白芍作用機(jī)制探究及質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測

閆雪孟，劉世勇，林誠誠，陳日丹，曹儒賓

（武漢康樂藥業(yè)股份有限公司，湖北 武漢 430056）

白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根。夏、秋二季采挖，洗凈，除去頭尾和細(xì)根，置沸水中煮后除去外皮或去皮后再煮，曬干。具有養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的作用，用于治療血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗、脅痛、腹痛、四肢攣痛以及頭痛眩暈等［1］?；瘜W(xué)成分研究表明，白芍主要含有單萜苷類、三萜類、黃酮類等化學(xué)成分。藥理研究表明，白芍具有抗炎鎮(zhèn)痛、護(hù)心、抗血栓、降糖、改善骨關(guān)節(jié)炎和保肝等廣泛的藥理作用［2-3］。

作為系統(tǒng)生物學(xué)的衍生學(xué)科，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)因其與中醫(yī)藥理論共通的認(rèn)知，被廣泛應(yīng)用于中藥的理論研究［4-5］。中藥質(zhì)量標(biāo)志物是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品中與中藥功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，是能夠反映中藥是否安全有效的標(biāo)識性物質(zhì)［6-7］。本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)和高效液相探究白芍的作用機(jī)制，分析白芍的質(zhì)量標(biāo)志物，揭示白芍的藥用物質(zhì)基礎(chǔ)，為白芍的理論研究提供更豐富翔實(shí)的資料。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器

高效液相色譜儀（Waters公司，型號：Waters e2695）；高效液相色譜儀（Aglient公司，型號：Aglient 1260）；電子天平（Mettler Toledo公司，型號：MS204S）；電子天平（Mettler Toledo公司，型號：XP26）。

1.2 主要試劑及藥物

沒食子酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831－201906）；兒茶素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110877－202005）；芍藥內(nèi)酯苷（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：4644）；芍藥苷（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736－201842）；β－1，2，3，4，6－五沒食子酰葡萄糖（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：3367）；苯甲酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：100419－201703）；苯甲酰芍藥苷（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：4633）；原兒茶酸（中國食品藥品檢定研究院，批號：110809－201906）；氧化芍藥苷（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：0220）；苯甲酰氧化芍藥苷（上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，批號：0310）；甲醇（Sigma，色譜純）；乙腈（Sigma，色譜純）；磷酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；乙醇（Sigma，色譜純）。

白芍（批號分別為PZ19012505、PZ19022503、PZ19021101、PZ19021105、PZ19022505、PZ19022507、PZ19021203、PZ19012503、PZ19012501、PZ19031103、PZ19022501，產(chǎn)地：安徽省亳州市）；白芍（批號分別為PZ19030501、PZ19030503、PZ19030507，產(chǎn)地：浙江省磬安縣）；白芍（PZ19021803、PZ19021801，產(chǎn)地：四川省德陽市）。經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)劉大會教授鑒定為毛莨科植物芍藥（Paeonia lactifloraPall.）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 活性成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫與分析平臺，篩選白芍的活性成分及靶點(diǎn)；設(shè)置口服生物利用度（oral bioactivity，OB） ≥ 30%，化合物類藥性（drug－like，DL） ≥ 0.18，獲取白芍的活性成分13個。見表1。利用UniProt數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Homo sapiens”，確定靶點(diǎn)的UniProt ID，共計71個。

表1 白芍活性成分

2.1.2 與白芍功能主治相關(guān)疾病靶點(diǎn)的篩選

通過GeneCards平臺和OMIM平臺，以anemia、menstruation、perspire during sleep、ache、hypochondriac pain、abdominal pain、Limb pain cramps、headache、dizziness、liver cirrhosis以及hepatitis為關(guān)鍵詞搜索并匯總合并重復(fù)基因靶點(diǎn)，共計19 676個。其中與白芍的活性成分靶基因匹配的靶點(diǎn)共計146個。利用R語言，生成韋恩圖。見圖1。

圖1 白芍－功能相關(guān)靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.3 蛋白質(zhì)相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建（PPI）與關(guān)鍵基因的篩選

