生態(tài)環(huán)境因子與天麻品質相關成分含量的關系研究*

朱成豪,郭怡博,王尚濤,張遠帆,周建國,陳庭國,孫志蓉**

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院,北京 102488;2.寧強縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,陜西漢中 724400;3.寧強天麻研究所有限責任公司,陜西漢中 724400)

中藥材天麻又名赤箭、定風草,為蘭科(Orchidaceae)植物天麻(Gastrodiaelata)的干燥塊莖,具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡之功效,常用于治療小兒驚風,癲癇抽搐,破傷風,頭痛眩暈,手足不遂,肢體麻木和風濕痹痛等病癥[1],在中國已有2 000多年的藥用歷史。現(xiàn)代藥理研究表明,天麻還具有鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗氧化、改善記憶力、增強免疫和降血壓等作用[2]。天麻的主要活性成分有天麻素、對羥基苯甲醇和巴利森苷類等[3-5],而浸出物也是評價其藥材質量的重要指標。1987年天麻被列入《中國珍稀瀕危保護植物名錄》[6],2021年又被收錄于《國家重點保護野生植物名錄》[7],為國家二級重點保護野生植物。長期以來,因受生態(tài)環(huán)境和人為因素的影響,野生天麻的生長發(fā)育和繁殖機能逐漸減退,人工栽培呈必然趨勢。已有研究表明,氣溫在20-25 ℃時天麻生長較快,而在30 ℃以上時,天麻的生長便會受到抑制[8];烏天麻(G.elataf.glauca)適宜生長在海拔較高的云南和貴州,而紅天麻(G.elataf.elata)則主要分布在海拔相對較低的陜西、河南等地[9]。此外,土質疏松,利水透氣的微酸性或中性土壤較適宜天麻生長[10]。目前有關生態(tài)環(huán)境因子對天麻內在品質相關成分含量影響的研究還很有限,探明生態(tài)環(huán)境因子與天麻品質形成之間的關系,對天麻資源的可持續(xù)利用及道地性形成機制的解析具有重要意義。本研究對在陜西省漢中市寧強縣采集到的48份天麻樣品進行浸出物及主要有效成分含量測定并建立指紋圖譜,利用ArcGIS 10.2和SPSS 20.0軟件分析氣候、土壤、地形地貌等77個生態(tài)環(huán)境因子與成分含量之間的相關性,總結天麻品質相關成分在小尺度(縣域)空間范圍內的變異規(guī)律,為天麻資源的可持續(xù)開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-20AT型高效液相色譜儀(日本島津公司),Diamonsil C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,北京迪馬科技有限公司),Quintix35-1CN型十萬分之一電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司],BSA124S型萬分之一電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司],HH-4A型數(shù)顯單控單列恒溫電熱水浴鍋[國華(常州)儀器制造有限公司],KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司),SHB-IIIS型循環(huán)水真空泵(北京世紀予華儀器有限公司),350T型德蔚高速多功能粉碎機(廣州市渲龍廚具有限公司),DHG-9123A型鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)。

1.2 試劑

天麻素(批號:T10M9F55562)、對羥基苯甲醇(批號:H21D6Q7813)、巴利森苷A(批號:P24S11F124204)、巴利森苷B(批號:A13GB157725)、巴利森苷C(批號:D06N11S130122)、巴利森苷E(批號:D08D11S133702)均購自上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%。其他試劑還有乙腈[色譜純,賽默飛世爾科技(中國)有限公司]、磷酸[色譜純,福晨(天津)化學試劑有限公司]、水(娃哈哈純凈水)、無水乙醇(分析純,天津市致遠化學試劑有限公司)、甲醇(分析純,天津市致遠化學試劑有限公司)。

1.3 樣品

于2021年10-12月在陜西省漢中市寧強縣18個鎮(zhèn)采集林下栽培的新鮮天麻,記錄經(jīng)緯度和海拔,隨機從中抽取分析樣品。具體樣品信息見表1。樣品經(jīng)北京中醫(yī)藥大學孫志蓉教授鑒定為天麻(GastrodiaelataBl.)的新鮮塊莖,將塊莖放入蒸鍋中,保持水沸騰蒸制30 min,待天麻無白心時取出,室內自然冷卻,隨后將天麻樣品放入鼓風干燥箱中于60 ℃烘干至恒重,粉碎,過4號篩后干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 天麻樣品信息

