痛瀉要方合四逆散對糖尿病KK-Ay小鼠胰島素抵抗及PI3K/AKT/GSK-3β通路的影響*

胡浩，賈曉蕾

（1.北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院內分泌科，北京 100078；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

胰島素抵抗是指胰島素作用的靶器官對胰島素作用的敏感性下降，作為2型糖尿病的主要特征，目前多認為其是2型糖尿病的始動因素[1]。肝臟與胰島素抵抗密切相關，肝臟是胰島素從胰腺分泌后到達的第一器官，肝臟根據人體對胰島素的需求調節(jié)葡萄糖的存儲和處置，有多種調節(jié)肝臟胰島素信號傳導的機制[2]。而肝和全身胰島素抵抗形成代謝綜合征的核心，代謝綜合征也與心血管異常，炎癥和血脂異常有關[1-2]。磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（AKT）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）是胰島素信號傳導通路下游的幾個關鍵蛋白，它們的代謝改變可以影響胰島素抵抗的發(fā)生[3]。研究發(fā)現通過調節(jié)PI3K/AKT/GSK-3β信號通路可以明顯改善糖代謝并改善糖耐量[4-5]。痛瀉藥方合四逆散由炒白術，白芍，陳皮，防風，柴胡等藥物組成，為中醫(yī)疏肝健脾治法的代表方。臨床上采用疏肝健脾治法在改善糖尿病患者相關癥狀有較好的療效，并具有一定降糖作用[6]。前期亦有研究發(fā)現加味四逆散可以有效改善糖尿病患者的血糖，降低低密度脂蛋白膽固醇和三酰甘油水平，改善血脂紊亂[7]。同時降低丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶及總膽紅素水平，改善肝臟功能[8]。但是痛瀉藥方合并四逆散對糖尿病胰島素抵抗的影響及作用機制尚缺乏相關研究。肥胖的KK-Ay小鼠為自發(fā)性2型糖尿病模型小鼠，是研究胰島素抵抗的理想動物模型。因此，研究旨在通過動物實驗觀察痛瀉藥方合并四逆散對KK-Ay小鼠胰島素抵抗的影響，并闡明其通過PI3K/AKT/GSK-3β信號通路發(fā)揮作用的具體機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性SPF級KK-Ay小鼠24只，6～8周齡，體質量（22±5）g，同齡 SPF 級雄性 C57BL/6J小鼠6只，均購于北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（京）2014-0004。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學動物實驗室，12/12 h光照循環(huán)，自由飲食水。

1.1.2 實驗藥物與主要試劑 痛瀉要方合四逆散顆粒，組成：柴胡 12 g，白芍 12 g，枳殼 12 g，炒白術18 g，陳皮 9 g，防風 6 g，甘草 6 g，由北京康仁堂有限公司生產，實驗前用蒸餾水配制成溶液，冰箱4℃保存。PI3K磷酸化（P-PI3K）抗體（貨號：ab278545），AKT 磷酸化（P-AKT）抗體（貨號：ab38449），GSK-3β 磷酸化（P-GSK-3β）抗體（貨號：ab68476），PI3K抗體（貨號：ab191606）、AKT 抗體（貨號：ab8805），GSK-3β抗體（貨號：ab280376）均購自美國Abcam公司。引物由上海生工合成，序列如下：PI3K-上游引物：5’-AAA CAA AGC GGA GAA CCT ATT-3’；PI3K-下游引物：5’-TAA TGA CGC AAT GCT TGA CTT C-3’；Akt-上游引物：5’-TGC ACA AAC GAG GGG AAT ATA T-3’；AKT-下游引物：5’-CGT TCC TTG TAG CCA ATA AAG G-3’；GSK-3β-上游引物：5’-AAC GGA TAG GGA GCA GAA ACC CAA-3’；GSK-3β-下游引物：5’-GTG CAA AGG GTG AGT GAG GCA TTT-3’；β-Actin-上游引物：5’-CGT CTT CCC CTC CAT CGT-3’；β-Actin-下游引物：5’-GGA GTC CTT CTG ACC CAT ACC-3’。

