探討益木腦液灌腸對肝性腦病大鼠緊密連接蛋白及水通道蛋白表達的影響

劉昕艷 周振國 周爍 李京濤 常占杰 柏魯寧

肝性腦病(hepatic encephalopathy ,HE)是各種急慢性肝病晚期常見的死亡原因。由于HE患者腦內(nèi)無明顯的異常結(jié)構(gòu)變化，其發(fā)生難以提前預(yù)測?，F(xiàn)代醫(yī)學治療本病除肝移植外，現(xiàn)仍以對癥、支持治療為主[1-2]，而中醫(yī)以其獨特的整體觀念及辨證論治理論體系，在HE的治療上取得了一定成果。益木腦液是筆者團隊的常用方，具有通腑瀉熱、宣暢氣機、醒腦開竅等功效，在臨床應(yīng)用中取得良好效果[3-4]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)益木腦液灌腸能夠有效提高HE大鼠空間定位及學習等認知能力，但具體機制尚不明確[5]。既往研究發(fā)現(xiàn), 血腦屏障受損和膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)功能障礙與大鼠認知功能障礙相關(guān)，且血腦屏障和膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)在大腦的代謝產(chǎn)物清除過程中起到互補作用[6]。緊密連接蛋白(tight junction protein occludin，Occludin)的表達與包括血腦屏障在內(nèi)的多種屏障的通透性相關(guān)；水通道蛋白4(recombinant Aquaporin 4，AQP4)的表達與腦內(nèi)液體流動密切相關(guān)，是膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)重要組成部分，其變化可以影響大腦代謝產(chǎn)物清除。在此基礎(chǔ)上，本實驗采用 50% 的四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)聯(lián)合硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)建立HE大鼠模型，觀察益木腦液保留灌腸對HE大鼠血氨、白細胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)以及Occludin蛋白、AQP4蛋白表達的影響，探究其治療肝性腦病的作用機制，以期為臨床應(yīng)用益木腦液治療肝性腦病提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠72只，雄性，8周齡，體質(zhì)量(210±20)g，購自成都達碩實驗動物有限公司[許可證號: SCXK(川)2020-030]，于陜西中醫(yī)藥大學實驗動物中心以正常光照節(jié)律及適宜濕度溫度飼養(yǎng)，大鼠自由飲食、飲水及活動。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 試劑與儀器

益木腦液組方：生大黃 30 g、蒲公英 30 g、石菖蒲 30 g、烏梅 30 g、煅牡蠣 20 g、芒硝 20 g，中藥購自陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房，將中藥煎煮后濃縮為每克含生藥8 g的凍干粉，凍干粉于4℃冰箱中密封冷藏保存，使用時100℃水溶解。

TAA(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑有限公司，批號：YH21010802); CCl4(阿拉丁，批號：C128126)；乳果糖(北京韓美藥業(yè)有限公司，批號：20050005)；血氨、ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為：A086-1-1, C009-2-1、C010-2-1)；IL-1試劑盒(深圳海思安生物技術(shù)有限公司，貨號：SZ-HAS-290)；AQP4、Occludin、即用型SABC-POD試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為：ZP2011BP11、GR3243495-9、SA1022)。

儀器：包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5)，石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)，酶標儀(雷杜生命科技有限公司，型號：RT-6100)，顯微鏡(Nikon公司，型號：E100)。

1.3 動物分組及造模

參考宋佰玉[7]的造模方法，建立肝性腦病大鼠模型。從72只SD大鼠中隨機選取10只大鼠為對照組，其余62只大鼠為模型組。模型組按5 mL/kg給予 50% CCl4溶劑(50 mL橄欖油+50 mL CCl4)行腹腔注射，每周兩次，根據(jù)體重變化調(diào)整劑量，共12周。第13周按 300 mg/kg給予3% TAA 溶液隔日行腹腔注射，隔天1次，連續(xù)2次，對照組大鼠給予等量橄欖油腹腔注射。若大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩，自主活動減少、共濟失調(diào)、昏迷等癥狀之一，可以判斷造模成功。造模過程中，模型組大鼠死亡17只，對照組未出現(xiàn)死亡。將造模成功的45只SD大鼠隨機分為模型組、乳果糖組和益木腦液低、中、高劑量組，每組9只。

1.4 藥物干預(yù)

按照成人的用藥劑量的200%、100%、50% 設(shè)置益木腦液高、中、低劑量組。乳果糖組按5.63 mL/kg 的劑量給予乳果糖灌腸，益木腦液低、中、高劑量組分別以 0.56 g/kg、1.12 g/kg、2.24 g/kg的劑量給予益木腦液灌腸，對照組及模型組給予等量蒸餾水灌腸，給藥體積均按5 mL/kg計，灌腸后提起大鼠尾部并捏緊肛門，使大鼠倒置提起2～3分鐘，防止液體漏出，使腸腔充分吸收，每日1次，連續(xù)給藥2周。

