探討益木腦液灌腸對肝性腦病大鼠緊密連接蛋白及水通道蛋白表達(dá)的影響

劉昕艷 周振國 周爍 李京濤 常占杰 柏魯寧

肝性腦病(hepatic encephalopathy ,HE)是各種急慢性肝病晚期常見的死亡原因。由于HE患者腦內(nèi)無明顯的異常結(jié)構(gòu)變化，其發(fā)生難以提前預(yù)測。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療本病除肝移植外，現(xiàn)仍以對癥、支持治療為主[1-2]，而中醫(yī)以其獨特的整體觀念及辨證論治理論體系，在HE的治療上取得了一定成果。益木腦液是筆者團隊的常用方，具有通腑瀉熱、宣暢氣機、醒腦開竅等功效，在臨床應(yīng)用中取得良好效果[3-4]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)益木腦液灌腸能夠有效提高HE大鼠空間定位及學(xué)習(xí)等認(rèn)知能力，但具體機制尚不明確[5]。既往研究發(fā)現(xiàn), 血腦屏障受損和膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)功能障礙與大鼠認(rèn)知功能障礙相關(guān)，且血腦屏障和膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)在大腦的代謝產(chǎn)物清除過程中起到互補作用[6]。緊密連接蛋白(tight junction protein occludin，Occludin)的表達(dá)與包括血腦屏障在內(nèi)的多種屏障的通透性相關(guān)；水通道蛋白4(recombinant Aquaporin 4，AQP4)的表達(dá)與腦內(nèi)液體流動密切相關(guān)，是膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)重要組成部分，其變化可以影響大腦代謝產(chǎn)物清除。在此基礎(chǔ)上，本實驗采用 50% 的四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)聯(lián)合硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)建立HE大鼠模型，觀察益木腦液保留灌腸對HE大鼠血氨、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、血清天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)以及Occludin蛋白、AQP4蛋白表達(dá)的影響，探究其治療肝性腦病的作用機制，以期為臨床應(yīng)用益木腦液治療肝性腦病提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠72只，雄性，8周齡，體質(zhì)量(210±20)g，購自成都達(dá)碩實驗動物有限公司[許可證號: SCXK(川)2020-030]，于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心以正常光照節(jié)律及適宜濕度溫度飼養(yǎng)，大鼠自由飲食、飲水及活動。適應(yīng)性飼養(yǎng)7天。

1.2 試劑與儀器

益木腦液組方：生大黃 30 g、蒲公英 30 g、石菖蒲 30 g、烏梅 30 g、煅牡蠣 20 g、芒硝 20 g，中藥購自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，將中藥煎煮后濃縮為每克含生藥8 g的凍干粉，凍干粉于4℃冰箱中密封冷藏保存，使用時100℃水溶解。

TAA(中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司，批號：YH21010802); CCl4(阿拉丁，批號：C128126)；乳果糖(北京韓美藥業(yè)有限公司，批號：20050005)；血氨、ALT、AST試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為：A086-1-1, C009-2-1、C010-2-1)；IL-1試劑盒(深圳海思安生物技術(shù)有限公司，貨號：SZ-HAS-290)；AQP4、Occludin、即用型SABC-POD試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號分別為：ZP2011BP11、GR3243495-9、SA1022)。

儀器：包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5)，石蠟切片機(上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016)，酶標(biāo)儀(雷杜生命科技有限公司，型號：RT-6100)，顯微鏡(Nikon公司，型號：E100)。

1.3 動物分組及造模

參考宋佰玉[7]的造模方法，建立肝性腦病大鼠模型。從72只SD大鼠中隨機選取10只大鼠為對照組，其余62只大鼠為模型組。模型組按5 mL/kg給予 50% CCl4溶劑(50 mL橄欖油+50 mL CCl4)行腹腔注射，每周兩次，根據(jù)體重變化調(diào)整劑量，共12周。第13周按 300 mg/kg給予3% TAA 溶液隔日行腹腔注射，隔天1次，連續(xù)2次，對照組大鼠給予等量橄欖油腹腔注射。若大鼠出現(xiàn)嗜睡、反應(yīng)遲緩，自主活動減少、共濟失調(diào)、昏迷等癥狀之一，可以判斷造模成功。造模過程中，模型組大鼠死亡17只，對照組未出現(xiàn)死亡。將造模成功的45只SD大鼠隨機分為模型組、乳果糖組和益木腦液低、中、高劑量組，每組9只。

1.4 藥物干預(yù)

按照成人的用藥劑量的200%、100%、50% 設(shè)置益木腦液高、中、低劑量組。乳果糖組按5.63 mL/kg 的劑量給予乳果糖灌腸，益木腦液低、中、高劑量組分別以 0.56 g/kg、1.12 g/kg、2.24 g/kg的劑量給予益木腦液灌腸，對照組及模型組給予等量蒸餾水灌腸，給藥體積均按5 mL/kg計，灌腸后提起大鼠尾部并捏緊肛門，使大鼠倒置提起2～3分鐘，防止液體漏出，使腸腔充分吸收，每日1次，連續(xù)給藥2周。

