谷氨酰胺代謝對(duì)巨噬細(xì)胞表型極化的調(diào)控作用研究

王卓,李嫻靜，張啟春

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.中國(guó)藥科大學(xué)藥物科學(xué)研究院，江蘇 南京 211198)

巨噬細(xì)胞是機(jī)體中一類非常重要的免疫細(xì)胞，廣泛分布于機(jī)體的各個(gè)組織中，參與調(diào)節(jié)機(jī)體的組織穩(wěn)態(tài)[1]。巨噬細(xì)胞具有極強(qiáng)的可塑性和異質(zhì)性，在LPS或干擾素的刺激下，表現(xiàn)出經(jīng)典型極化即M1極化，表達(dá)大量的促炎因子如白介素-6(interleukin 6,IL-6)、白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、白介素-12(interleukin 12，IL-12)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)等，同時(shí)高表達(dá)抗原提呈相關(guān)分子如MHCII、CD86、CD80等，殺傷病原體和腫瘤細(xì)胞,發(fā)揮抗腫瘤抗感染的作用；相反，巨噬細(xì)胞在IL-4或IL-13的刺激下，表現(xiàn)出替代性極化即M2極化，高表達(dá)抑炎因子TGF-β、IL-10、精氨酸酶(arginase 1,Arg1)等，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)血管生成，參與組織重塑與修復(fù)。健康狀態(tài)下，機(jī)體中的巨噬細(xì)胞處于M1與M2動(dòng)態(tài)平衡中，若M1極化高強(qiáng)度持續(xù)存在，過(guò)度炎癥導(dǎo)致自身組織損傷，若M2極化持續(xù)存在，則不利于機(jī)體有效清除病原體。因此，巨噬細(xì)胞極化的精確調(diào)控對(duì)于機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

谷氨酰胺(glutamine,Gln)是體內(nèi)含量最豐富的氨基酸，在機(jī)體創(chuàng)傷及感染時(shí)，被視為“條件必需氨基酸”[3]。谷氨酰胺是許多細(xì)胞和組織最重要的能源物質(zhì)，尤其是免疫細(xì)胞如淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們對(duì)Gln的利用率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)其他氨基酸[4]。但Gln對(duì)巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控作用尚不明確，本實(shí)驗(yàn)研究Gln對(duì)原代巨噬細(xì)胞表型的調(diào)控作用，為Gln的臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠10只，體重20～22 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(蘇)2018-2019。在中國(guó)藥科大學(xué)新藥安全評(píng)價(jià)研究中心飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑 DMEM(不含谷氨酰胺)購(gòu)自Thermo Fisher公司；Trizol、實(shí)時(shí)定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Real-time Master購(gòu)自TaKaRa；CB839購(gòu)自MCE；重組小鼠M-CSF購(gòu)自Peprotech。

1.1.3 引物序列 具體見(jiàn)表1。

表1 Real-time PCR引物序列表

1.2 方法

1.2.1 骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(bone marrow derived macrophage,BMDM)提取 將小鼠脫頸處死，浸泡于裝有75%酒精的燒杯，浸泡2 min左右；取下小鼠脛骨和股骨；用注射器(2.5 mL)吸取PBS沖出骨髓中細(xì)胞；離心，300 g，5 min,4 ℃；2 mL培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，用70 μm濾器過(guò)濾細(xì)胞，去除結(jié)締組織及骨頭等非細(xì)胞成分；將過(guò)濾所得的細(xì)胞再次離心，棄上清，加10 mL含100 ng·mL-1M-CSF的培養(yǎng)基重懸后加至10 cm培養(yǎng)皿，該細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)使其分化，每3 d換液一次，第6天后進(jìn)行藥物處理。

1.2.2 巨噬細(xì)胞藥物處理 ①谷氨酰胺剝奪處理：BMDM培養(yǎng)至第6天，鋪6孔板，每孔1×106個(gè)細(xì)胞；將細(xì)胞分為兩組：+ Gln組(正常培養(yǎng)基)及-Gln組(無(wú)谷氨酰胺培養(yǎng)基)，各6個(gè)孔，處理6 h后將6孔板取出提取RNA。②谷氨酰胺抑制劑處理：將細(xì)胞分為3組：對(duì)照組、IL-4(50 ng·mL-1)、IL-4+CB-839(1 μmol·L-1)，每組各6個(gè)孔，孵育6 h后將6孔板取出提取RNA。

