育，而Runx2 缺失和重復(fù)則可能導(dǎo)致牙齒結(jié)構(gòu)的異常[41]。

四、神經(jīng)嵴細(xì)胞與牙再生研究展望

由于NCCs 的多能分化潛能[42]及其在牙齒發(fā)生發(fā)育過程中的重要地位[5]，在牙齒再生領(lǐng)域NCCs 也是一個(gè)很有趣的細(xì)胞模型。有研究利用8 周齡的小鼠建立了FGF8和牙本質(zhì)非膠原蛋白（DNCP）定向作用的NCCs 體外模型，實(shí)現(xiàn)了NCCs 向第一鰓弓外胚層細(xì)胞和成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的分化[43]；也有研究表明將NCCs 與無成牙能力的小鼠牙胚上皮重組后置于小鼠腎包膜下培養(yǎng)可以形成較為完整的牙齒結(jié)構(gòu)[30]；Zhang 等[44]在最近的研究中發(fā)現(xiàn)NCCs 與小鼠口腔上皮組織重組后可以在體外分化形成成牙本質(zhì)細(xì)胞，并參與牙胚的形成，同時(shí)在裸鼠體內(nèi)植入經(jīng)過處理的人牙支架與NCCs 后可以形成組織良好的血管化牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了NCCs 將可能成為牙組織∕牙齒器官再生應(yīng)用中有希望的細(xì)胞來源。

由于神經(jīng)嵴在脊椎動(dòng)物中是暫時(shí)的胚胎結(jié)構(gòu)，有報(bào)道指出人神經(jīng)嵴干細(xì)胞仍然存在于牙齦、骨髓和牙周組織，目前的技術(shù)方法分離出大量用于研究基于干細(xì)胞的牙齒發(fā)育和再生的初級(jí)NCCs 比較困難[44]，但也有研究通過修改用于人胚胎干細(xì)胞的方法，將人乳牙牙髓來源的多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為NCCs[45]。

NCCs 是一種胚胎干細(xì)胞，可以分化形成牙齒，但與此同時(shí)也可以分化形成其他組織結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)其成牙向分化的具體通路還尚不明確，并且在成牙向分化過程中誘導(dǎo)形成成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等功能細(xì)胞的介導(dǎo)因素也未可知。