將146個共有靶點(diǎn)輸入STRING，限定物種為“Homo sapiens”，除去孤立的點(diǎn)，選取最高置信度蛋白交互參數(shù)評分值 ＞ 0.7的蛋白互作數(shù)據(jù)，獲得蛋白相互作用關(guān)系。見圖2。利用R語言，篩選連接節(jié)點(diǎn)最多的30個基因。見圖3。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 關(guān)鍵靶基因柱狀圖

PPI網(wǎng)絡(luò)共包括134個節(jié)點(diǎn)，700條邊。30個靶點(diǎn)按連接節(jié)點(diǎn)數(shù)從大到小依次為IL6（42）、MAPK1（42）、JUN（39）、EGF（34）、IL1β（34）、CXCL8（33）、MMP9（31）、CCL2（28）、MYC（27）、PTGS2（27）、ICAM1（26）、IL10（26）、FOS（25）、CASP3（23）、ESR1（22）、MMP2（22）、STAT1（21）、PPARG（20）、CXCL10（19）、HMOX1（19）、NOS3（19）、CRP（17）、IFNG（17）、IL2（17）、PRKCA（17）、PRKCB（17）、AR（16）、MMP1（16）、CXCL2（15）和ERBB2（15）。白芍可能主要通過影響免疫應(yīng)答發(fā)揮功效，調(diào)控生理活動。

2.1.4 功能富集與通路富集分析

對146個基因進(jìn)行基因本體GO功能富集分析，共獲取377個GO條目，包括185個生物學(xué)過程條目，71個細(xì)胞成分條目和121個分子功能條目。根據(jù)校正P值大小，確定了10條分子功能相關(guān)條目（P≤ 2.59 × 10-7），包括酶結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性、血紅素結(jié)合以及類固醇激素受體活性等；確定了10條細(xì)胞成分相關(guān)條目（P≤ 1.87 × 10-6），包括細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜組成、細(xì)胞陷窩、染色質(zhì)、膜筏以及核質(zhì)等；確定了10條生物學(xué)過程相關(guān)條目（P≤ 8.37 × 10-11），依次為DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、對藥物的反應(yīng)、對脂多糖的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、對雌二醇的反應(yīng)、對缺氧的反應(yīng)、細(xì)胞對鎘離子的反應(yīng)、對外來刺激的反應(yīng)以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。見圖4。對共有靶基因進(jìn)行KEGG通路富集分析，得到149條通路，涉及癌癥通路（pathways in cancer）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE－RAGE信號通路（AGE－RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化（lipid and atherosclerosis）、乙肝（hepatitis B）、化學(xué)致癌－受體激活（chemical carcinogenesis－receptor activation）、膀胱癌（bladder cancer）、IL－17信號通路（IL－17 signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染（Kaposi sarcoma－associated herpesvirus infection）、丙肝（hepatitis C）以及甲流（influenza A）等。見表2。

圖4 GO生物過程富集圖

表2 KEGG通路富集分析

2.1.5 “白芍－成分－靶點(diǎn)－功能”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將146個共有靶基因?qū)隒ytoscape 3.8軟件，構(gòu)建“白芍－成分－靶點(diǎn)－功能”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)由155個節(jié)點(diǎn)、228條邊組成，其中紅色節(jié)點(diǎn)代表白芍藥材，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表白芍活性成分，黃色節(jié)點(diǎn)代表功能，綠色節(jié)點(diǎn)代表共有靶點(diǎn)。見圖5。山柰酚（kaempferol）所間接的基因個數(shù)最多，有42個，其余按間接基因數(shù)排序依次是β－谷甾醇（beta－sitosterol）23個，兒茶素［（+）－catechin］7個，芍藥苷（paeoniflorin）3個，谷甾醇（sitosterol）3個，芍藥苷元（paeoniflorgenone）2個，（3S，5R，8R，9R，10S，14S）－3，17－二羥基－4，4，8，10，14－五甲基－2，3，5，6，7，9－六氫－1H－環(huán)戊烷［a］菲－15，16－二酮（（3S，5R，8R，9R，10S，14S）－3，17－dihydroxy－4，4，8，10，14－pentamethyl－2，3，5，6，7，9－h(huán)exahydro－1Hcyclopenta［a］phenanthrene－15，16－dione）2個。這些化合物可作為白芍的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行更深一步的研究。

