熒光染色法與KOH法在皮膚真菌直接鏡檢檢查中的應(yīng)用效果比較

曾 莉

信陽(yáng)市人民醫(yī)院 (河南 信陽(yáng) 464000)

皮膚真菌感染作為皮膚科常見(jiàn)疾病，致病菌較多，酵母菌、皮膚癬菌、非皮膚癬菌性絲狀真菌等，其中以皮膚癬菌最為多見(jiàn)，其中紅色毛癬菌占比最大，發(fā)病率較高，盡早明確病情、有效的鑒別診斷可為預(yù)后治療提供較多參考[1-2]。臨床醫(yī)師常以能快速診斷、鑒別真菌的檢驗(yàn)技術(shù)幫助臨床診療。進(jìn)行真菌檢查的常用方法為培養(yǎng)法及直接鏡檢法，但培養(yǎng)法需較多耗時(shí)[3]。熒光染色法、KOH法均為臨床應(yīng)用較廣的直接鏡檢法，可針對(duì)皮膚真菌感染在檢測(cè)中發(fā)揮一定作用。KOH法受干擾狀況多、主觀性強(qiáng)，易存在漏誤診狀況。熒光染色法經(jīng)熒光標(biāo)記的真菌酶和真菌細(xì)胞壁內(nèi)幾丁質(zhì)結(jié)合，在熒光顯微鏡下能觀測(cè)到真菌結(jié)構(gòu)，在進(jìn)行皮膚真菌檢查中具備一定優(yōu)勢(shì)。本研究選取皮膚科門(mén)診98例疑為皮膚真菌感染患者皮損標(biāo)本，比較熒光染色法與KOH法的應(yīng)用效果?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究采集皮膚科門(mén)診98例疑為皮膚真菌感染患者皮損標(biāo)本，每例均進(jìn)行熒光染色法與KOH法檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果。均為臨床特征疑似皮膚真菌感染者，排除近一個(gè)月內(nèi)使用外用、系統(tǒng)抗真菌藥物者。年齡3～73歲，平均年齡(59.54±3.62)歲；皮屑87例，甲屑8例，毛發(fā)3例。

1.2方法

1.2.1 器材 KOH溶液：采用我院檢驗(yàn)科5%KOH溶液。熒光染液：選用試劑組成成分為熒光增白劑、氫氧化鉀、純化水及伊文思藍(lán)，均由珠海豐炎科技有限公司提供。顯微鏡使用奧林巴斯CX31型顯微鏡，增加設(shè)置熒光模塊。

1.2.2方法材料：采用蘸有75%乙醇無(wú)菌棉簽消毒、濕潤(rùn)皮損部位，甲屑標(biāo)本挑選增厚混黃伴鱗屑、空變病甲碎屑；皮屑標(biāo)本挑選活動(dòng)性皮損邊緣位置皮屑；毛發(fā)則取皮損內(nèi)病發(fā)和毛根鱗屑；所有標(biāo)本一式兩份，依次進(jìn)行熒光染色法、KOH法檢測(cè)。熒光染色法，于標(biāo)本上滴加熒光染色液，將蓋玻片蓋上，靜待1min，將待染液和標(biāo)本充分混合，進(jìn)行數(shù)秒染色，將多余殘液吸除，在顯微鏡熒光模塊下進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)菌絲、孢子則為陽(yáng)性；KOH法于標(biāo)本上滴加KOH溶液，將蓋玻片蓋上，使用酒精燈進(jìn)行適當(dāng)加熱，將標(biāo)本角質(zhì)成分消解，在顯微鏡普通光鏡下進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)到孢子、菌絲便為陽(yáng)性。