1.5 取材方法

大鼠末次腹腔注射TAA后，禁食不禁水12小時，次日采用20%烏拉坦(1 g/kg)對大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，血液一部分予以肝素鈉抗凝，并在0.5小時內(nèi)檢測血氨水平；剩余血液于4℃靜置3小時后，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清，凍存管分裝，-80℃冰箱保存。脫頸處死大鼠，冰上取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定。

1.6 觀測指標及檢測方法

1.6.1 一般情況 實驗期間每日觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動、體重及死亡情況并記錄。

1.6.2 各組大鼠血氨和IL-1的表達水平 使用ELISA試劑盒檢測IL-1和血氨的含量，比較各組大鼠IL-1和血氨表達水平，每個指標設(shè)置3次重復(fù)。

1.6.3 血清生化分析 將冷凍的血清樣本回復(fù)至室溫，振蕩混勻，按照試劑盒說明書檢測ALT和AST含量。比較各組大鼠ALT和AST表達水平，每個指標設(shè)置3個重復(fù)。

1.6.4 免疫組化檢測Occludin蛋白和AQP4蛋白的表達 將大鼠腦組織石蠟包埋，切片，脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，加入一抗孵育，加入二抗孵育，顯色，復(fù)染，封片，于顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

藥物干預(yù)過程中，模型組大鼠死亡3只，乳果糖組死亡1只，益木腦液低、中、高劑量組各死亡2、1、1只。對照組大鼠體重增加穩(wěn)定，飲食、飲水、活動、毛發(fā)、大小便均正常; 模型組大鼠造模后體重增加緩慢，逐漸出現(xiàn)飲食、活動減少、毛發(fā)枯黃稀疏、大便稀溏、尿黃，共濟失調(diào)甚至昏迷。進行藥物治療的四組大鼠癥狀較模型組有不同程度改善，進食、活動增多，毛發(fā)逐漸光亮，共濟失調(diào)、昏迷等情況好轉(zhuǎn)，其中益木腦液高劑量組改善最明顯，但與對照組相比仍有差異；各治療組大鼠體重雖有增加，但與模型組相比無明顯差異。由于模型組大鼠剩余6只，故其他組隨機取6組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2.2 各組大鼠血氨、IL-1含量比較

與對照組相比，模型組血氨、IL-1水平均顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，乳果糖組和益木腦液各劑量組血氨、IL-1水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與乳果糖組比較，益木腦液高劑量組血氨、IL-1水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且益木腦液各劑量組存在劑量相關(guān)性。見表1。

表1 各組大鼠血氨、IL-1含量變化

2.3 各組大鼠肝功能比較

與對照組相比，模型組ALT、AST水平均顯著升高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明HE大鼠出現(xiàn)肝損傷；與模型組相比，乳果糖組和益木腦液各劑量組ALT、AST水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與乳果糖組比較，益木腦液高劑量組ALT、AST水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且益木腦液各劑量組存在劑量相關(guān)性。結(jié)果表明益木腦液可以保護肝細胞，改善HE大鼠的肝功能。見表2。

表2 各組大鼠肝功能變化

2.4 免疫組織化學染色觀察益木腦液對肝性腦病大鼠Occludin蛋白和AQP4蛋白表達的影響

對照組Occludin蛋白均勻分布，沿細胞膜連續(xù)表達。與對照組相比，模型組褐色顆粒明顯減少，染色較淺，表達分布不均紊亂。與模型組相比，乳果糖組、益木腦液各劑量組黃色、棕黃色或褐色顆粒明顯增多，Occludin蛋白表達明顯增強。見圖1。

注：A 對照組；B 模型組；C 乳果糖組；D 益木腦液低劑量組；E 益木腦液中劑量組；F 益木腦液高劑量組

對照組AQP4正常表達，呈棕褐或棕黃色。與對照組相比，模型組AQP4表達顯著增多。與模型組相比，乳果糖組、益木腦液各劑量組黃色、棕黃色或褐色顆粒明顯減少，AQP4表達減少。見圖2。