圖5 “白芍－成分－靶點(diǎn)－功能”網(wǎng)絡(luò)

2.2 指紋圖譜研究

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Xselect CSH C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B），洗脫程序見表3；流速：0.8 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：230 mm；采集速率：1點(diǎn)/秒（PDA）；進(jìn)樣體積：10 μL。

表3 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱定沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β－1，2，3，4，6－五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸、苯甲酰芍藥苷、原兒茶酸、氧化芍藥苷和苯甲酰氧化芍藥苷適量，分別加甲醇溶解，制成每1 mL含80 μg的各對照品溶液。

2.2.3 參照物溶液的制備

精密稱定芍藥苷對照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含60 μg的參照物溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備

取白芍中粉約0.1 g，精密稱定，置于250 mL圓底燒瓶中，加入50%乙醇35 mL，加熱至沸騰，保持微沸，回流2 h，冷卻，將藥液和藥渣全部轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 重復(fù)性

由分析人員1取白芍飲片，按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以芍藥苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，結(jié)果各共有峰的相對保留時間RSD ≤ 0.08%，相對峰面積RSD ≤ 1.16%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5.2 中間精密度

由分析人員2取白芍飲片，按“2.2.4”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定。以芍藥苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，并與分析人員1測定的共有峰的相對保留時間和相對峰面積比較，結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD ≤ 3.7%，相對峰面積RSD ≤ 8.0%，表明該方法中間精密度良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性

由分析人員1取白芍飲片，按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備1份供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，供試品溶液分別于室溫下放置0、9.5、35、112 h后進(jìn)樣測定。以芍藥苷為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積RSD，結(jié)果各共有峰相對保留時間RSD ≤0.6%，相對峰面積RSD ≤ 2.0%，表明白芍供試品溶液室溫下112 h穩(wěn)定。

通過HPLC建立的白芍指紋圖譜，實(shí)現(xiàn)了10個色譜峰的基線分離，占總峰面積的99.999%。指認(rèn)了其中7個色譜峰，分別為沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β－1，2，3，4，6－五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸和苯甲酰芍藥苷，該7種化合物的峰面積占指認(rèn)峰面積的94.1%。見圖6和表4。

圖6 白芍指紋圖譜

表4 指紋圖譜中各峰的保留時間及峰面積

2.2.6 指紋圖譜建立及相似度評價

取16批白芍按“2.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，設(shè)置參照圖譜，進(jìn)行多點(diǎn)校正、Mark峰匹配，以平均數(shù)法生成對照圖譜，采用自動匹配模糊模式計算相似度。16批白芍的相似度為0.950～0.995。見圖7和表5。

圖7 16批白芍指紋圖譜相似度分析圖譜

表5 白芍指紋圖譜相似度

3 討論

白芍是臨床常用的中藥之一，已有1 200多年的藥用歷史?！段迨》健肥乾F(xiàn)存最早的記載白芍入藥的文獻(xiàn)，《神農(nóng)本草經(jīng)》和《傷寒雜病論》中也都有白芍相關(guān)的詳細(xì)記載［8］。目前，眾多研究者運(yùn)用多種手段，通過多種途徑對白芍開展了系統(tǒng)深入的研究，并取得了一系列成果。依托于現(xiàn)代分析技術(shù)的指紋圖譜，包括液相色譜法（HPLC、UPLC）、薄層色譜法（TLC）、電泳法（CE）以及光譜法（IR、UV）等［9］，目前共從白芍中分離出約170種化合物，包括70余種單萜及其苷類化合物，20余種三萜及其苷類化合物，20余種黃酮類化合物，30余種鞣質(zhì)類化合物，9種多糖類化合物，還有20余種其他類化合物［10-12］。藥理研究發(fā)現(xiàn)，白芍提取物能通過抑制炎癥反應(yīng)治療干眼癥［13］。王雙等［14］對白芍水提物的抗炎作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其能降低血液和局部組織的血清前列腺素E2、一氧化氮和丙二醛含量。王思宇［12］分離純化了3個白芍多糖并探究了其對自身免疫性肝炎的治療作用，得到18個核心靶點(diǎn)，3條關(guān)鍵通路。白芍總苷是白芍有效成分的總稱，有廣泛的藥理作用，不僅對自身免疫性疾病有治療作用［15-17］，可減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎的滑膜細(xì)胞損傷［18-19］，緩解銀屑病的臨床癥狀［20］，對消化系統(tǒng)疾病也有較好的治療作用［21］。