1.2 實驗分組與給藥劑量 雄性6～8周齡KK-Ay小鼠24只，適應性喂養(yǎng)1周后，剪尾取血，小鼠隨機血糖值≥13．9 mmol/L為模型成功的標準，結果顯示24只小鼠隨機血糖值均符合標準。按照體質量隨機分組，分為模型組6只，中藥低劑量組6只、中劑量組6只、高劑量組6只。另取6只雄性C57BL/6J小鼠作為正常組。依照前期課題組預實驗結果，每日小鼠灌胃劑量分別為：中藥低劑量組[1．84 g/（kg·d）]，中藥中劑量組[3．68 g/（kg·d）]，中藥高劑量組[5．52 g/（kg·d）]，中藥劑量以痛瀉要方合四逆散顆粒生藥量計算。正常組和模型組均給予相同劑量的生理鹽水，連續(xù)干預4周。

1.3 小鼠胰島素耐量實驗（ITT實驗） 在給藥第4周后，小鼠禁食不禁水4 h，按0．4 U/kg劑量腹部皮下注射胰島素，尾靜脈取血，測定 0、30、60、120 分血糖（BG），計算曲線下面積（AUC）=0．5×（BG 0分+BG30 分）/2+0．5×（BG30 分+BG60 分）/2+1×（BG60 分+BG 120分）/2。

1.4 胰島素抵抗指數 末次給藥后，對小鼠禁食不禁水處理，8 h后測定空腹血糖，并通過摘眼球取血，經靜置后取上層血清，采用放射免疫法測定空腹血清胰島素水平，然后計算胰島素抵抗指數，計算方法如下：胰島素抵抗指數的計算方法：空腹血糖×空腹血清胰島素/22．5。

1.5 實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（real time PCR）檢測小鼠肝臟組織 PI3K、AKT、GSK-3β基因的表達 用RNA試劑盒提取小鼠肝臟組織的總RNA，在260 nm，280 nm，320 nm的不同吸光度值下進行測量，然后根據吸光度值計算總RNA的濃度，然后將RNA轉錄為cDNA。最后使用THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix擴增靶基因，然后將所有配置好的反應體系放入Thermal Cycler Dice中，循環(huán)設置如下：95 ℃，30 s，1 個循環(huán)；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，40 個循環(huán)，95 ℃，15 s，60 ℃，30 s，1 個循環(huán)。結果用 2-ΔΔCt法分析。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測小鼠肝臟組織PI3K、AKT、GSK-3β蛋白的表達 小鼠的肝臟組織使用RIPA裂解液提取總蛋白，使用BCA蛋白質測定試劑盒（索萊寶公司）測定蛋白質濃度，通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離不同分子量的蛋白質，然后將其轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，完成上述步驟后，然后分別將PI3K、AKT、GSK-3β、P-PI3K、P-AKT、P-GSK-3β 的一抗稀釋液與PVDF封閉一起在4℃下孵育過夜。第二天用TTBS清洗3次，每次10 min，隨后在室溫下與二抗孵育1h，將PVDF膜分別用TTBS洗滌3次，每次10 min，室溫下將配置好的ECL發(fā)光液滴在PVDF膜上，然后放入凝膠成像系統(tǒng)，圖像結果使用Image J軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26．0統(tǒng)計軟件處理數據，數據以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 痛瀉藥方合四逆散對KK-Ay小鼠空腹血糖的影響 與正常組比較，模型組小鼠血糖水平明顯升高，具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）；與模型組相比，第 4 周中藥高劑量組小鼠血糖水平有所下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；其他用藥組及其他時間小鼠血糖水平有下降趨勢，但無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。見表 1。

表1 各組小鼠空腹血糖比較（±s）Tab.1 Comparison of fasting blood glucose of mice among the groups（±s）mmol/L

表1 各組小鼠空腹血糖比較（±s）Tab.1 Comparison of fasting blood glucose of mice among the groups（±s）mmol/L

注：與正常組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組動物數6 6 6 6 6 0周 1周 2周 3周 4周3．52±0．37 3．82±0．51 4．10±0．40 3．78±0．29 3．97±0．61 9．08±0．80*9．87±1．69*11．07±1．24*13．25±2．18*15．47±2．34*9．03±1．03 9．78±1．73 10．75±1．43 12．75±1．60 14．40±2．05 9．10±1．52 9．62±1．0810．70±1．09 12．50±1．20 13．45±2．67 9．03±1．31 9．78±0．96 10．17±1．12 11．70±1．39 12．68±1．91#