1.3 觀察指標(biāo)(1)陽(yáng)性率。(2)不同標(biāo)本陽(yáng)性率：記錄對(duì)比皮屑、毛發(fā)、甲屑采用熒光染色法、KOH法陽(yáng)性檢測(cè)率。(3)不同疾病類(lèi)型陽(yáng)性率：記錄對(duì)比皮屑中體股癬、手足癬、馬拉色菌性毛囊炎、脂溢性皮炎、毛發(fā)中頭癬、甲屑中甲真菌病陽(yáng)性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0分析，計(jì)量資料(±s)表示，t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料n(%)表示，χ2檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 陽(yáng)性率總98例標(biāo)本中，熒光染色法陽(yáng)性63例，陰性35例，陽(yáng)性率為64.29%；KOH法陽(yáng)性46例，陰性52例，陽(yáng)性率為46.94%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.973，P=0.015)。以KOH法為參考，熒光染色法相對(duì)靈敏度100%，相對(duì)特異度為67.31%。見(jiàn)表1。

表1 陽(yáng)性率n(%)

2.2 不同標(biāo)本陽(yáng)性率采用熒光染色法檢測(cè)皮屑、甲屑、毛發(fā)陽(yáng)性率均較KOH法高，熒光染色法陽(yáng)性率87.76%，KOH法陽(yáng)性率68.37%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.755，P=0.001)。見(jiàn)表2。

表2 不同標(biāo)本陽(yáng)性率n(%)

2.3 不同疾病類(lèi)型陽(yáng)性率98例患者中，皮屑標(biāo)本87例，其中體股癬最多，其次為手足癬，甲真菌病的甲屑標(biāo)本3例，頭癬的毛發(fā)標(biāo)本8例。熒光染色法陽(yáng)性檢出率較KOH法高(χ2=18.092，P<0.001)。見(jiàn)表3。

表3 不同疾病類(lèi)型陽(yáng)性率n(%)

3 討 論

皮膚真菌感染屬真菌性疾病內(nèi)的一種，常因人體指甲、皮膚、毛發(fā)等部位受真菌侵襲導(dǎo)致，通?？砂肿惆_、體股癬、頭癬及甲癬等，誘發(fā)該病發(fā)生的常見(jiàn)真菌存在念珠菌、馬拉色菌及皮膚癬菌等[4-5]。皮膚真菌感染受三大類(lèi)親人性病原菌和人類(lèi)關(guān)系緊密，宿主和該類(lèi)真菌進(jìn)行長(zhǎng)期相互作用致遺傳易感、接觸傳染，產(chǎn)生發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高的狀況[6-7]。皮膚真菌感染存在顯著的傳染性，多發(fā)生交叉感染，同時(shí)病情易復(fù)發(fā)，影響患者正常生活及工作。經(jīng)流行病學(xué)顯示，皮膚真菌感染在全世界多地均存在流行性，我國(guó)作為該病的高發(fā)區(qū)域[8-9]。根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)表明，皮膚真菌感染在皮膚科門(mén)診患者中占比較大，于部分季節(jié)或地區(qū)內(nèi)居于首位，發(fā)病率較高，通常盡早、明確的診斷可為后續(xù)治療提供有效依據(jù)[10-12]。

臨床常通過(guò)培養(yǎng)法進(jìn)行真菌檢測(cè)，但花費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，限制臨床應(yīng)用范圍。近些年來(lái)，臨床常用直接鏡檢法作為對(duì)皮膚真菌檢測(cè)的常用技術(shù)，最為常用的兩種方法為熒光染色法、KOH法[13-14]。KOH法具備成本低廉、操作簡(jiǎn)單、不必使用特殊儀器等較多優(yōu)勢(shì)，在臨床上應(yīng)用廣泛，但該檢測(cè)技術(shù)同時(shí)也存在影響因素較多、主觀性強(qiáng)等缺陷，進(jìn)行鏡下檢查時(shí)常存在標(biāo)本背景混亂，無(wú)法有效突出真菌結(jié)構(gòu)，對(duì)結(jié)果判讀存在感染等問(wèn)題，且對(duì)存在菌絲、脂滴及孢子量少等其他狀況下容易出現(xiàn)漏檢，對(duì)檢測(cè)人員的操作水平、專(zhuān)業(yè)性及相關(guān)經(jīng)驗(yàn)存在較高要求[15-16]。同時(shí)，皮膚真菌標(biāo)本中存在甲標(biāo)本角質(zhì)含量較皮屑、分泌物等組織高，甲真菌病KOH法鏡檢特異性、敏感性均較低。