1.5 取材方法

大鼠末次腹腔注射TAA后，禁食不禁水12小時，次日采用20%烏拉坦(1 g/kg)對大鼠進行麻醉，腹主動脈取血，血液一部分予以肝素鈉抗凝，并在0.5小時內(nèi)檢測血氨水平；剩余血液于4℃靜置3小時后，以3000 r/min轉(zhuǎn)速離心，取上清，凍存管分裝，-80℃冰箱保存。脫頸處死大鼠，冰上取大鼠腦組織，4%多聚甲醛固定。

1.6 觀測指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 一般情況 實驗期間每日觀察各組大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動、體重及死亡情況并記錄。

1.6.2 各組大鼠血氨和IL-1的表達(dá)水平 使用ELISA試劑盒檢測IL-1和血氨的含量，比較各組大鼠IL-1和血氨表達(dá)水平，每個指標(biāo)設(shè)置3次重復(fù)。

1.6.3 血清生化分析 將冷凍的血清樣本回復(fù)至室溫，振蕩混勻，按照試劑盒說明書檢測ALT和AST含量。比較各組大鼠ALT和AST表達(dá)水平，每個指標(biāo)設(shè)置3個重復(fù)。

1.6.4 免疫組化檢測Occludin蛋白和AQP4蛋白的表達(dá) 將大鼠腦組織石蠟包埋，切片，脫蠟，抗原修復(fù)，封閉，加入一抗孵育，加入二抗孵育，顯色，復(fù)染，封片，于顯微鏡下觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

藥物干預(yù)過程中，模型組大鼠死亡3只，乳果糖組死亡1只，益木腦液低、中、高劑量組各死亡2、1、1只。對照組大鼠體重增加穩(wěn)定，飲食、飲水、活動、毛發(fā)、大小便均正常; 模型組大鼠造模后體重增加緩慢，逐漸出現(xiàn)飲食、活動減少、毛發(fā)枯黃稀疏、大便稀溏、尿黃，共濟失調(diào)甚至昏迷。進行藥物治療的四組大鼠癥狀較模型組有不同程度改善，進食、活動增多，毛發(fā)逐漸光亮，共濟失調(diào)、昏迷等情況好轉(zhuǎn)，其中益木腦液高劑量組改善最明顯，但與對照組相比仍有差異；各治療組大鼠體重雖有增加，但與模型組相比無明顯差異。由于模型組大鼠剩余6只，故其他組隨機取6組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2.2 各組大鼠血氨、IL-1含量比較

與對照組相比，模型組血氨、IL-1水平均顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，乳果糖組和益木腦液各劑量組血氨、IL-1水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與乳果糖組比較，益木腦液高劑量組血氨、IL-1水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且益木腦液各劑量組存在劑量相關(guān)性。見表1。

表1 各組大鼠血氨、IL-1含量變化

2.3 各組大鼠肝功能比較

與對照組相比，模型組ALT、AST水平均顯著升高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明HE大鼠出現(xiàn)肝損傷；與模型組相比，乳果糖組和益木腦液各劑量組ALT、AST水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與乳果糖組比較，益木腦液高劑量組ALT、AST水平顯著降低，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且益木腦液各劑量組存在劑量相關(guān)性。結(jié)果表明益木腦液可以保護肝細(xì)胞，改善HE大鼠的肝功能。見表2。

表2 各組大鼠肝功能變化

2.4 免疫組織化學(xué)染色觀察益木腦液對肝性腦病大鼠Occludin蛋白和AQP4蛋白表達(dá)的影響

對照組Occludin蛋白均勻分布，沿細(xì)胞膜連續(xù)表達(dá)。與對照組相比，模型組褐色顆粒明顯減少，染色較淺，表達(dá)分布不均紊亂。與模型組相比，乳果糖組、益木腦液各劑量組黃色、棕黃色或褐色顆粒明顯增多，Occludin蛋白表達(dá)明顯增強。見圖1。

注：A 對照組；B 模型組；C 乳果糖組；D 益木腦液低劑量組；E 益木腦液中劑量組；F 益木腦液高劑量組

對照組AQP4正常表達(dá)，呈棕褐或棕黃色。與對照組相比，模型組AQP4表達(dá)顯著增多。與模型組相比，乳果糖組、益木腦液各劑量組黃色、棕黃色或褐色顆粒明顯減少，AQP4表達(dá)減少。見圖2。

