柯孜木克顆粒對(duì)代謝綜合征模型大鼠炎性狀態(tài)的影響*

馬麗娜·阿新拜，陳 陽(yáng)，梅拉·哈萬(wàn)，庫(kù)麗夏西·馬尼，古麗加娜·奴爾包拉提，蘭 衛(wèi)△

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院，新疆 阿勒泰 836300）

世界衛(wèi)生組織于1998年首次定義代謝綜合征（MetS）[1］，并將胰島素抵抗（IR）、肥胖、血脂異常和高血壓聯(lián)系起來(lái)。MetS與表現(xiàn)為慢性低度炎癥狀態(tài)的2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、心肌梗死和中風(fēng)的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，其為全球性健康問(wèn)題，是全世界心腦血管病發(fā)病率和死亡率攀升的主要原因。MetS具有腹型肥胖和IR這2個(gè)主要臨床特征，而IR作為核心發(fā)病機(jī)制，與其他代謝危險(xiǎn)因子的增加密切相關(guān)[2］。IR是慢性亞臨床炎癥過(guò)程，相互影響的胰島素信號(hào)通路和炎性信號(hào)通路共同構(gòu)成了IR復(fù)雜的機(jī)制網(wǎng)絡(luò)。因此，IR和炎性反應(yīng)是MetS的核心機(jī)制。柯孜木克顆粒（以下簡(jiǎn)稱KZMK）由沙生蠟菊、黑果越橘、木賊組成，是哈薩克族民間經(jīng)驗(yàn)方。有研究證實(shí)，KZMK能明顯改善模型小鼠急慢性炎癥，抑制內(nèi)源性介質(zhì)前列腺素E2及5-羥色胺的釋放[3-4］。本研究中采用高鹽高糖高脂飼料喂養(yǎng)雄性SD大鼠以建立Mets模型，探討KZMK減輕炎性反應(yīng)的作用及機(jī)制，為該制劑改善MetS提供理論證據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：Eppendorf 5417R型臺(tái)式低溫高速離心機(jī)（Eppendorf中國(guó)有限公司）；LEICA RM2135型石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；BX53型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Olympus IX71型倒置熒光顯微鏡（蘇州景通儀器有限公司）。

試藥：KZMK（新疆阿勒泰地區(qū)哈薩克醫(yī)醫(yī)院藥房，組方：沙生蠟菊384 g、黑果越橘115 g、木賊192 g）。鹽酸二甲雙胍片（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)為404I021，純度≥98.0%）；高鹽高脂高糖飼料（江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，成分為0.5%膽鹽、5%食用鹽、10%果糖、10%奶粉、2%膽固醇、10%蛋黃粉、10%熟豬油、52.5%基礎(chǔ)飼料，批號(hào)為MD1203）；核因子κB（NFκB）P65抗體（美國(guó)Affinity Biosciences公司，批號(hào)為DF7003）；SP超敏免疫組化試劑盒（兔SP試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為SP9001）；腫瘤壞死因子（TNF-α）酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)為ml077385）；蘇木素-伊紅（HE）染液（武漢Servicebio公司，批號(hào)為G1005）。

動(dòng)物：SD大鼠，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（新）2018-0003。于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由飲水，溫度19～24℃，相對(duì)濕度60%～70%，12 h交替光照，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1 分組與建模

將36只SD大鼠隨機(jī)分為正常組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），KZMK高、中、低劑量組（70.38，35.19，17.6 mg/kg），以及二甲雙胍組（3 mg/kg），各6只。正常組飼以普通飼料，其余組均飼以高鹽高脂高糖飼料[5-6］12周，以建立MetS大鼠模型。8周后，各組大鼠灌胃給予相應(yīng)藥物或生理鹽水（灌胃體積10 mg/kg），每日1次，連續(xù)4周。末次給藥后12 h禁食不禁飲，腹腔注射10%水合氯醛溶液以麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 mL，靜置1 h后，4℃3000 r/min離心15 min，分離上層血清。

1.2.2 觀察指標(biāo)

血清TNF-α水平：取大鼠血清，采用ELISA法檢測(cè)，嚴(yán)格按相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

肝臟組織病理形態(tài)：取大鼠肝臟，在距離邊緣1.0 cm處切取肝組織（0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm），置4%多聚甲醛溶液；剩余肝組織切成若干塊，用凍存管-80℃保存。取多聚甲醛溶液中保存的肝組織，常規(guī)脫水，石蠟包埋后，采用石蠟切片機(jī)連續(xù)切4μm厚片。脫蠟，HE染色后以中性樹(shù)膠（50μL）封片，顯微鏡下觀察并拍照。