1.4 生態(tài)環(huán)境因子

月度氣象數(shù)據(jù)(包括平均氣溫、降水量、水氣壓、風速、太陽輻射,時間尺度為1970-2000年)以及海拔數(shù)據(jù)均源自全球氣候數(shù)據(jù)庫(http://www.worldclim.org/)。土壤數(shù)據(jù)(土壤沙含量、黏土含量)來源于聯(lián)合國糧食和農(nóng)業(yè)組織土壤門戶網(wǎng)站的世界土壤數(shù)據(jù)庫(HWSD)土壤數(shù)據(jù)集(v1.2,https://www.fao.org/soils-portal/en/),中國區(qū)域的土壤數(shù)據(jù)由第二次全國土地調查提供的《1∶100萬中華人民共和國土壤圖》(1995年編制)得到。坡度數(shù)據(jù)使用ArcGIS 10.2軟件的投影柵格、按掩膜提取、坡度分析工具處理海拔數(shù)據(jù)得到。所有數(shù)據(jù)空間分辨率為30 s(約1 km×1 km)。

1.5 浸出物含量測定

參照《中華人民共和國藥典(一部)》(2020年版)[1](以下簡稱《中國藥典》)的方法測定。取供試品2-4 g,精密稱定,置于100-250 mL錐形瓶中,精密加水50-100 mL,密塞,稱定質量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。自然冷卻后,取下錐形瓶,密塞,再稱定質量,用水補足減失的質量,搖勻,用干燥濾器濾過,精密量取濾液25 mL,置于已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定質量。

1.6 有效成分含量測定

1.6.1 色譜條件

采用Diamonsil-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱;流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸水(B),梯度洗脫(0-10 min,3%-10% A;10-15 min,10%-12% A;15-25 min,12%-18% A;25-40 min,18% A;40-42 min,18%-95% A);流速為0.8 mL/min;檢測波長為220 nm;柱溫為30 ℃;進樣量為10 μL。

1.6.2 對照品溶液的制備

取對照品適量,精密稱定,置于10 mL 容量瓶中,加乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解定容,配制成質量濃度分別為天麻素(100 μg/mL)、對羥基苯甲醇(30 μg/mL)、巴利森苷A (362.6 μg/mL)、巴利森苷B (101.8 μg/mL)、巴利森苷C (102 μg/mL)、巴利森苷E (102.2 μg/mL)的混合對照品溶液。

1.6.3 供試品溶液的制備

精密稱定天麻樣品粉末0.5 g,置于具塞錐形瓶中,加入50%甲醇25 mL,稱定質量,超聲處理(500 W,40 kHz) 30 min,自然冷卻后,用水補足減失的質量,4 000 r/min離心5 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,即得供試品溶液。將48份天麻供試品的指紋圖譜數(shù)據(jù)導入“中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004版)”,以S10(大安鎮(zhèn)新明村)樣品為參照峰,采用中位數(shù)法和自動匹配法,獲取共有峰并建立寧強縣天麻共有的對照指紋圖譜,計算供試品相對于對照指紋圖譜相似度值。

1.6.4 標準曲線的制備

精密量取1.6.2節(jié)制備的混合對照品溶液,用乙腈-水(3∶97)混合溶液逐級稀釋至0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00倍,制成一系列不同濃度的混合對照品溶液,各取10 μL注入高效液相色譜儀。以1.6.1節(jié)的色譜條件測定各對照品峰面積,以對照品濃度為橫坐標(X),以峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸(表2)。

表2 各成分線性關系

1.6.5 精密度試驗

精密量取1.6.2節(jié)制備的混合對照品溶液,以1.6.1節(jié)的色譜條件測定各對照品峰面積,重復6次。其中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C與巴利森苷A的峰面積相對標準偏差(Relative Standard Deviation,RSD)分別為0.26%、0.20%、0.06%、0.05%、0.06%、0.11%。

1.6.6 穩(wěn)定性試驗

精密量取1.6.3節(jié)制備的供試品溶液,分別于配制后0、6、12、24、36 h各進樣1次,以1.6.1節(jié)的色譜條件測定峰面積。其中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C與巴利森苷A的峰面積RSD分別為1.32%、2.18%、1.83%、1.98%、2.21%與2.25%,表明供試品溶液36 h內穩(wěn)定性良好。

1.6.7 重復性試驗

精密稱取同一天麻樣品粉末2.0 g,共6份。按1.6.3節(jié)下制備成供試品溶液,以1.6.1節(jié)的色譜條件測定各供試品峰面積并計算各成分質量分數(shù)。其中天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C與巴利森苷A的質量分數(shù)RSD分別為2.60%、1.17%、1.39%、1.42%、1.54%、1.43%。