1.2.3 給藥后的巨噬細(xì)胞M1/M2標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平檢測(cè) Trizol法提取RNA，超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度，使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，去除基因組DNA，采用PrimerBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的引物序列，由金斯瑞生物科技有限公司合成引物。配置PCR反應(yīng)液，采用兩步法PCR擴(kuò)增程序，用每個(gè)樣本的目的基因Ct值減去內(nèi)參基因Ct值：ΔCt樣本=Ct樣本-Ct內(nèi)參；將對(duì)照組的ΔCt值取平均值ΔCt對(duì)照：ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt對(duì)照，計(jì)算出2-ΔΔCt。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 谷氨酰胺剝奪對(duì)骨髓來(lái)源的巨噬細(xì)胞表型極化的影響 如圖1所示，使用RT-PCR技術(shù)分別檢測(cè)剝奪谷氨酰胺與未剝奪谷氨酰胺的BMDMs中M1型特異性標(biāo)志基因IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與未剝奪谷氨酰胺的BMDMs相比，剝奪谷氨酰胺的BMDMs的IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS表達(dá)水平顯著增加。剝奪谷氨酰胺后，巨噬細(xì)胞中IL-12、IL-6、IL-1β、iNOS的基因表達(dá)水平分別增加了7.5、80、24、48倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A.IL-12基因表達(dá)；B.IL-6基因表達(dá)；C.IL-1β基因表達(dá)；D.iNOS基因表達(dá)

2.2 谷氨酰胺酶抑制劑CB-839對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表型極化的影響 如圖2所示，與對(duì)照組相比，IL-4組均顯著上調(diào)M2型特異性基因mRNA表達(dá)水平，如Arg1、Chil3、Mrc1表達(dá)水平相比對(duì)照組均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明IL-4成功誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2型極化。同時(shí)給予 CB-839后，IL-4誘導(dǎo)M2型標(biāo)志物的表達(dá)均顯著降低；此外，CB-839處理亦能促進(jìn)M1型特異性基因IL-1β和iNOS的表達(dá)水平增加。以上結(jié)果表明CB-839能夠抑制BMDMs在IL-4誘導(dǎo)下向M2型極化的能力，增強(qiáng)其向M1型轉(zhuǎn)化的能力。

A.Arg1；B.Chil3；C.Mrc1；D.IL-1β；E.iNOS的mRNA表達(dá)水平(n=6；IL-4：50 ng·mL-1，CB-839：1 μmol·L-1)

3 討論

本研究通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR方法研究谷氨酰胺代謝對(duì)巨噬細(xì)胞極化的作用，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺剝奪抑制M2型極化，而谷氨酰胺酶抑制劑CB-839處理亦能抑制巨噬細(xì)胞M2極化且增加M1型標(biāo)志基因的表達(dá)，表明谷氨酰胺代謝過(guò)程對(duì)巨噬細(xì)胞具有調(diào)控作用。

谷氨酰胺通過(guò)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ASCT2和 SN2穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入胞漿后，首先通過(guò)谷氨酰胺酶(GLS/GLS2)轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸通過(guò)谷氨酸脫氫酶(GLUD)或轉(zhuǎn)氨酶(如谷氨酸-草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、谷氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶(GPT)和磷酸絲氨酸轉(zhuǎn)氨酶(PSAT)兩條不同的途徑轉(zhuǎn)化為α-酮戊二酸(α-KG)[5]。谷氨酰胺酶抑制劑CB-839處理顯著抑制巨噬細(xì)胞M2極化且增加M1型標(biāo)志基因的表達(dá)，表明谷氨酰胺代謝過(guò)程中產(chǎn)生的代謝物α-KG可能是巨噬細(xì)胞表型極化的關(guān)鍵分子。αKG是雙加氧酶催化底物羥基化的重要輔因子，其與Fe2+構(gòu)成的雙加氧酶酶活中心結(jié)合，在氧氣的參與下，活化的兩個(gè)氧原子分別進(jìn)攻底物和αKG，進(jìn)而生成羥基化的底物[5]。組蛋白去甲基化酶KDM家族、DNA去甲基化酶Tets家族及RNA去甲基化酶ALKBH5、FTO等均為雙加氧酶。因此，αKG能夠介導(dǎo)全基因組水平的組蛋白、DNA及RNA甲基化狀態(tài)的改變，從而誘導(dǎo)細(xì)胞表觀重編程[6-7]。Liu等[8]研究發(fā)現(xiàn)αKG能夠抑制小鼠肺巨噬細(xì)胞M1極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化，亦有研究顯示谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的αKG促進(jìn)腫瘤微環(huán)境免疫抑制性髓細(xì)胞的形成[9]。因此，谷氨酰胺代謝可能通過(guò)αKG介導(dǎo)巨噬細(xì)胞表觀重編程，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化。CB-839已進(jìn)入臨床試驗(yàn)(NCT02071862)，已被證明在治療三陰性乳腺癌方面具有療效[10]，其有可能通過(guò)調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞M1極化從而增加其抗腫瘤功能。本研究為谷氨酰胺及其代謝過(guò)程抑制劑在臨床的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。