苓桂術(shù)甘湯對(duì)壓力負(fù)荷致心衰小鼠心功能、腸道屏障和菌群的影響

張紅霞，陳瑤，趙鑫，邱先哲，李玉紅?

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300250； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

心力衰竭（heart failure，HF）是指由于各種原因引起心臟結(jié)構(gòu)或功能異常導(dǎo)致心室充盈障礙或射血功能下降而出現(xiàn)的一組復(fù)雜臨床綜合征［1］。2018年我國HF患病人數(shù)約450萬［2］；歐美國家HF成人患病率為1%～2%，且患病率隨年齡增加而增長，70歲以上人群的HF患病率超過10%［3-4］。苓桂術(shù)甘湯出自漢代張仲景《金匱要略》，具有溫陽化飲、利水降逆的功效。臨床研究表明苓桂術(shù)甘湯可以改善HF患者的心功能，提高患者生活質(zhì)量，療效明確［5-6］。近年來有研究表明，腸道菌群通過介導(dǎo)短鏈脂肪酸（Short－chain fatty acid，SCFA）、膽汁酸代謝等途徑參與HF的疾病進(jìn)展［7］。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用16S rRNA高通量測序，探索苓桂術(shù)甘湯對(duì)主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)（transverse aortic constriction，TAC）誘導(dǎo)的HF小鼠心功能、腸道屏障和腸道菌群的作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

雄性C57BL6/J小鼠，8～10周齡，40只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCKK（京）2016－0006。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SPF級(jí)，溫度（22 ± 2）℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h光照/黑暗環(huán)境，自由攝食、飲水。

1.2 試劑與儀器

使用DNA抽提試劑盒（美國Bio－Tek公司）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國Axygen公司）；FastDNASPINKitfor Soil（美國MP公司）；ZO－1（1∶1 000，Invitrogen）；Occludin（1∶1 000，Invitrogen）；βactin（1∶1 000，Santa Cruz）；Illumina MiSeq platform（美國Illumina 公司）；MISEQ測序儀和HISEQ測序儀（美國Illumina公司）；Vevo2100TMB型超高分辨率小動(dòng)物超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)（加拿大VisuaISonics Inc）。

1.3 苓桂術(shù)甘湯的制備

苓桂術(shù)甘湯由茯苓12 g，桂枝9 g，白術(shù)6 g，炙甘草6 g組成，所有藥材均購自北京同仁堂股份有限公司，藥材按原方比例加入蒸餾水浸泡30 min后，大火煮開并計(jì)時(shí)30 min，收集藥液；再次加入蒸餾水大火煮開后計(jì)時(shí)30 min，收集藥液。將兩次的藥液混合，濃縮，凍干制成凍干粉，保存于4 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前，將干燥凍干粉溶于蒸餾水中。

1.4 造模與分組

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用主動(dòng)脈弓縮窄術(shù)（TAC）模擬壓力負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠HF模型。手術(shù)前，小鼠禁食8 h，腹腔注射三溴乙醇（122 mg/kg）進(jìn)行麻醉，用脫毛劑去除小鼠胸毛，消毒后在鎖骨上方胸部中線附近切口約1～1.5 cm。采用鈍性分離逐漸暴露主動(dòng)脈弓，使用5-0絲線疊加27G針頭，在頭臂動(dòng)脈和左側(cè)頸總動(dòng)脈之間結(jié)扎，結(jié)扎后立即取出針頭。假手術(shù)組（Sham，n= 7）小鼠只穿線，不結(jié)扎；術(shù)后1周，將小鼠按心臟射血分?jǐn)?shù)隨機(jī)分為TAC模型組（TAC，n= 7）、苓桂術(shù)甘湯低劑量組（LD－L，n= 6，4.29 g/kg）和苓桂術(shù)甘湯高劑量組（LD－H，n= 7，8.58 g/kg），其中低劑量相當(dāng)于人臨床等效劑量，模型組灌胃蒸餾水，共8周。

1.5 心臟彩色多普勒超聲儀評(píng)價(jià)小鼠心功能

在異氟烷（0.25%～0.50%）氣體麻醉?xiàng)l件下，利用超高分辨率小動(dòng)物超聲儀器檢測小鼠左室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVESD）、左室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、射血分?jǐn)?shù)（ejection fraction，EF，%）、短軸縮短率（left ventricular fractional shortening，F(xiàn)S，%）。結(jié)果均取3個(gè)連續(xù)心動(dòng)周期的平均值。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）