1.6.8 加樣回收率試驗

精密稱定已知成分含量的天麻供試品0.5 g,共6份,按照要求制備供試品溶液,分別加入各對照品溶液,進樣測定,記錄峰面積,計算平均加樣回收率及RSD,結果見表3。

表3 6個特征性成分加樣回收率試驗結果

1.7 數(shù)據(jù)分析

使用ArcGIS 10.2軟件的采樣工具對48個采樣點的環(huán)境數(shù)據(jù)進行提取,其中海拔匹配情況見圖1。使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析及皮爾遜相關性分析,運用Microsoft Office Excel 2020、Adobe Illustrator CS6、OriginPro 2015完成數(shù)據(jù)和圖表分析制作。

圖1 海拔匹配程度

2 結果與分析

2.1 指紋圖譜建立及相似度分析

通過比較對照品色譜圖(圖2),判定共有成分分別為A:天麻素,B:對羥基苯甲醇,C:巴利森苷E,D:巴利森苷B,E:巴利森苷C,F:巴利森苷A,與《中國藥典》規(guī)定的特征圖譜保留峰一致,說明建立的檢測方法穩(wěn)定、可靠。48批天麻樣品的共有峰為6個,共有峰保留時間RSD較小(0.09%-0.17%),共有峰的峰面積RSD較大(18.50%-52.59%),說明48份天麻樣品中同一成分的含量差異較大。由表4可看出,不同采樣點之間天麻的特征圖譜相似度較高,除S37(舒家壩鎮(zhèn)文家河村)樣品相似度低于0.9(為0.843),其他樣品相似度均為0.948-0.998,表明寧強縣內天麻有效成分基本一致。

A indicates Gastrodin,B indicates P-hydroxybenzyl alcohol,C indicates Parishin E,D indicates Parishin B,E indicates Parishin C,F indicates Parishin A.

表4 48批天麻樣品的指紋圖譜相似度

2.2 不同采樣點天麻浸出物及有效成分含量聚類分析

對48份天麻樣品的浸出物及6種有效成分的含量作聚類分析,結果表明:漢源街道辦黃壩驛村天麻的天麻素、巴利森苷B、巴利森苷C含量最高,分別為1.05%、0.79%、0.30%;陽平關鎮(zhèn)張家河村天麻的對羥基苯甲醇含量最高(0.18%);高寨子街道辦古城村天麻的巴利森苷A含量最高(1.95%);高寨子街道辦何家院子村天麻的巴利森苷E含量最高(0.93%),巴利森苷類成分總含量以高寨子街道辦古城村最高(3.57%),約為大安鎮(zhèn)龍泉村(1.52%)的2.35倍,其次是漢源街道辦黃壩驛村(3.54%)。數(shù)據(jù)標準化后的聚類分析結果表明,總體來看不同采樣點聚為3類。6種成分聚為4類,其中天麻素與巴利森苷C、巴利森苷A、巴利森苷B聚為一類,浸出物、對羥基苯甲醇、巴利森苷E各為一類(圖3)。

The data in the table represent the content of relevant components,unit:%.

2.3 天麻浸出物及有效成分含量

48份天麻樣品的浸出物及有效成分含量統(tǒng)計分析結果見表5,其中天麻素的含量為0.252 6%-1.050 7%,對羥基苯甲醇為0.027 4%-0.182 7%,巴利森苷E為0.378 9%-0.928 3%,巴利森苷B為0.312 2%-0.787 8%,巴利森苷C為0.087 3%-0.301 2%,巴利森苷A為0.379 2%-1.949 0%,浸出物為16.05%-30.59%。含量變化幅度對羥基苯甲醇>天麻素>巴利森苷A>巴利森苷C>巴利森苷B>巴利森苷E>浸出物,表明浸出物及巴利森苷E含量穩(wěn)定性高,離散程度小,對羥基苯甲醇及天麻素穩(wěn)定性低,離散程度大?？h內所有樣點的浸出物均符合《中國藥典》要求。不同采樣點天麻浸出物及6種有效成分含量的差異顯著(P<0.001,表6),其中6種有效成分總量以漢源街道辦黃壩驛村天麻最高,達4.65%,約為大安鎮(zhèn)龍泉村天麻(1.81%)的2.57倍;漢源街道辦黃壩驛村紅天麻浸出物含量最高,達30.59%,禪家?guī)r鎮(zhèn)張家壩村烏天麻浸出物含量最低,為16.05%。