注：A 對照組；B 模型組；C 乳果糖組；D 益木腦液低劑量組；E 益木腦液中劑量組；F：益木腦液高劑量組

3 討論

Occludin蛋白是血腦屏障緊密連接的關(guān)鍵組成部分，其在上皮屏障和血管內(nèi)皮屏障中表達可以穩(wěn)定屏障功能[8]，其表達降低可導(dǎo)致內(nèi)皮細胞凋亡而影響屏障的通透性[9]，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。血腦屏障是腦組織與血液、腦脊液進行物質(zhì)交換的重要結(jié)構(gòu)。Occludin蛋白下調(diào)和移位，使血腦屏障通透性增加，炎癥因子和有毒物質(zhì)從體循環(huán)進入大腦，損害神經(jīng)元功能[10]。氨等有毒物質(zhì)進入大腦，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞腫脹、神經(jīng)炎癥產(chǎn)生，從而造成血腦屏障功能障礙，形成惡性循環(huán)[11]。有研究表明，在肝病過程中，炎癥因子IL-1表達增高，可降低Occludin蛋白表達，影響血腦屏障通透性，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，且氨與炎癥因子起協(xié)同作用，可使神經(jīng)元損傷，加重腦損傷，促使肝性腦病的發(fā)生[12-14]。本實驗結(jié)果顯示，模型組血氨、IL-1表達增多、Occludin蛋白表達減少；益木腦液高劑量組血氨、IL-1表達降低、Occludin蛋白表達明顯回升，提示益木腦液通過抑制炎癥和調(diào)控Occludin蛋白的表達以改善血腦屏障功能。

血腦屏障與膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)在腦內(nèi)廢物運輸和清除方面起互補作用，血腦屏障難以清除的遠距離代謝產(chǎn)物可以通過膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)清除，膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)的調(diào)節(jié)可以提高血腦屏障清除率，二者可通過晝夜節(jié)律協(xié)同清除代謝產(chǎn)物[15]。膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)由血管周圍間隙和主要表達于星形膠質(zhì)細胞的AQP4蛋白組成，AQP4蛋白可以促進腦脊液和間質(zhì)液的交換，并運輸?shù)届o脈血管周圍間隙，通過腦膜淋巴管進入頸深淋巴結(jié)，清除腦內(nèi)可溶性蛋白和代謝產(chǎn)物[16]。AQP4蛋白表達上調(diào)時，可能影響AQP4蛋白極性，使腦脊液聚集于血管周圍間隙，與間質(zhì)液交換速度減慢，導(dǎo)致膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)清除能力降低[17]。星形細胞足突構(gòu)成血腦屏障的最內(nèi)層，其形態(tài)改變是神經(jīng)炎癥標志之一，AQP4蛋白表達增多，毛細血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞腫脹，血腦屏障功能障礙[18]；而炎癥因子也影響腦脊液和間質(zhì)液流動，代謝產(chǎn)物蓄積，損害膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)[15]。研究表明膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)清除功能受損可導(dǎo)致空間學習和認知障礙[19]。實驗結(jié)果顯示，模型組AQP4、IL-1表達增強，而益木腦液高劑量組AQP4、IL-1表達明顯降低，提示益木腦液通過調(diào)控AQP4蛋白表達、減輕神經(jīng)炎癥以保護血腦屏障和膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)，促進腦內(nèi)代謝產(chǎn)物清除，減輕腦損傷。

肝性腦病以意識障礙、行為失常、昏迷等為特征，筆者團隊認為本病由于肝病日久，屬本虛標實，病機為氣虛血瘀、毒熱瘀結(jié)，氣機逆亂，上攻腦竅，遂為肝性腦病，由于下虛上實，因此本病不宜太過攻伐。益木腦液已在臨床廣泛應(yīng)用，其安全性和有效性得到證明[3-4,20]，方中大黃具有抗炎、護肝、腦保護等作用[21]，大黃、芒硝相配可滌腸瀉毒以通腑醒腦開竅，蒲公英清熱解毒，三藥配伍，則邪有出路，清濁自分，腦竅輕清；石菖蒲開竅醒神；煅牡蠣合烏梅可收斂澀腸止瀉，以免太過攻伐而傷正。六藥配伍，有升清降濁之效，起清熱透邪解毒、醒神輕竅之功。本實驗顯示：模型組血氨、IL-1、ALT、AST水平顯著升高，表明肝功能受損、炎癥產(chǎn)生，而益木腦液組肝功能均有不同程度好轉(zhuǎn)，血氨、IL-1水平均下降，表明益木腦液對肝臟具有保護作用。

綜上所述，益木腦液可以改善肝功能，調(diào)控炎癥因子，調(diào)節(jié)Occludin蛋白及AQP4蛋白的表達以改善血腦屏障通透性，改善腦功能，對肝性腦病起治療作用。但本實驗仍存在諸多不足，如未探究死亡大鼠的死因、只從單一機制研究益木腦液對大鼠的影響，而益木腦液作為中藥復(fù)方，其設(shè)計是基于對肝性腦病病癥的整體診斷，并非明確的單一作用機制，因此需要多方面研究，以更清晰地明確其作用機制。