電子加速器輻照滅菌對(duì)肺熱普清散質(zhì)量的影響*

采金金，謝和兵△，尼瑪次仁，白瑪?shù)┰?/p>

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 226133；3.江蘇神猴醫(yī)藥研究有限公司，江蘇 南通 226000；4.西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，西藏 日喀則 857000）

肺熱普清散（藏藥名洛才更賽）始載于16世紀(jì)的《驗(yàn)方百編》，目前收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥：第一冊(cè)》[1］中，為西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司獨(dú)家生產(chǎn)的藏藥復(fù)方制劑。該藥方主要含天竺黃、紅花、力嘎都、甘草、木香、鐵棒錘幼苗等藥材，有清肺泄熱、消炎功效，可用于小兒肺炎、流行性感冒、風(fēng)熱、癘熱的治療。該方采用傳統(tǒng)藏藥生產(chǎn)工藝，藥材生藥粉碎后直接包裝為成品，按中國藥典內(nèi)服散劑微生物控制的質(zhì)量要求進(jìn)行滅菌處理。本研究中比較了不同強(qiáng)度電子束輻照前后肺熱普清散性狀、顯微粉末特征、薄層色譜（TLC）鑒別、含量的變化，為該藥滅菌方法選擇提供參考依據(jù)[2-3］?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、XSR205DU/AC型十萬分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA10003N型千分之一天平、UC-250DE型超聲清洗器、DHG-9030A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精其儀器有限公司）；WMS-1037型生物顯微鏡（上海無陌光學(xué)儀器有限公司）；DX-10/20型電子加速器（中廣核戈瑞＜深圳＞科技有限公司）。

1.2 試藥

肺熱普清散[西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)分別為20200901（樣品1），20200902（樣品2）］；羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)為111637-202111，含量≥96.8%）、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111524-201911，含量≥99.9%）、去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品（批號(hào)為111525-201912，含量≥99.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品性狀

取2批樣品各6份，采用電子加速器輻照滅菌，輻照劑量分別為0，4，6，8，10，12 kGy。通過日光下目視、口嘗、鼻嗅直觀判斷。結(jié)果，與0 kGy比較，不同劑量輻照滅菌后樣品外觀、色澤、氣味均未發(fā)生明顯變化，說明該輻照滅菌對(duì)樣品性狀無明顯影響。樣品性狀見圖1。

圖1 樣品性狀A(yù).Sample 1 B.Sample 2Fig.1 Appearance of samples

2.2 顯微鑒別

參照2020年版《中國藥典（四部）》通則2001顯微鑒別法，取上述經(jīng)輻照的2批樣品粉末過5號(hào)篩，挑取少許，滴加甘油醋酸試液，置生物顯微鏡下觀察。結(jié)果，0 kGy輻照劑量下，2批樣品花粉粒眾多，類圓形、卵圓形或橄欖形，有3個(gè)萌發(fā)孔，外壁有齒狀突起；有紅棕色或黃棕色分泌細(xì)胞（紅花）纖維梭形，單個(gè)散在的草酸鈣簇晶（力嘎都）；不同劑量輻照滅菌后，紅花和力嘎都特征均仍可見，且與0 kGy比較無明顯變化。顯微圖見圖2。

圖2 樣品顯微圖A.Sample 1 B.Sample 2Fig.2 Micrograph of samples

2.3 TLC鑒別

取上述經(jīng)輻照的2批樣品5 g，加甲醇25 mL，超聲（功率250 W，頻率40 kHz；下同）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取去氫木香內(nèi)酯對(duì)照品、木香烴內(nèi)酯對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為單一對(duì)照品溶液。按肺熱普清散處方及工藝制備缺木香的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制得陰性對(duì)照品溶液。參照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法，吸取上述溶液各5μL，同一批號(hào)溶液點(diǎn)于同一硅膠G薄層板，以環(huán)己烷-甲酸乙酯-甲酸（32∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置上均顯相同顏色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。TLC圖見圖3。

圖3 肺熱普清散薄層色譜圖A.Sample 1 B.Sample 2 1.Costunolidereferencesolution 2.Dehydrocostuslactonereferencesolution 3.Negative reference solution 4-9.Test solution（the irradiation dose is 0，4，6，8，10 and 12 kGy，respectively）Fig.3 TLC chromatograms of Feirepuqing Powder