表5 寧強縣天麻浸出物及有效成分含量

2.4 天麻浸出物及有效成分含量與生態(tài)環(huán)境因子的相關性分析

將天麻浸出物及有效成分含量與采樣點相應的77個生態(tài)環(huán)境因子進行Spearman相關性分析和顯著性檢驗,結果表明:浸出物含量與年平均氣溫、年平均水氣壓及土壤沙含量均呈顯著或極顯著正相關,與年平均降水量、年平均風速、海拔、土壤淤泥含量均呈顯著負相關。6種有效成分總量與年平均氣溫、年平均降水量、年平均風速均呈顯著正相關,與海拔、坡度呈顯著負相關。巴利森苷類成分含量與環(huán)境因素的關系和6種有效成分總量表現(xiàn)一致,而天麻素+對羥基苯甲醇總量僅與坡度呈顯著負相關關系(圖4)。隨著土壤沙含量和淤泥含量的升高,6種有效成分總量整體呈先升后降的趨勢(圖5)。由圖6可以看出,對羥基苯甲醇與2月降水,8、9月太陽輻射,交換性鹽基,土壤黏土含量及土壤的陽離子交換能力呈顯著正相關;巴利森苷A與1、12月降水,3、7、8月風速,土壤淤泥含量呈顯著負相關,與黏性層土壤的陽離子交換能力呈顯著正相關;巴利森苷E與坡度呈顯著負相關;巴利森苷B與黏性層土壤的陽離子交換能力呈顯著正相關。根據(jù)相關性大小發(fā)現(xiàn),生態(tài)環(huán)境因子與天麻浸出物及有效成分含量的關系為氣候>海拔>土壤,氣候因子中影響較大的為12月降水量、4月風速和12月平均氣溫。與坡度相比,海拔影響較大。土壤因子中影響最大的為土壤淤泥含量,其次為土壤沙含量。

圖4 天麻浸出物及6種有效成分含量與部分生態(tài)環(huán)境因子的關系

The data in the table represent the correlation coefficient between the content of a certain component and its corresponding environmental factors.

3 討論

天麻的人工培育會受到多種因素的影響,如促進種子萌發(fā)的萌發(fā)菌、為其提供直接營養(yǎng)的蜜環(huán)菌、栽培的環(huán)境和技術等。本研究選擇栽培條件相對一致的樣點(萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌和栽培技術相同)采集天麻樣品,并結合采樣點生態(tài)環(huán)境因子數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn),寧強縣天麻浸出物及有效成分含量與生態(tài)環(huán)境因子的關系為氣候>海拔>土壤。其中,氣候因子中影響較大的為年平均氣溫、年平均降水量和年平均風速;海拔的影響大于坡度;土壤因子中影響最大的為土壤淤泥含量,其次為土壤沙含量。

氣候是地球上某一地區(qū)多年時段大氣的一般狀態(tài),是多個生態(tài)環(huán)境因子的綜合表現(xiàn)[11]。其中,光照、溫度、水分對中藥材的分布與品質的形成最為重要,如防己(Stephaniatetrandra)中粉防己堿和防己諾林堿含量與年平均氣溫呈正相關[12];歐洲莨菪(Scopoliacarniolica)在干旱時阿托品含量達1%,而在濕潤環(huán)境下只有0.3%-0.5%[13]。本研究發(fā)現(xiàn),寧強縣屬山地暖溫帶濕潤季風氣候,縣域內所產(chǎn)天麻的6種有效成分總量與年平均氣溫呈顯著正相關,天麻浸出物含量與1-5月、10-12月降水量,1-12月風速呈顯著或極顯著負相關,原因可能是一定氣候區(qū)域內氣溫影響了蜜環(huán)菌和天麻的生長及二者的伴生關系,有利于生物量積累和品質形成,而春季和秋冬季的降水直接影響林地土壤水分和空氣濕度,風速會增加林地通透性并調節(jié)氣溫,同時也會在少雨年份或季節(jié)加大蒸發(fā)量而加劇干旱程度,影響萌發(fā)菌、蜜環(huán)菌和天麻的生長。中藥資源具有明顯的空間和地域分布規(guī)律[13],藥材品質的形成與產(chǎn)地的地理位置、地形地貌、海拔等因子密切相關,如紋黨(Codonopsispilosula)中浸出物含量與海拔呈正相關[14]。本研究中天麻浸出物含量與海拔卻呈顯著負相關,可能是由于高海拔主要種植烏天麻,其麻形偏小,水分含量低,浸出物含量相對較高;但是低海拔紅天麻個大,浸出物絕對含量較高。已有研究證實中藥材在不同采收時間里的有效成分含量存在差異[15]。本研究選擇天麻成熟期進行采收,不同采樣點的天麻成熟期具有差異,導致天麻成熟期時間不一的原因可能包括環(huán)境因素和人為因素(栽培技術),本研究在保證栽培條件(所用菌種和栽培技術)一致的前提下進行采收,以此來探究環(huán)境因素對天麻質量的影響。土壤是藥用植物生長的基礎,土壤的質地、養(yǎng)分、酸堿性等均會對中藥材的品質產(chǎn)生影響[16],如最適合金銀花(Lonicerajaponica)的土壤類型是中性或稍堿性的沙壤土[17]。本研究發(fā)現(xiàn),天麻6種有效成分總量與土壤淤泥含量呈顯著負相關,與土壤沙含量呈顯著正相關。因天麻適宜生長在較疏松的沙土或沙壤土中[18],土壤通透性不佳不利于蜜環(huán)菌生長,且易染雜菌,從而影響天麻生長。此外,本研究發(fā)現(xiàn)天麻在生長過程中受到環(huán)境脅迫(如氣溫、水氣壓較高等)時,在外觀形態(tài)上會變細長、生物量降低、浸出物含量增加,當處于順境(如氣溫較低、風速較快等)時,天麻會變短粗、生物量增加、浸出物及巴利森苷A含量降低,同樣體現(xiàn)了中藥材的“逆境效應”[19]。寧強縣天麻的6種有效成分總量和海拔、坡度呈負相關,高海拔下氣溫低,可能不利于有效成分的積累,這與6種有效成分含量與年平均氣溫呈正相關的結果吻合。

