鞏膜膠原交聯防治病理性近視有效性及安全性的研究進展

呂文超,梁 甜,王麗娜,閆春妮,晁媛媛,宋金鑫

0 引言

高度近視(high myopia,HM)的患病率相當高,有研究估計,到2050年全球將會有接近10億高度近視人群[1]。近視(myopia)因為可以通過光學手段被矯正而通常被認為是可以“治愈”的疾病,現今也有一些很好的近視防控措施如增加戶外運動的時間、配戴角膜塑形鏡、滴用低濃度阿托品等來減緩近視屈光度數的增長,但由于遺傳及環(huán)境的因素,一部分近視患者對現有的近視防控手段并不敏感,屈光度及眼軸增長很快,隨著年齡的增長,最終發(fā)生病理性近視(pathologic myopia,PM),容易出現嚴重損傷視力的并發(fā)癥,如孔源性視網膜脫離、跨越黃斑中心的漆裂紋、高度近視性脈絡膜新生血管等。當發(fā)生病理性近視的風險較高,對控制眼軸增長的常規(guī)保守方法不敏感時,可以通過外科手段如后鞏膜加固術、鞏膜膠原交聯來延緩從高度近視到病理性近視的發(fā)展[2]。研究表明,鞏膜膠原交聯可以有效加固鞏膜,改善鞏膜的生物力學性能,在減緩眼軸增長方面取得了良好的效果。本文就鞏膜膠原物理交聯和京尼平化學交聯做一綜述來探討該方法防治病理性近視的有效性及安全性。

1 鞏膜的組成及各成分的功能

眼軸的拉長涉及到對控制眼球形狀起決定性作用的鞏膜組織的重塑與生物力學的改變。鞏膜組織是一種典型的結締組織,從力學的角度來說,它也是一種彈性組織[3],由細胞外基質和分泌基質的成纖維細胞組成。細胞外基質主要包含膠原、蛋白多糖、糖蛋白、基質金屬蛋白酶和彈性蛋白等成分[4]。人鞏膜組織成分中含有約一半的膠原,主要為I型膠原[5],膠原賦予鞏膜組織強大的抗拉伸能力,蛋白多糖參與調節(jié)膠原纖維的組裝與排列,鞏膜中的糖蛋白促進細胞在細胞基質上附著,基質金屬蛋白酶在鞏膜組織的重塑中發(fā)揮重要作用,負責降解細胞外基質蛋白,維持著細胞外基質降解與合成的動態(tài)平衡,彈性纖維主要負責組織的延伸性。馬凡綜合征患者由于缺乏一種編碼纖維蛋白的基因FBN1,其鞏膜彈性纖維的發(fā)育受到影響[6],導致其容易發(fā)生高度近視。

2 高度近視鞏膜及交聯后的超微變化

正常鞏膜與高度近視鞏膜最明顯的差異分別是膠原束結構、纖維直徑分布和纖維形態(tài)[7-8]。電鏡下觀察到,正常鞏膜膠原束或緊密交織或呈板層排列,以交織型為主,而高度近視眼鞏膜膠原束排列幾乎均為板層狀,且每一層都比正常薄很多;正常鞏膜纖維直徑范圍為40～280nm,高度近視鞏膜纖維直徑范圍為10～250nm,較正常鞏膜纖維更細,纖維直徑離散度增大,表現為更加粗細不均;高度近視性鞏膜橫斷面呈星狀的纖維較正常鞏膜明顯增多,此外,還有大量細小的纖維團嵌入膠樣物質中,且不能被分離出來,所有這些變化可能歸因于高度近視鞏膜纖維間蛋白多糖成分的紊亂[7]。