2.2 痛瀉藥方合四逆散對KK-Ay小鼠空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數的影響 與正常組相比，模型組小鼠空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組相比，中藥中劑量和高劑量組小鼠空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數均有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），而中藥低劑量組有下降趨勢，無統(tǒng)計學差異（P＞0．05）。見表 2。

表2 各組小鼠空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數比較（±s）Tab.2 Comparison of fasting insulin level and insulin resistance index of mice among the groups（±s）

表2 各組小鼠空腹胰島素水平及胰島素抵抗指數比較（±s）Tab.2 Comparison of fasting insulin level and insulin resistance index of mice among the groups（±s）

注：與正常組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別正常組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組動物數6 6 6 6 6胰島素（ng/mL） 胰島素抵抗指數21．10±1．26 3．72±0．63 48．43±1．12* 33．31±5．13*44．65±2．21 28．61±4．51 36．93±2．20# 22．25±5．53#30．66±1．73# 17．26±2．45#

2.3 痛瀉藥方合四逆散對KK-Ay小鼠胰島功能的影響 與正常組相比，模型組小鼠0分、30分、60分及 120 分血糖明顯升高（P＜0．05），且曲線下面積（AUC）升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組小鼠相比，中藥低中高劑量組小鼠0分、30分、60分及120分血糖及AUC均有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表 3。

表3 各組小鼠胰島素耐量實驗結果比較（±s）Tab.3 Comparison of insulin tolerance test results of mice among the groups（±s）

表3 各組小鼠胰島素耐量實驗結果比較（±s）Tab.3 Comparison of insulin tolerance test results of mice among the groups（±s）

注：與正常組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別 動物數正常組 6模型組 6中藥低劑量組 6中藥中劑量組 6中藥高劑量組 6 0分 30分 60分 120分 AUC（mmol/L）6．13±0．59 3．13±0．52 4．55±0．77 5．20±0．75 9．11±0．82 16．45±1．28*11．83±2．80*8．93±1．70*12．57±1．84*23．12±2．14*13．50±1．34# 9．28±1．88#8．23±0．55#10．73±1．90#20．57±1．82#12．75±1．54# 8．43±1．32#7．28±1．05# 9．22±1．27#17．63±1．48#11．98±1．61# 5．27±1．33#6．17±0．69# 7．62±1．23#14．18±0．83#

2.4 痛瀉藥方合四逆散對KK-Ay小鼠肝臟組織PI3K、AKT、GSK-3β基因表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中PI3K、AKT、GSK-3β基因表達水平均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05），與模型組相比，中藥高劑量組小鼠肝臟組織中PI3K、AKT、GSK-3β基因表達水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表 4。

表4 各組小鼠PI3K、AKT、GSK-3β基因相對表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of relative expression levels of PI3K，AKT and GSK-3β mRNA of mice among the groups（±s）

表4 各組小鼠PI3K、AKT、GSK-3β基因相對表達水平比較（±s）Tab.4 Comparison of relative expression levels of PI3K，AKT and GSK-3β mRNA of mice among the groups（±s）

注：與正常組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別正常組模型組中藥高劑量組動物數3 3 3 PI3K基因 AKT基因 GSK-3β基因1．01±0．18 1．03±0．32 1．01±0．19 0．14±0．04* 0．18±0．03* 0．17±0．02*0．46±0．05# 0．41±0．06# 0．43±0．02#

2.5 痛瀉藥方合四逆散對KK-Ay小鼠肝臟組織PI3K、AKT、GSK-3β蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組小鼠肝臟組織中PI3K、AKT、GSK-3β磷酸化蛋白表達水平均降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）；與模型組相比，中藥高劑量組小鼠肝臟組織中PI3K、AKT、GSK-3β磷酸化蛋白表達水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．05）。見表5和圖1。

圖1 各組小鼠PI3K、AKT、GSK-3β磷酸化蛋白相對表達水平比較Fig.1 Comparison of relative expression levels of phosphorylated proteins of PI3K，AKT and GSK-3β of mice among the groups