位于寧強縣巴山北坡高中山區(qū)的毛壩河鎮(zhèn)、禪家?guī)r鎮(zhèn)、二郎壩鎮(zhèn)及巴山鎮(zhèn)的氣候特點為氣溫低、風速大、促生產(chǎn)月降水量大、光照稍不足,浸出物含量相對較低,6種有效成分含量相對居中,在天麻栽培過程中應注意調節(jié)林分郁閉度,采取覆蓋保溫和防積水等措施;寧強縣北部秦嶺南坡中山的代家壩鎮(zhèn)、巨亭鎮(zhèn)、大安鎮(zhèn)、太陽嶺鎮(zhèn)以及縣南部的二郎壩鎮(zhèn)、巴山鎮(zhèn)的氣候特點為7-8月降水量相對較少,光照充足,氣溫較低,2-4月、9-11月降水量稍不足,浸出物和6種有效成分含量相對較低,種植天麻時應注意在天麻生長前期和中后期適當補水,適當調節(jié)林分郁閉度;寧強縣中部代家壩鎮(zhèn)、胡家壩鎮(zhèn)、漢源街道辦、高寨子街道辦、鐵鎖關鎮(zhèn)、陽平關鎮(zhèn)的氣候特點為氣溫較高、光照較為充足、風速較低、降水量較為充沛,浸出物和6種有效成分含量相對較高,栽培時應當注意林分郁閉度、溫度和濕度的調控,保持通風以保證產(chǎn)量;寧強縣西部低山區(qū)青木川鎮(zhèn)、廣坪鎮(zhèn)、安樂河鎮(zhèn)、燕子砭鎮(zhèn)的氣候特點為氣溫高,促生產(chǎn)月降水量少,風速低,氣候較不利于天麻增產(chǎn),浸出物和6種有效成分含量相對居中,栽培時應當注意調控溫度和濕度。

4 結論

陜西省漢中市寧強縣天麻浸出物含量與年平均氣溫、年平均水氣壓、土壤沙含量均呈顯著或極顯著正相關,與年平均降水量、年平均風速、海拔、土壤淤泥含量均呈顯著負相關;6種有效成分總量與年平均降水量、年平均氣溫、年平均風速均呈顯著正相關,與海拔、坡度呈顯著負相關。生態(tài)環(huán)境因子與天麻浸出物及有效成分含量的關系為氣候>海拔>土壤,氣候因子中影響較大的為12月降水量、4月風速和12月平均氣溫。與坡度相比,海拔影響較大。土壤因子中影響最大的為土壤淤泥含量,其次為土壤沙含量。

本研究從小尺度層面上探究生態(tài)環(huán)境因子對天麻品質相關成分含量的影響,研究結果可為寧強縣優(yōu)質天麻培育及天麻資源合理開發(fā)利用提供參考,同時為其他行政區(qū)域面積大、地形地貌復雜縣域的中藥材產(chǎn)業(yè)規(guī)劃提供參考。在具體研究過程中應考慮到所用生態(tài)環(huán)境因子數(shù)據(jù)庫的實時性和分析方法的準確性。