膠原交聯指在一定條件誘導下,增加膠原分子內部和膠原分子間的共價鍵結合,從而提高膠原纖維的張力和穩(wěn)定性。因作用原理不同,膠原交聯分為物理交聯和化學交聯。核黃素/紫外線A交聯為物理交聯,該反應過程依據是否依賴氧可分為兩種類型,Ⅰ型為不依賴氧,Ⅱ型為依賴氧。紫外線A照射的最初15s內,發(fā)生的交聯反應為Ⅱ型,核黃素作為光敏劑被紫外線A激發(fā)到三線態(tài),產生活性氧族,促使膠原纖維間發(fā)生化學交聯反應,大約15s后,內源性氧氣被消耗殆盡,更緩慢的Ⅰ型-不依賴氧交聯反應占據主導,此時被激活的核黃素直接與膠原分子發(fā)生反應,使得膠原纖維的機械強度增加[9]。與核黃素/紫外線A交聯原理不同,化學交聯劑不需要光激活,直接與鞏膜膠原纖維發(fā)生交聯反應。膠原交聯可以使鞏膜膠原纖維網發(fā)生結構改變。經Masson三重染色、掃描電鏡觀察、原子力顯微鏡分析發(fā)現核黃素聯合370nm紫外光交聯后鞏膜間質膠原密度增加33.48%,纖維間隙密度降低了14.83%,同時發(fā)現鞏膜膠原纖維在交聯前呈平行排列,交聯后鞏膜表面纖維交織纏繞[10]。Guo等[11]通過405nm激光激發(fā)核黃素交聯大鼠鞏膜,采用雙光子顯微鏡完成二次諧波成像,同樣觀察到鞏膜交聯后膠原束更加雜亂更加致密。Rong等[12]從電鏡結果觀察到與單純形覺剝奪近視組相比,核黃素/紫外線A鞏膜交聯組和空白對照組均表現出旺盛的膠原蛋白代謝,鞏膜成纖維細胞中有大量的膠原合成,交聯治療后的兔鞏膜膠原纖維直徑大于單純形覺剝奪近視組鞏膜,在Lai等[13]對透鏡誘導豚鼠近視前后行核黃素/紫外線A鞏膜交聯效果比較的研究中觀察到了同樣的結果。

3 鞏膜膠原物理交聯

3.1核黃素/紫外線A鞏膜交聯2003年Wollensak等[14]首次將核黃素/紫外線A角膜交聯運用至臨床,在阻止圓錐角膜進展方面取得了良好的效果,2004年Wollensak和Spoerl[15]首次發(fā)現核黃素/紫外線A交聯鞏膜可以提高鞏膜的生物力學性能,提出鞏膜膠原交聯可能在阻止近視進展方面發(fā)揮作用。以往關于鞏膜膠原物理交聯的研究以體外或體內兔、豬、豚鼠實驗為主,結果發(fā)現核黃素/紫外線A交聯方法能夠有效提高鞏膜的生物力學性能,延緩眼軸的延長,通過對交聯方法的改進,該技術對動物眼產生的不良反應較小。近年來有研究以恒河猴為鞏膜膠原交聯方法的動物模型,恒河猴眼與人眼解剖結構相似,研究結果更接近人體實際情況。恒河猴鞏膜膠原交聯采用的是核黃素/紫外線A交聯傳統(tǒng)方案(核黃素濃度0.1%,波長365nm,照射部位為赤道部鞏膜,照射強度3.0mW/cm2,照射時間30min,總能量5.4J/cm2,距鞏膜表面5cm),結果發(fā)現術后3mo期間,在眼壓、眼軸長度、中央角膜厚度、前房深度、晶狀體厚度、玻璃體腔深度和視網膜電圖波形、波幅方面,實驗組并沒有受到核黃素/紫外線A交聯的影響,鞏膜交聯后增強的鞏膜生物力學性能在術后1a仍可以保持,核黃素/紫外線A鞏膜交聯不影響視網膜中央厚度、脈絡膜厚度以及視網膜中央淺血管網血流密度,也未觀察到視網膜發(fā)生損傷[16-17]。