NF-κB表達(dá)水平：采用免疫組織化學(xué)法。取大鼠肝臟組織，固定，脫水，切片，滴加兔抗大鼠NF-κBp65抗體，4℃過(guò)夜，再滴加二抗，DAB顯色、貼片、脫水、透明、封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照；采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，測(cè)定平均光密度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，以LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟組織病理形態(tài)

正常組大鼠的肝臟組織形態(tài)正常，特點(diǎn)是肝小葉結(jié)構(gòu)完整清晰，肝細(xì)胞索整齊，無(wú)腫脹和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞松散、腫脹、紊亂，肝臟脂肪變性明顯，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。KZMK低劑量組大鼠肝小葉略微完整，肝細(xì)胞腫脹較少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較少；KZMK中劑量組大鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)較模型組明顯改善，肝細(xì)胞腫脹減少；KZMK高劑量組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞索有序，無(wú)明顯肝細(xì)胞腫脹。二甲雙胍組肝組織形態(tài)介于模型組與KZMK各劑量組之間，脂肪變性少見(jiàn)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠肝臟組織病理形態(tài)（HE，×200）A.Normal group B.Model group C.Metformin group D.KZMK lowdose group E.KZMK medium-dose group F.KZMK high-dose groupFig.1 Histopathological morphology of liver in rats（HE，×200）

2.2 大鼠血清TNF-α水平

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組所剩大鼠只數(shù)不一。與正常組比較，模型組大鼠血清TNF-α水平有所升高；與模型組比較，KZMK各劑量組大鼠血清TNF-α水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

2.3 大鼠肝臟組織NF-κB表達(dá)水平

與正常組比較，模型組大鼠肝臟組織NF-κB表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，KZMK各劑量組NF-κB表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠血清TNF-α及肝臟組織NF-κB水平比較（±s）Tab.1 Comparison of TNF-αlevel in serum and NF-κB level in liver tissue of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α及肝臟組織NF-κB水平比較（±s）Tab.1 Comparison of TNF-αlevel in serum and NF-κB level in liver tissue of rats in each group（±s）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。Note：Compared with those in the normal group，#P＜0.05；Compared with those in the model group，*P＜0.05.

組別正常組（n=6）模型組（n=3）二甲雙胍組（n=4）KZMK低劑量組（n=6）KZMK中劑量組（n=5）KZMK高劑量組（n=5）F值P值劑量（mg/kg）3.0 17.6 35.19 70.38 TNF-α（ng/mL）0.63±0.01 0.67±0.02 0.63±0.03 0.57±0.07*0.60±0.06*0.56±0.04*8.559 0.019 NF-κB 136.53±13.53 152.49±10.82#137.56±6.36 137.54±2.94*137.32±7.12*137.17±13.74*1.281 0.306

3 討論

據(jù)估計(jì)，全世界有20%～30%成年人患有MetS[7］，且發(fā)病年齡趨于年輕化。近年來(lái)，我國(guó)的MetS患病率（19.58%～33.9%）與世界水平持平[8］?，F(xiàn)代社會(huì)以久坐的生活方式為特點(diǎn)，加之人們?nèi)狈w育活動(dòng)，尤其是飲食習(xí)慣的改變，導(dǎo)致MetS的發(fā)病率不斷上升[9］。因此，MetS的預(yù)防和治療至關(guān)重要。MetS是多系統(tǒng)病理生理過(guò)程的集合體，而不是單一的疾病實(shí)體，它是由環(huán)境因素、遺傳因素及慢性全身性炎性狀態(tài)相互作用引發(fā)的一組臨床癥候群[10］。具體而言，存在腰圍增加、高甘油三酯血癥（＞150 mg/dL或已開(kāi)始藥物治療）、低高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）血癥（＜40mg/dL或已開(kāi)始藥物治療）、血壓升高（收縮壓＞130 mmHg和/或舒張壓＞85mmHg，或已開(kāi)始抗高血壓治療）、空腹血糖升高（＞100 mg/dL或已開(kāi)始藥物治療）中的3個(gè)因素即為MetS[11］。