取同一位置的結(jié)腸組織提取總蛋白并定量，電泳，轉(zhuǎn)膜2 h，封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，二抗常溫孵育1.5 h，TBST洗滌5次，6 min/次，使用Amersham Imager 600凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image－J、Gelpro32軟件計(jì)算目標(biāo)條帶和內(nèi)參條帶的灰度值，統(tǒng)計(jì)緊密連接帶狀閉合蛋白（zonula occluden，ZO）－1和緊密連接咬合蛋白（Occludin）的蛋白表達(dá)。

1.7 16S rRNA高通量測序

采用DNA提取試劑盒、NanoDrop 2000和1%瓊脂糖凝膠電泳分別提取總DNA、檢測DNA濃度、純度和提取質(zhì)量。使用338F：5'－ACTCCTACGGGAGGC AGCAG－3'和806R：5'－GGACTACHVGGGTWTCTA AT－3'引物在V3～V4可變區(qū)擴(kuò)增后，利用Illumina MiSeq平臺(tái)測序。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間檢驗(yàn)采用單因素方差分析，兩組間檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Student'sttest或Welch'sttest）。P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心功能

與Sham組小鼠比較，TAC組小鼠LVEDD、LVESD均顯著升高（P= 0.004 7，0.000 0），EF、FS顯著降低（均P= 0.000 0），提示TAC導(dǎo)致小鼠心臟功能嚴(yán)重受損，HF模型建立成功。與TAC組小鼠比較，LD－H可以顯著降低LVEDD（P= 0.003 0）；LD－L和LD－H均可以顯著降低LVESD（P= 0.001 6，0.000 1），并且顯著升高EF、FS（P= 0.000 0），提示苓桂術(shù)甘湯可以改善TAC小鼠的心功能。結(jié)果見圖1。

圖1 各組HF小鼠心功能的比較

2.2 小鼠結(jié)腸組織ZO－1和Occludin蛋白相對(duì)表達(dá)水平

ZO－1和Occludin是腸道緊密連接的關(guān)鍵蛋白，是腸黏膜機(jī)械屏障的最主要組成部分。與Sham組比較，TAC組小鼠結(jié)腸組織中ZO－1和Occludin蛋白表達(dá)水平均顯著下降（P= 0.000 0，P= 0.016 3）；與TAC組比較，LD－L、LD－H治療均可不同程度的恢復(fù)ZO－1（P= 0.000 0，P= 0.000 0）和Occludin（P=0.041 8，P= 0.019 5）蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)意義。結(jié)果見圖2。

圖2 各組HF小鼠結(jié)腸組織ZO－1及Occludin蛋白表達(dá)的比較

2.3 腸道菌群的多樣性

4組小鼠腸道菌群alpha多樣性結(jié)果相比較，在群落豐富度（ace、sobs、chao）、多樣性（shannon）、均一性（shannoneven、simpsoneven）均具有顯著性差異（F=7.474 6，P= 0.001 3；F= 7.292 8，P= 0.001 4；F=9.878 7，P= 0.000 3；F= 9.561 4，P= 0.000 3；F=8.796 5，P= 0.000 5；F= 3.759 9，P= 0.025 5）。與Sham組相比，TAC組shannon（P= 0.001 4）、shannoneven（P= 0.000 9）和simpsoneven（P= 0.030 4）指數(shù)顯著降低。與TAC組相比，LD－L組ace（P=0.040 9）、sobs（P= 0.038 1）、chao（P= 0.017 4）、shannon（P= 0.007 7）、shannoneven（P= 0.009 6）指數(shù)顯著升高；LD－H組ace（P= 0.000 5）、sobs（P= 0.000 2）、chao（P= 0.000 1）、shannon（P= 0.000 0）、shannoneven（P= 0.000 1）、simpsoneven（P= 0.003 7）指數(shù)顯著升高。說明TAC誘導(dǎo)的HF小鼠腸道菌群多樣性和均一性降低；苓桂術(shù)甘湯有助于上調(diào)HF小鼠腸道菌群群落豐富度、多樣性和均一性?；贐ray_curtis距離算法的主坐標(biāo)分析（Principal Coordinates Analysis，PCoA）和UPGMA分析，可以觀察小鼠腸道菌群beta多樣性的差異。結(jié)果顯示，PC1對(duì)總體菌群的代表性為19.62%，PC2為14.52%，各組基本可以聚集在一定的范圍之內(nèi)，Sham組和TAC組之間有明顯的微生物群落差異，苓桂術(shù)甘湯（LD－L和LD－H）治療后，微生物群落逐漸趨于Sham組，說明苓桂術(shù)甘湯有助于調(diào)節(jié)HF小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)。具體見圖3。