滲透在鞏膜組織的核黃素不僅能促進鞏膜膠原交聯,還能吸收多余的光能量保護視網膜和脈絡膜免受光損傷。離子導入技術可以增強鞏膜組織對藥物的滲透性,Rong等[12]通過長期形覺剝奪建立兔子近視模型,一半數量的兔子行右眼360度結膜切開術后,再通過離子導入和改良后的核黃素/紫外線A照射方法(核黃素濃度0.1%,波長370nm,照射部位為上直肌肌止點與視神經間直徑9mm的鞏膜表面,照射強度由傳統(tǒng)的3.0mW/cm2提高到10mW/cm2,照射時間由30min縮短到9min,距鞏膜表面5.4cm)進行鞏膜膠原交聯術,另一半數量的兔子單純行右眼360度結膜切開術。將所有兔子依據術后1、10d,1、3mo分為4組,單軸機械拉伸結果示鞏膜交聯術能提高鞏膜的生物力學性能,術后4個時間點的極限應力、楊氏模量和生理楊氏模量均顯著增加,眼軸測量結果示鞏膜交聯術控制眼軸伸長的效果明顯,術后1mo眼軸伸長得到控制,術后3mo眼軸長度與未近視的左眼眼軸長度相比無統(tǒng)計學差異。術后4組鞏膜、脈絡膜和視網膜HE染色均未發(fā)現結構改變。但因該研究沒有設立對照組,所以在鞏膜交聯效果及安全性方面,離子導入技術聯合改良的核黃素/紫外線A照射方法是否優(yōu)于傳統(tǒng)照射方法尚不能明確。

Lai等[13]發(fā)現負透鏡誘導豚鼠近視前進行核黃素/紫外線A鞏膜膠原交聯同樣可以控制近視增長,延緩眼軸伸長,且在同年齡組間,近視程度低于近視后再進行鞏膜交聯組,因其對近視進展的延緩作用隨年齡增長逐漸減弱,其長期控制近視的效果尚需進一步研究。

3.2藍光核黃素鞏膜交聯由于核黃素在460nm藍光處存在吸收峰,且藍光比紫外線波長更長、組織穿透力更強、因此藍光核黃素交聯更容易交聯到鞏膜深層膠原,此外,藍光的光子能量更小[18],血液對藍光的吸收量較高[19],富含血管的脈絡膜組織成為光屏障,阻止視網膜發(fā)生損傷。Iseli等[20]首次將465nm藍光聯合0.5%核黃素交聯應用到在體兔鞏膜,該技術可以增強鞏膜硬度,且沒有觀察到視網膜發(fā)生損傷。

成年兔鞏膜藍光核黃素膠原交聯的藍光損傷閾值可以達到240～480J/cm2(200～400mW/cm2)[21],超出閾值外,可見視網膜感光細胞變性和(或)鞏膜膠原改變,而成年兔鞏膜交聯的紫外線A損傷閾值為5.4J/cm2,遠遠低于兔鞏膜膠原交聯藍光損傷閾值。理論上與核黃素/紫外線A鞏膜交聯相比,藍光核黃素交聯顯示出它特有的優(yōu)勢,對在體兔鞏膜藍光核黃素交聯的研究也沒有觀察到嚴重的視網膜副作用。近年來,關于藍光核黃素恒河猴鞏膜膠原交聯的研究中肯定了該技術可以增強鞏膜的生物力學性能,但也觀察到了一些不良反應。