MetS的組分共同增加了罹患心血管疾病、2型糖尿病、肝脂肪變性和肥胖相關(guān)癌癥等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)MetS是全身性系統(tǒng)性的低度炎癥狀態(tài)。因此，慢性全身炎癥狀態(tài)與MetS相關(guān)，且起著介導(dǎo)IR的作用[12］。脂肪細(xì)胞中的脂肪組織由于脂質(zhì)大量積累而不斷肥大，由于組織和細(xì)胞應(yīng)激及缺氧，從而引起脂肪細(xì)胞壞死，同時(shí)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，分泌TNF-α、白細(xì)胞介素（IL）-6等促炎性介質(zhì)，其引發(fā)的局部炎癥會(huì)擴(kuò)散成全身炎癥[12］，同時(shí)誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞和周?chē)M織中的IR[13］?？偠灾?dāng)機(jī)體出現(xiàn)MetS時(shí)，TNF-α、IL-6等炎性因子水平可能會(huì)相應(yīng)升高[14］。前期研究證實(shí)以高鹽高脂高糖飼料喂養(yǎng)SD大鼠8周可復(fù)制MetS大鼠模型，該模型存在明顯的IR、糖脂代謝紊亂，在病因?qū)W、全身疾病背景方面均與人類MetS發(fā)病極為相似，是研究MetS發(fā)病機(jī)制較理想的一種動(dòng)物模型。同時(shí)，早期監(jiān)測(cè)TNF-α等炎性因子水平，能及早發(fā)現(xiàn)并干預(yù)MetS及相關(guān)系統(tǒng)性疾病[15］。本研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，KZMK各劑量組大鼠肝組織肝小葉結(jié)構(gòu)改善，肝細(xì)胞腫脹程度減輕，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，脂肪泡減少，說(shuō)明KZMK能改善MetS模型大鼠肝臟組織病理形態(tài)；與模型組比較，KZMK各劑量組血清TNF-α水平均顯著降低，說(shuō)明KZMK能降低MetS模型大鼠炎性因子水平，改善其炎癥狀態(tài)。

MetS的特點(diǎn)是慢性低度炎癥狀態(tài)，其起因是各種炎癥信號(hào)通路的激活，導(dǎo)致NF-κB、Jun N-末端激酶和炎癥小體的激活，這些通路匯聚到一起，減少胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并在代謝組織中誘導(dǎo)炎性反應(yīng)。激活的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核后，與炎癥基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)TNF-α、IL-1等炎性因子的釋放[16］。NF-κB信號(hào)可誘導(dǎo)大量炎癥趨化因子、細(xì)胞因子的產(chǎn)生，由此形成低度炎癥環(huán)境。NF-κB的活化對(duì)TNF-α、IL-1、IL-1β、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生是必需的，NF-κB激活后，促進(jìn)上述因子轉(zhuǎn)錄，使其大量合成并加速分泌。同時(shí)TNF-α又使NF-κB活化，活化后的NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，如此往復(fù)，加劇組織和細(xì)胞的炎性損傷[17］。因此，對(duì)于MetS的防治，炎癥啟動(dòng)因素的控制及炎性因子之間平衡的恢復(fù)至關(guān)重要[18］。抑制NF-κB的活化或降低NF-κB水平很可能有助于改善MetS炎性狀態(tài)。本研究中，與模型組比較，各給藥組大鼠肝臟組織NF-κB表達(dá)水平均降低，即發(fā)揮了抑制NF-κB活化的作用，在一定程度上抑制MetS模型大鼠炎性反應(yīng)，有利于MetS的防治。

MetS的最佳治療方法是改變生活方式，但對(duì)患者來(lái)說(shuō)難度較大，故還需配合藥物治療。西醫(yī)主要使用胰島素增敏劑、他汀類藥物、腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）受體阻滯劑等，常見(jiàn)副作用包括體質(zhì)量增加、胰島素敏感性降低、體液潴留、影響骨骼等。中醫(yī)藥方面，柴芪湯[7，19-20］、小柴胡湯[21］、黃連溫膽湯[22］等均為長(zhǎng)期用于臨床治療MetS的方劑。KZMK中沙生蠟菊盛產(chǎn)于新疆，楊金香等[23］研究發(fā)現(xiàn)，其中的芹菜素可作用于不同信號(hào)通路，抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕肝臟炎性病變；黑果越橘屬新疆特色藥材，其能增強(qiáng)胰島素敏感性，激活肝臟一磷酸腺苷（AMP）依賴性蛋白激酶，抑制葡萄糖產(chǎn)生，進(jìn)而改善IR[24］；木賊別名接骨草，姜秀娟等[25］發(fā)現(xiàn)其能減輕非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞炎性反應(yīng)，改善其肝臟功能。綜上所述，KZMK能通過(guò)抑制NF-κB的活化，減少TNF-α的產(chǎn)生，改善炎性狀態(tài)及肝組織病變程度，有利于MetS的防治。

本研究中，KZMK在一定程度上可改善MetS模型大鼠肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)，緩解肝細(xì)胞腫脹，減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)而改善肝臟組織病理形態(tài)。同時(shí)對(duì)MetS模型大鼠肝臟組織中NF-κB的活化有一定的抑制作用。本研究為KZMK用于MetS的防治提供了理論證據(jù)。下一步將加大樣本量、延長(zhǎng)用藥療程進(jìn)一步研究該藥的治療機(jī)制。