圖3 各組對(duì)TAC誘導(dǎo)的HF小鼠腸道菌群多樣性的分析

2.4 腸道細(xì)菌的相對(duì)豐度

小鼠腸道細(xì)菌中norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus和Akkermansia均表現(xiàn)出較高的豐度。在屬水平方面，與Sham組相比，TAC組norank_f_Muribaculaceae和Prevotellaceae_NK3B31_group相對(duì)豐度顯著較低，苓桂術(shù)甘湯治療可以升高他們的相對(duì)豐度（與TAC組比較）。此外，苓桂術(shù)甘湯對(duì)Parabacteroides相對(duì)豐度也有上升趨勢。結(jié)果見圖4A。在種水平方面，uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus_murinus、uncul tured_bacterium_g_Prevotellaceae_NK3B31_group、uncul tured_organism_g_Parabacteroides均具有顯著性差異（H= 15.391 0，P= 0.002 0；H= 8.214 0，P= 0.042 0；F= 8.048 7，P= 0.000 8；H= 10.451 0，P= 0.015 0）。結(jié)果見圖4B。與Sham組相比，TAC組uncultured_bacterium_g_norank_f_Muribaculaceae相對(duì)豐度明顯降低（P= 0.002 0）；Lactobacillus_murinus相對(duì)豐度升高（P= 0.042 0）。與TAC組相比，苓桂術(shù)甘湯治療明顯上調(diào)norank_f_Muribaculaceae（P= 0.028 0、0.015 0）、uncultured_bacterium_g_Prevotellaceae_NK3B31_group（P= 0.020 0）和uncultured_organism_g_Parabacteroides的相對(duì)豐度，下調(diào)Lactobacillus_murinus的相對(duì)豐度。

圖4 屬和種水平菌群組成分析及差異檢測

2.5 關(guān)聯(lián)與模型預(yù)測分析

采用Spearman相關(guān)系數(shù)，在屬水平下對(duì)EF、FS、LVEDD、LVESD在不同分類水平下的腸道菌群豐度之間的相關(guān)性進(jìn)行預(yù)測。在屬水平方面，norank_f_Muribaculaceae與EF、FS均呈正相關(guān)；與LVEDD、LVESD均呈負(fù)相關(guān)。Lactobacillus與LVEDD、LVESD均呈正相關(guān)，與EF、FS均呈負(fù)相關(guān)。結(jié)果見圖5。

圖5 屬水平菌群豐度與EF、FS、LVEDD、LVESD的相關(guān)性Heatmap圖

3 討論

正常情況下，腸道菌群與人體保持著共生的協(xié)調(diào)關(guān)系，參與宿主體內(nèi)多種代謝，生成氧化三甲胺、SCFA和膽汁酸等，并通過激活多種信號(hào)通路影響宿主的生理過程。有研究表明，HF患者心排血量減少，導(dǎo)致全身充血和灌注不足、腸黏膜缺血或水腫，進(jìn)而腸道通透性增加、細(xì)菌移位增加，乃至進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)的內(nèi)毒素增加，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，加重HF的疾病進(jìn)展［8］。因此，腸道菌群已成為探索HF治療領(lǐng)域的新視點(diǎn)。腸道菌群具有促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收、能量代謝調(diào)控、免疫功能調(diào)節(jié)等多方面功能，分別與中醫(yī)理論的脾主化生氣血、脾主運(yùn)化、脾為之衛(wèi)等方面的功能相契合，可見腸道菌群與中醫(yī)之“脾”關(guān)系密切。苓桂術(shù)甘湯是溫陽健脾利水的經(jīng)典名方，大量臨床研究證實(shí)，苓桂術(shù)甘湯可以明顯改善HF患者的心功能和生活質(zhì)量［5-6］。目前還沒有關(guān)于苓桂術(shù)甘湯對(duì)HF小鼠腸道菌群是否具有調(diào)節(jié)作用的相關(guān)報(bào)道，故本實(shí)驗(yàn)采用16S rRNA高通量測序技術(shù)探究苓桂術(shù)甘湯對(duì)TAC誘導(dǎo)的心衰小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。

本研究采用TAC壓力負(fù)荷誘導(dǎo)小鼠HF模型［9］。結(jié)果表明，模型組小鼠出現(xiàn)明顯的心功能障礙，表現(xiàn)為LVEDD、LVESD顯著升高，EF、FS顯著下降，而高、低劑量的苓桂術(shù)甘湯治療后均可顯著改善心衰小鼠的心功能。