Li等[22]對恒河猴鞏膜進行藍光核黃素膠原交聯,交聯方案為波長460nm的藍光,核黃素濃度0.5%,照射強度22.5mW/cm2,照射時間20min,距鞏膜表面5cm,結果發(fā)現該技術對恒河猴視網膜和脈絡膜厚度、視網膜血管密度均無影響,但對視網膜功能有影響,實驗組閃光視網膜電圖暗適應和明適應波幅均表現為一過性降低,電鏡結果觀察到實驗組廣泛的視網膜感光細胞排列紊亂,其內的線粒體腫脹,部分細胞核固縮。Li等[23]另一項有關藍光核黃素恒河猴鞏膜膠原交聯的研究,觀察了交聯術后1a的生物力學效果和副作用,結果雖肯定了藍光核黃素鞏膜膠原交聯的長期效果,但視網膜組織電鏡結果同樣發(fā)現了超微結構的改變,術后1a較術后1wk視網膜結構有所恢復,視錐視桿細胞排列相對整齊,卻仍可觀察到部分細胞核固縮。發(fā)生該不良反應的原因可能是恒河猴鞏膜較薄,藍光組織穿透力更強,穿過深層鞏膜后可能更容易損傷到視網膜細胞。而高度近視人眼鞏膜及脈絡膜血管層變薄,未來的研究可能需要關注到藍光交聯對視網膜組織損害的問題。有關恒河猴的研究樣本量較少,目前也沒有設立近視模型實驗組,藍光核黃素鞏膜膠原交聯的有效性和安全性需進一步探索。

4 鞏膜膠原京尼平化學交聯

目前鞏膜膠原化學交聯劑研究較多的有甘油醛、京尼平、戊二醛、無環(huán)β硝基醇、甲醛緩釋體類釋放劑等,其中京尼平是從梔子中提取的天然物質,它具有低毒性、良好的生物兼容性等特性,與丙酮醛、甘油醛相比,京尼平交聯鞏膜的效率更高。有研究采用全眼球充氣測試對三種鞏膜交聯劑在離體大鼠鞏膜上的療效進行量化,同樣將鞏膜硬度增加1倍,丙酮醛和甘油醛需要的劑量分別是京尼平的7倍和30倍[24]。體外實驗表明,京尼平角膜交聯對豬內皮細胞的損傷與核黃素紫外線角膜交聯相似,遠低于戊二醛對角膜內皮細胞的毒性[25]。該交聯劑會使組織變?yōu)樗{色,通過觀察鞏膜顏色的深淺可以判斷生物力學性能提高的程度[26]。

京尼平作為化學交聯劑需要被溶解注射至鞏膜表面,流動的液體其交聯范圍不容易確定,為此Zyablitskaya等[27]以Tenon囊下注射交聯劑部位為中心把離體兔眼鞏膜表面分成16個象限,交聯完成后,切取各象限鞏膜片,利用差式掃描量熱儀對每個象限進行單獨的分析,結果發(fā)現交聯劑對鞏膜交聯的影響是局部化的,主要發(fā)生在注射部位附近,交聯劑的濃度越高,局部化交聯區(qū)域越大,交聯效果越好。此外,由于經京尼平交聯過的鞏膜可以自發(fā)熒光,熒光強度與生物力學性能密切相關,Hannon等[28]通過表觀熒光顯微鏡確認球后注射京尼平溶液的眼球后鞏膜得到了交聯。

4.1有效性Wang等[29]首次研究了京尼平對減緩近視進展的作用,通過形覺剝奪建立豚鼠近視模型,分別在形覺剝奪后第0、7、14d Tenon囊下注射0.1mL 22.1mmol/L京尼平溶液,注射位置角膜緣后3mm,結果發(fā)現京尼平注射組的近視屈光度和眼軸伸長率顯著低于單純形覺剝奪組,通過電鏡觀察到京尼平注射組鞏膜纖維直徑較單純形覺剝奪組明顯增粗。Liu等[30]在活體兔眼鼻上象限角膜緣后3mm處Tenon囊下注射0.5mL 0.5mmol/L京尼平溶液,2wk內注射4次,每次間隔2～3d,單軸拉伸測試結果發(fā)現,京尼平處理組的生物力學性能提高顯著,在應變?yōu)?0%的情況下,京尼平處理過的鞏膜條比未處理的鞏膜條極限應力和彈性模量分別增加130%和303%。趙亞芳等[31]通過縫合幼兔眼瞼建立近視模型,實驗組在形覺剝奪期間于角膜緣后3mm Tenon囊下注射0.25mL 0.5mmol/L京尼平溶液,共注射4次,每次間隔1d,第1、3次注射部位為鼻上1∶00位而第2、4次于顳下7∶00位注射,鞏膜條帶拉伸結果同樣表明與空白對照組和近視模型組相比,實驗組鞏膜條帶生物力學性能明顯提高。