熒光染色法是受具備特異性的熒光標(biāo)記物共價(jià)結(jié)合的方式進(jìn)行有關(guān)檢測(cè)，熒光染色液中所含熒光素、抑制背景熒光著色復(fù)染劑，和真菌或者其他生物體細(xì)胞壁上方的幾丁質(zhì)及纖維素等一同表現(xiàn)產(chǎn)生高親和力。熒光染色液組成為具備特殊熒光素標(biāo)聯(lián)幾丁質(zhì)酶溶液、10%KOH及抑制雜質(zhì)熒光干擾溶液[17-18]。通過(guò)顯微鏡熒光模塊能仔細(xì)觀察到在特定激發(fā)光下出現(xiàn)的熒光，并令孢子、菌絲出現(xiàn)明亮的亮藍(lán)白色熒光，可和暗背景產(chǎn)生顯著反差及對(duì)比，能增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率，并且熒光劑和真菌親和力較高，能在數(shù)十秒之內(nèi)完成反應(yīng)，顯著增強(qiáng)真菌檢測(cè)效率、靈敏度。盡管熒光染色法對(duì)纖維素也可進(jìn)行標(biāo)志，但纖維形態(tài)不規(guī)則，存在邊緣銳利，橫隔、無(wú)菌絲等結(jié)構(gòu)，容易鑒別。經(jīng)熒光顯微鏡散發(fā)出紫外光激發(fā)，波長(zhǎng)340～380nm，僅真菌結(jié)構(gòu)散發(fā)出亮藍(lán)色熒光，和周?chē)诎当尘皹?gòu)成鮮明對(duì)比，菌絲、孢子成像清晰，易于辨認(rèn)，能顯著增高檢測(cè)陽(yáng)性率。熒光染色隨放置時(shí)間增強(qiáng)亮度逐步下降，但能經(jīng)復(fù)染恢復(fù)。該方法的熒光染色液將纖維著色，可有效發(fā)出熒光，纖維在大小、形態(tài)、粗細(xì)及結(jié)構(gòu)等方面都和菌絲存在較大差異，一般均可辨別出。而在皮膚真菌感染中皮膚癬菌存在發(fā)生率降低的因素，同時(shí)酵母樣菌、念珠菌等存在發(fā)生率上升狀況。經(jīng)過(guò)熒光染色法能更便于識(shí)別出真菌孢子，可在疑難標(biāo)本內(nèi)增強(qiáng)馬拉色菌性毛囊炎、念珠菌性甲真菌病等病原菌檢出率。該方法具備快捷、簡(jiǎn)單方便，敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。但熒光染色法熒光染色液也存在熒光淬滅的可能性，在使用一段時(shí)間后易存在熒光強(qiáng)度降低狀況，可進(jìn)行避光保存[19]。

熒光染色鏡檢和KOH鏡檢對(duì)比存在以下優(yōu)勢(shì)，熒光染色法樣本篩查時(shí)間短，每張標(biāo)本KOH法鏡檢時(shí)常需花費(fèi)3～4min掃視，熒光染色法在低倍鏡下1min內(nèi)便可完成掃視，發(fā)現(xiàn)、篩選出目標(biāo)；在熒光染色鏡下涂片碎片、背景材料易被區(qū)分出來(lái)，降低假陽(yáng)性率。

熒光染色法和KOH法相比，初學(xué)者容易掌握檢測(cè)技巧，彌補(bǔ)初學(xué)者工作經(jīng)驗(yàn)不足的問(wèn)題，降低假陰性率，且便于迅速出具檢測(cè)報(bào)告，準(zhǔn)確效果理想，

綜上所述，熒光染色法較KOH法結(jié)果更加準(zhǔn)確、迅速，能便于快速診斷皮膚真菌感染狀況。