腸屏障功能障礙是HF發(fā)生的觸發(fā)因素。臨床研究表明，HF患者腸壁厚度增加，腸道通透性增加以及腸道功能不全［10］。心衰患者的心排血量減少，腸道的血液灌流減少，影響了腸壁絨毛的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致不同類型的腸細(xì)胞功能損傷，腸屏障的完整性受損，腸道通透性增加，從而使過量的細(xì)菌及代謝產(chǎn)物、內(nèi)毒素進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。ZO－1和Occludin在腸黏膜損傷修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，是衡量腸黏膜機(jī)械屏障的重要指標(biāo)［11］。本研究表明，與假手術(shù)組相比，TAC組小鼠結(jié)腸組織中ZO－1、Occludin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，提示HF小鼠腸黏膜機(jī)械屏障受損；苓桂術(shù)甘湯干預(yù)后，小鼠結(jié)腸組織ZO－1、Occludin蛋白表達(dá)水平明顯升高，提示苓桂術(shù)甘湯能夠保護(hù)HF小鼠腸黏膜屏障。

此外，通過對(duì)HF小鼠糞便樣本進(jìn)行菌群多樣性分析，筆者發(fā)現(xiàn)HF小鼠腸道細(xì)菌多樣性明顯降低，細(xì)菌豐度也有下降趨勢；苓桂術(shù)甘湯治療后，細(xì)菌豐度及多樣性明顯升高，且結(jié)合beta多樣性結(jié)果分析，苓桂術(shù)甘湯治療后，微生物群落逐漸趨于假手術(shù)組，說明苓桂術(shù)甘湯有助于恢復(fù)HF小鼠腸道菌群的豐度和多樣性。

高劑量苓桂術(shù)甘湯治療后，Muribaculaceae相對(duì)豐度明顯升高，Parabacteroides和Prevotellaceae_NK3B3 1_group相對(duì)豐度有升高趨勢。有研究表明，Parabacteroides可以通過降低炎癥和胰島素抵抗水平，增強(qiáng)腸道完整性，進(jìn)而發(fā)揮抗肥胖的作用［12］。CMATZIOURIDOU等［13］發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides與抗動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。CHEN等［14］發(fā)現(xiàn)，SCFA產(chǎn)生菌的減少可能是TAC誘導(dǎo)HF的顯著特征，并且心衰患者中亦發(fā)現(xiàn)了SCFA產(chǎn)生菌的減少。腸道微生物介導(dǎo)的SCFA代謝途徑可以通過多種途徑抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗HF的重要作用［15］。SMITH等［16］和LIU等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Muribaculaceae、Prevotellaceae_NK3B31_group的豐度與SCFA的產(chǎn)生密切相關(guān)［16-17］。此外，Prevotellaceae_NK3B31_group 豐度減少，與炎癥發(fā)生具有一定的相關(guān)性［18］。

此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TAC小鼠腸道乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度顯著增加，苓桂術(shù)甘湯能顯著降低其豐度。LI等［19］和ZHENG等［20］發(fā)現(xiàn)，在Dahl鹽敏感性高血壓誘導(dǎo)的HF大鼠及異丙腎上腺素誘導(dǎo)的HF大鼠腸道中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度均明顯降低［19-20］；BOCCELLA等［21］發(fā)現(xiàn)，在TAC誘導(dǎo)的HF小鼠腸道中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度均顯著升高。并且有臨床研究表明在老年HF患者和ST段抬高型心肌梗死患者腸道中，乳酸桿菌屬（Lactobacillus）的相對(duì)豐度均增加［17，22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TAC小鼠腸道中Lactobacillus_murinus的相對(duì)豐度明顯增加，苓桂術(shù)甘湯治療后該菌相對(duì)豐度降低。Lactobacillus_murinus被認(rèn)為是一種特殊的“高血壓細(xì)菌”，可以調(diào)節(jié)一氧化氮水平、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑活性和脂多糖產(chǎn)生［23］。此外，WILCK等［24］發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus_murinus可以通過調(diào)節(jié)TH17細(xì)胞，進(jìn)而預(yù)防高鹽誘發(fā)的小鼠鹽敏感性高血壓，并且在人體腸道菌群中證實(shí)了該作用。因此，關(guān)于乳酸桿菌屬（Lactobacillus）在HF疾病發(fā)展中的變化及苓桂術(shù)甘湯調(diào)節(jié)的因果關(guān)系仍需進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)苓桂術(shù)甘湯能有效改善心衰小鼠心功能，修復(fù)腸黏膜屏障，調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)紊亂，促進(jìn)短鏈脂肪酸產(chǎn)生相關(guān)菌生長。