表5 各組小鼠PI3K、AKT、GSK-3β磷酸化蛋白相對表達水平比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression levels of phosphorylated proteins of PI3K，AKT and GSK-3β of mice among the groups（±s）

表5 各組小鼠PI3K、AKT、GSK-3β磷酸化蛋白相對表達水平比較（±s）Tab.5 Comparison of relative expression levels of phosphorylated proteins of PI3K，AKT and GSK-3β of mice among the groups（±s）

注：與正常組比較，*P＜0．05；與模型組比較，#P＜0．05。

組別正常組模型組中藥高劑量組動物數3 3 3 P-PI3K/PI3K P-AKT/AKT P-GSK-3β/GSK-3β 0．94±0．07 0．91±0．09 0．95±0．11 0．47±0．11* 0．31±0．13* 0．41±0．10*0．72±0．10# 0．58±0．12# 0．61±0．09#

3 討論

糖尿病屬中醫(yī)“消渴”范疇，胰島素抵抗作為消渴病發(fā)病的重要機制，雖無具體的中醫(yī)病名，但根據其臨床癥狀，可歸屬于消渴范疇。葉天士《臨證指南醫(yī)案》中曾言“心境愁郁，內火自燃，乃消癥大病”，可見肝失疏泄與糖尿病密切相關。在益氣養(yǎng)陰的基礎上，采用疏肝、健脾等方法能改善胰島素抵抗[9]。《傷寒論》經典方劑四逆散及《丹溪心法》中的痛瀉要方是其中的代表方。痛瀉要方合四逆散由陳皮、防風、白術、芍藥、柴胡、枳實、甘草等藥物組成。方中柴胡疏肝解郁，白芍養(yǎng)血斂陰，陳皮與枳實行氣醒脾，條暢氣機，白術燥濕健脾，防風補脾柔肝，共奏調和肝脾，柔肝理脾之效。臨床研究顯示采用疏肝健脾治法在改善糖尿病患者相關癥狀、血脂代謝紊亂及肝功能異常方面有較好的療效[6-8]。本研究中，以肥胖的自發(fā)性2型糖尿病KK-Ay小鼠為研究對象，以不同的中藥劑量干預4周，并且通過觀察各組小鼠空腹血糖及胰島素水平，胰島素抵抗指數和胰島功能評估藥物對小鼠胰島素抵抗的作用效果。結果顯示，痛瀉藥方合四逆散能降低糖尿病KK-Ay小鼠的空腹血糖及胰島素水平，改善胰島素抵抗指數和胰島功能，且呈現劑量依賴性。

PI3K/AKT信號通路在肝臟的葡萄糖合成，攝取和糖異生中起重要作用，并且PI3K/AKT途徑還可以通過刺激胰島素和調節(jié)脂肪的功能來促進脂肪合成[10]，先前的研究表明，PI3K/AKT信號通路在肝臟中起著至關重要的作用，與肝臟胰島素抵抗關系密切[11]。GSK-3主要有GSK-3α與GSK-3β兩個亞型，起主要作用的是GSK-3β[12]。糖原合成酶可被GSK-3β抑制從而減少糖原的合成，而GSK-3β的磷酸化會使其自身失活，進而更多的肝糖原會被合成。AKT是GSK-3β上游調控的一個重要靶點[13]，磷酸化的AKT可促使GSK-3β磷酸化而抑制糖異生。激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路可以有效改善組織中葡萄糖轉運[14]。本研究發(fā)現中藥高劑量組可以顯著增加小鼠肝臟中PI3K、AKT、GSK-3β的磷酸化蛋白表達水平，提示痛瀉藥方合四逆散能激活PI3K/AKT/GSK-3β信號通路來發(fā)揮作用。

綜上所述，痛瀉要方合四逆散可以減輕2型糖尿病KK-Ay小鼠胰島素抵抗，其作用機制可能是通過增加小鼠肝臟中磷酸化PI3K、AKT及GSK-3β蛋白表達水平實現的。關于胰島素抵抗的發(fā)生機制，還涉及多種信號通路，另外痛瀉藥方合四逆散包含多種成份，其發(fā)揮作用可能是通過多靶點多層次實現的。因此，未來還需進一步對其進行研究，以期發(fā)現更多的作用靶點和機制，為中藥防治2型糖尿病胰島素抵抗提供科學依據。