注：A 對照組；B 模型組；C 乳果糖組；D 益木腦液低劑量組；E 益木腦液中劑量組；F：益木腦液高劑量組

3 討論

Occludin蛋白是血腦屏障緊密連接的關(guān)鍵組成部分，其在上皮屏障和血管內(nèi)皮屏障中表達(dá)可以穩(wěn)定屏障功能[8]，其表達(dá)降低可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而影響屏障的通透性[9]，與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。血腦屏障是腦組織與血液、腦脊液進行物質(zhì)交換的重要結(jié)構(gòu)。Occludin蛋白下調(diào)和移位，使血腦屏障通透性增加，炎癥因子和有毒物質(zhì)從體循環(huán)進入大腦，損害神經(jīng)元功能[10]。氨等有毒物質(zhì)進入大腦，導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、神經(jīng)炎癥產(chǎn)生，從而造成血腦屏障功能障礙，形成惡性循環(huán)[11]。有研究表明，在肝病過程中，炎癥因子IL-1表達(dá)增高，可降低Occludin蛋白表達(dá)，影響血腦屏障通透性，導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙，且氨與炎癥因子起協(xié)同作用，可使神經(jīng)元損傷，加重腦損傷，促使肝性腦病的發(fā)生[12-14]。本實驗結(jié)果顯示，模型組血氨、IL-1表達(dá)增多、Occludin蛋白表達(dá)減少；益木腦液高劑量組血氨、IL-1表達(dá)降低、Occludin蛋白表達(dá)明顯回升，提示益木腦液通過抑制炎癥和調(diào)控Occludin蛋白的表達(dá)以改善血腦屏障功能。

血腦屏障與膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)在腦內(nèi)廢物運輸和清除方面起互補作用，血腦屏障難以清除的遠(yuǎn)距離代謝產(chǎn)物可以通過膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)清除，膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)的調(diào)節(jié)可以提高血腦屏障清除率，二者可通過晝夜節(jié)律協(xié)同清除代謝產(chǎn)物[15]。膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)由血管周圍間隙和主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP4蛋白組成，AQP4蛋白可以促進腦脊液和間質(zhì)液的交換，并運輸?shù)届o脈血管周圍間隙，通過腦膜淋巴管進入頸深淋巴結(jié)，清除腦內(nèi)可溶性蛋白和代謝產(chǎn)物[16]。AQP4蛋白表達(dá)上調(diào)時，可能影響AQP4蛋白極性，使腦脊液聚集于血管周圍間隙，與間質(zhì)液交換速度減慢，導(dǎo)致膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)清除能力降低[17]。星形細(xì)胞足突構(gòu)成血腦屏障的最內(nèi)層，其形態(tài)改變是神經(jīng)炎癥標(biāo)志之一，AQP4蛋白表達(dá)增多，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，血腦屏障功能障礙[18]；而炎癥因子也影響腦脊液和間質(zhì)液流動，代謝產(chǎn)物蓄積，損害膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)[15]。研究表明膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)清除功能受損可導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)和認(rèn)知障礙[19]。實驗結(jié)果顯示，模型組AQP4、IL-1表達(dá)增強，而益木腦液高劑量組AQP4、IL-1表達(dá)明顯降低，提示益木腦液通過調(diào)控AQP4蛋白表達(dá)、減輕神經(jīng)炎癥以保護血腦屏障和膠質(zhì)淋巴系統(tǒng)，促進腦內(nèi)代謝產(chǎn)物清除，減輕腦損傷。

肝性腦病以意識障礙、行為失常、昏迷等為特征，筆者團隊認(rèn)為本病由于肝病日久，屬本虛標(biāo)實，病機為氣虛血瘀、毒熱瘀結(jié)，氣機逆亂，上攻腦竅，遂為肝性腦病，由于下虛上實，因此本病不宜太過攻伐。益木腦液已在臨床廣泛應(yīng)用，其安全性和有效性得到證明[3-4,20]，方中大黃具有抗炎、護肝、腦保護等作用[21]，大黃、芒硝相配可滌腸瀉毒以通腑醒腦開竅，蒲公英清熱解毒，三藥配伍，則邪有出路，清濁自分，腦竅輕清；石菖蒲開竅醒神；煅牡蠣合烏梅可收斂澀腸止瀉，以免太過攻伐而傷正。六藥配伍，有升清降濁之效，起清熱透邪解毒、醒神輕竅之功。本實驗顯示：模型組血氨、IL-1、ALT、AST水平顯著升高，表明肝功能受損、炎癥產(chǎn)生，而益木腦液組肝功能均有不同程度好轉(zhuǎn)，血氨、IL-1水平均下降，表明益木腦液對肝臟具有保護作用。

綜上所述，益木腦液可以改善肝功能，調(diào)控炎癥因子，調(diào)節(jié)Occludin蛋白及AQP4蛋白的表達(dá)以改善血腦屏障通透性，改善腦功能，對肝性腦病起治療作用。但本實驗仍存在諸多不足，如未探究死亡大鼠的死因、只從單一機制研究益木腦液對大鼠的影響，而益木腦液作為中藥復(fù)方，其設(shè)計是基于對肝性腦病病癥的整體診斷，并非明確的單一作用機制，因此需要多方面研究，以更清晰地明確其作用機制。