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：UltimateXB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸溶液（30∶70，V/V）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長：403 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按羥基紅花黃色素A峰計(jì)應(yīng)不低于3 000，基線分離良好。

2.4.2 溶液制備

取羥基紅花黃色素A對(duì)照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成1 mL含52μg的溶液，即得對(duì)照品溶液。取樣品粉末（過3號(hào)篩）約1.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理60 min，取出，放冷，再次稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

方法學(xué)考察：按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)及加樣回收試驗(yàn)。結(jié)果前3個(gè)試驗(yàn)結(jié)果的RSD均小于1.0%，表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置16 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好；平均加樣回收率為100.30%，RSD為0.44%（n=6）。

含量測(cè)定：取2批樣品各6份，予相應(yīng)輻照滅菌后每份樣品（過3號(hào)篩）取約1.5 g，按2.4.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.4.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄不同劑量輻照滅菌后2批樣品中羥基紅花黃色素A的含量。詳見表1。

表1 樣品中羥基紅花黃色素A含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.1 Results of content determination of hydroxysafflor yellow A in the samples（mg/g，n=2）

2.5 微生物檢查

按2015年版《中國藥典（四部）》通則中無菌產(chǎn)品微生物限度檢查相關(guān)規(guī)定[包括通則1105（微生物計(jì)數(shù)法）、通則1106（控制菌檢查法）及通則1107（非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)）］，檢查樣品細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌酵母菌菌落總數(shù)、大腸菌群菌落總數(shù)。與0 kGy比較，經(jīng)不同劑量輻照后，2批樣品細(xì)菌菌落總數(shù)、霉菌酵母菌菌落總數(shù)均顯著減少（P＜0.05）。輻照劑量為4 kGy時(shí)，霉菌及酵母菌均已無法檢出；為8 kGy時(shí)，霉菌、酵母菌及細(xì)菌菌落均未檢出。大腸菌群一直未檢出。結(jié)果見表2。

表2 樣品微生物限度檢查結(jié)果（n=2）Tab.2 Microbial limit test results of samples（n=2）

3 討論

藏藥遵循傳統(tǒng)藏醫(yī)藥理論，多以原生藥粉直接入藥制成丸劑、散劑，整個(gè)過程中無高溫蒸煮等工序，致使生產(chǎn)中無法精準(zhǔn)控制微生物，導(dǎo)致藏成藥微生物限度很難達(dá)到《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重限制了傳統(tǒng)藏藥產(chǎn)品的臨床應(yīng)用[4-7］。

目前中藥常用的滅菌方法有濕熱滅菌法、干熱滅菌法、微波滅菌法等[8-18］，但均因會(huì)導(dǎo)致生藥藥粉色澤變深、揮發(fā)性成分逸散而不適用于肺熱普清散。電子加速器輻照滅菌利用電子加速器產(chǎn)生的高能電子束照射物質(zhì)達(dá)到滅菌目的，相較傳統(tǒng)的濕熱、干熱、紫外滅菌等，最大優(yōu)勢(shì)為屬冷滅菌，穿透性更高、更環(huán)保，更適用于含生藥材粉及揮發(fā)性成分較多的藏成藥的滅菌。此外，電子加速器輻照還具有輻照束流定向、能量利用充分、效率高和不產(chǎn)生放射性廢物等優(yōu)點(diǎn)[19-25］，是國家大力鼓勵(lì)發(fā)展的新興產(chǎn)業(yè)。隨著電子加速器制造技術(shù)的不斷進(jìn)步，電子加速器輻照在中藥、食品滅菌領(lǐng)域得以廣泛使用，但對(duì)傳統(tǒng)含有藏藥材生藥粉的藏成藥的輻照滅菌研究仍較少。

2015年11月，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局《中藥輻照滅菌技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，采用輻照滅菌必須遵循“必要、科學(xué)、合理、安全、有效、穩(wěn)定”原則。本研究中在綜合分析基礎(chǔ)上確定擬采用的最大輻照劑量，以確保中藥的安全、有效、質(zhì)量穩(wěn)定[26-32］。

綜上所述，本研究中建立的各檢測(cè)方法，可為藏藥肺熱普清散的輻照滅菌提供參考，也為部分藏成藥滅菌方案的選擇提供新思路。