京尼平交聯鞏膜的治療效果是存在劑量依賴的,El Hamdaoui等[32]建立了形覺剝奪性樹鼠近視模型,使用鈍彎針將0.4mL京尼平溶液注射至鞏膜正后方Tenon囊下,每隔1d在一只眼上進行3次或5次0、10、20mmol/L京尼平溶液注射,另一只眼作為對照組,結果發(fā)現,京尼平注射量越大,注射越頻繁,延緩近視屈光度和眼軸增長的作用越強。由于多次注射京尼平交聯劑可能會限制臨床應用的可操作性及增加發(fā)生不良反應的風險,Hannon等[28]采用大鼠全眼球充氣測試研究了單次球后注射150μL 15mmol/L的京尼平溶液鞏膜硬度能否在4wk后得以維持,結果發(fā)現在注射4wk后,注射組的鞏膜應變較對照組明顯降低。

后鞏膜收縮或加固術可以用來控制眼軸伸長,治療高度近視牽拉性黃斑病變,但可能由于用來加固的供體鞏膜條在體內發(fā)生降解,條帶退化,抗拉強度降低,使得手術效果并不明顯。Xue等[33]對30例高度近視患者行后鞏膜加固術,術中使用的鞏膜條帶沒有被交聯,術后隨訪2a半,控制眼軸增長的效果并不明顯,術眼組平均眼軸伸長為0.75mm,而對側眼平均眼軸伸長0.94mm。Xue等[34]首次將京尼平作為鞏膜交聯劑應用至臨床,該團隊行體外兔鞏膜實驗證明了京尼平交聯鞏膜可以增強鞏膜的抗拉強度,抵抗酶的降解,隨后進行了在體研究,將供體鞏膜放在0.1%的京尼平和37.5%的乙醇混合液中浸泡,納入40例3～17歲高度近視的患者,其中一只眼用京尼平交聯過的鞏膜條行后鞏膜收縮或加固術,另一只眼不做處理,結果發(fā)現在隨訪期2～3a內,對側眼眼軸凈增長0.82mm,相當于術眼眼軸增長(0.32mm)的2.5倍。Su等[35]對20例高度近視患者共30眼行后鞏膜收縮術來控制眼軸增長,術中使用的鞏膜條帶浸泡過京尼平溶液,隨訪至少2a,術后2a眼軸長度得到有效控制,等效球鏡度數增長量明顯降低。

在動物實驗中Tenon囊下或球后注射京尼平溶液能夠提高鞏膜的生物力學參數,延緩眼軸伸長,在臨床研究中將后鞏膜收縮或加固術與京尼平交聯鞏膜術聯合,疊加了兩種方法的優(yōu)勢,既可以減慢供體鞏膜條帶的降解速度,也避免了因化學鞏膜交聯劑液體流動范圍大,影響到周圍的筋膜或肌肉組織,現有的研究證明了該方法能夠有效延緩高度近視患者眼軸增長,未來的研究可以更加關注鞏膜條帶浸泡京尼平濃度、浸泡時間等最佳交聯參數以及多方法觀察其長期安全性。