本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫得到白芍有效成分13個，通過PPI網(wǎng)絡(luò)得到連接節(jié)點(diǎn)最多的2個靶基因，MAPK1和IL6。MAPK1是MAPK家族中的一員，參與調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂、增殖、炎癥、侵襲和轉(zhuǎn)移等生理過程，在多種婦科疾病中都發(fā)揮著重要的作用［22-23］，與缺血性腦卒中也有一定關(guān)系［24］。MARIALETIZIA等［25］研究發(fā)現(xiàn)，MAPK1能夠影響神經(jīng)發(fā)育。而IL6是持續(xù)炎癥的重要標(biāo)志，能夠參與綜合免疫反應(yīng)［26］。通過功能富集分析和通路富集分析發(fā)現(xiàn)，白芍主要通過影響轉(zhuǎn)錄因子活性和與酶、蛋白質(zhì)的結(jié)合，作用于癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE－RAGE信號通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、乙肝通路、IL－17信號通路、TNF信號通路等。白芍歸肝、脾經(jīng)，肝主疏泄，脾主運(yùn)化，肝脾不和則氣血失調(diào)，百病則生。白芍通過參與免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激等作用于神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，發(fā)揮養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、柔肝止痛的功效。

通過中藥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)得到與白芍功效相關(guān)靶基因關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的白芍活性成分有山柰酚、β－谷甾醇、兒茶素、芍藥苷、谷甾醇、芍藥苷元和（3S，5R，8R，9R，10S，14S）－3，17－二羥基－4，4，8，10，14－五甲基－2，3，5，6，7，9－六氫－1H－環(huán)戊烷［a］菲－15，16－二酮。研究表明，山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌等作用，在神經(jīng)保護(hù)、護(hù)肝、護(hù)心等方面有廣闊的應(yīng)用前景［27］。兒茶素能夠降低酒精性脂肪肝小鼠的AST、ALT水平，同時增加SOD活性，發(fā)揮一定的護(hù)肝功效［28］。β－谷甾醇能夠通過血腦屏障，沉積于細(xì)胞膜上，在人體內(nèi)有降脂、抗脫發(fā)、抗腫瘤等多種作用［29］。芍藥苷具有廣泛的藥理作用，包括神經(jīng)保護(hù)［30］和免疫調(diào)節(jié)［31］等。通過高效液相建立白芍的指紋圖譜，將白芍中10種化合物基線分離，并指認(rèn)了7種主要化合物，分別為沒食子酸、兒茶素、芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、β－1，2，3，4，6－五沒食子酰葡萄糖、苯甲酸和苯甲酰芍藥苷。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與指紋圖譜研究結(jié)果，將兒茶素和芍藥苷作為白芍的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行更深入的研究有一定的科學(xué)性。

綜上所述，白芍的有效活性成分有山柰酚、β－谷甾醇、兒茶素和芍藥苷，核心靶基因有MAPK1和IL6，通過病毒、免疫調(diào)節(jié)、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路等作用于神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)，發(fā)揮養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗、柔肝止痛、平抑肝陽的作用。通過指紋圖譜，分離了白芍中10個化合物，并指認(rèn)了7種，包括兒茶素與芍藥苷等。兒茶素、芍藥苷可作為白芍的質(zhì)量標(biāo)志物開展進(jìn)一步研究。