4.2安全性Wang等[29]和Liu等[30]對Tenon囊下注射過京尼平溶液的鞏膜進行組織學染色后,均沒有觀察到京尼平注射組的視網膜和脈絡膜發(fā)生損傷。El Hamdaoui等[32]關注了樹鼠Tenon囊下注射京尼平溶液后對其前房深度、角膜和晶狀體厚度的影響,結果發(fā)現京尼平注射組的前房變淺、角膜和晶狀體厚度增厚,不良反應呈劑量依賴性。隨后Hamdaoui等[36]研究了京尼平交聯樹鼠鞏膜對其視網膜結構與功能的影響,光學相干斷層掃描結果顯示與對照組相比,所有京尼平處理組均觀察到視網膜神經纖維層明顯變薄,視網膜電圖結果發(fā)現京尼平高劑量組會對b波的幅值有明顯的影響,使其顯著降低,組織學染色高劑量組有樣本觀察到視網膜內層變薄,光感受器和視網膜色素上皮細胞發(fā)生變性。上述El Hamdaoui等[32]的兩項研究的最大劑量20mmol/L與Wang等[29]的研究中京尼平的劑量類似,而Wang等[29]的研究中僅觀察到注射部位周邊的角膜和鞏膜出現輕微的可逆的副作用,考慮El Hamdaoui等[32]發(fā)現的不良反應是否可能與注射間隔時間過短有關,導致京尼平毒性的急劇累積,在以后的研究中可能需要更加仔細的考量注射的間隔時間。Hannon等[37]對挪威大鼠行單次球后注射150μL 15mmol/L京尼平溶液產生的不良反應進行研究,其中眼壓、視運動反應和視網膜電圖結果均未顯示與對照組有差異,京尼平注射組觀察到大鼠眼的神經節(jié)細胞軸突數較對照組下降,雖未達到統(tǒng)計學差異,但應引起重視,這與El Hamdaoui等[32]觀察到的視網膜神經纖維層明顯變薄相符,未來的研究應注意京尼平注射濃度和頻次對視網膜神經節(jié)細胞軸突數量的影響。

在關于京尼平交聯鞏膜的臨床研究中,Zhu等[38]納入21例沒有發(fā)生黃斑裂孔的高度近視性黃斑脫離和或視網膜劈裂患者,共計24眼,使用0.1%京尼平溶液交聯過的鞏膜條帶進行后鞏膜加固術治療,術后連續(xù)隨訪至少1a,因手術本身通過縮短眼軸使視網膜再附著產生視網膜微皺褶,術后早期患者訴視物變形,除此之外,未觀察到其他并發(fā)癥。Xue等[34]和Su等[35]對高度近視患者行后鞏膜加固或收縮術聯合京尼平鞏膜交聯術,術后早期部分患者訴視物變形,除此之外,未觀察到視神經損害或感染等嚴重不良反應。He等[39]對發(fā)生近視牽拉性黃斑病變的32眼行后鞏膜加固術聯合京尼平交聯鞏膜,不良反應同Zhu等[38]的報道,視物變形隨視網膜的再次貼合修復逐漸消失,沒有出現術后嚴重的并發(fā)癥。

5 總結與展望

現有關于物理交聯在體鞏膜膠原的研究選取的是赤道鞏膜,而高度近視眼后鞏膜容易發(fā)生葡萄腫,但后鞏膜比較深不容易被照射到,未來或許可以借助光導纖維等新技術使紫外光到達后鞏膜來實現更好的交聯;研究發(fā)現藍光核黃素恒河猴鞏膜膠原交聯會使視網膜細胞受到損傷,后續(xù)的研究需改善交聯的條件,并且關注交聯對視網膜細胞的影響;已有實驗數據表明Tenon囊下或球后注射京尼平化學交聯鞏膜膠原方法,可以有效減緩眼軸伸長且可以交聯到后鞏膜,但它靶向性相對較差,需要考慮化學交聯劑如何更加精準到達目標鞏膜及減少對周圍肌肉、筋膜組織的影響;對于有后鞏膜加固或收縮手術指征的高度近視患者,先對鞏膜條帶進行物理或化學交聯,然后進行后鞏膜加固或收縮術可能會是更好的選擇。