不同劑量天麻素對甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬中TLR4/MyD88/NF-κB 炎癥信號通路的影響

朱婷娜 ，曹媛媛 ，張 園 ，劉鵬亮 ，王一航 ，吳亞梅 ，李利華 ，趙永娜 ，洪仕君

（1）昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室;2）法醫(yī)學院;3）國際教育學院，云南 昆明 650500;4）云南省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，云南 昆明 650106）

甲基苯丙胺（Methamphetamine，Meth）具有強效的成癮性，在全世界范圍內(nèi)濫用，嚴重損害社會秩序和身體健康[1]。反復攝入Meth 會對中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成眾多負面影響，長期濫用Meth 會激活膠質細胞，使炎癥介質和毒性分子過度積累誘導神經(jīng)毒性，同時改變大腦的結構和功能，導致大腦的認知功能發(fā)生障礙[2]。海馬對藥物成癮的調節(jié)受到廣泛關注，海馬體在調節(jié)藥物相關行為的聯(lián)想記憶中起重要作用，而這些行為可能會在藥物再次暴露時引起復發(fā)[3]。已有眾多研究發(fā)現(xiàn)Meth 濫用會導致海馬結構和功能發(fā)生改變，誘導神經(jīng)炎癥的發(fā)生。神經(jīng)炎癥會改變神經(jīng)元的興奮性、可塑性，引發(fā)星形膠質細胞功能障礙，血腦屏障通透性受損和神經(jīng)變性等一系列的過程，最終可能導致抑郁、精神障礙和認知障礙等神經(jīng)精神疾病的發(fā)生[4?5]。Toll 樣4 受體（Toll like receptor 4，TLR4）作為一個跨膜識別受體，主要是通過MyD88 途徑在免疫和炎癥中發(fā)揮關鍵作用[6]。腫瘤壞死因子受體相關因子6（Tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）和磷酸化的NFκB 抑制因子（Inhibitor of NF-κB，IκB）是TLR4的下游蛋白，是炎癥反應的進程和NF-κB 轉導過程中的重要調控因子[7?8]。NF-κB 的活性程度與機體炎癥反應的發(fā)生和眾多生理功能的形成密切相關，其中p65 是NF-κB 的主要活性亞單位[9]。TLR4/MyD88/NF-κB 通路可能參與Meth 誘導的神經(jīng)炎癥的發(fā)生，該通路是探索炎癥發(fā)生機制和選擇藥物治療靶點的研究熱點之一。

天麻素（Gastrodin，Gas）是從傳統(tǒng)中藥材天麻的根莖中經(jīng)化學方法獲得的生物活性化合物，具備安眠、抗炎、抗驚厥、改善學習與記憶的藥理作用。大量研究發(fā)現(xiàn)，天麻素在治療焦慮、抑郁、腦損傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病有重要作用?；谏鲜霰尘?，天麻素的抗炎作用是否通過TLR4/MyD88/NF-κB 這條經(jīng)典的炎性通路發(fā)揮作用具有較大的研究價值。本研究擬采用不同劑量的天麻素干預CPP 大鼠，探索天麻素是否通過對TLR4/MyD88/NF-κB 通路關鍵因子的調控，而發(fā)揮對Meth 依賴CPP 大鼠海馬的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SD 大鼠 60 只，雄性，體重（190±10）g，購自昆明醫(yī)科大學實驗動物部[許可證號：SCXK（滇）K2015-002]。實驗大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，在實驗開始前，先將大鼠放于CPP 箱內(nèi)適應性飼養(yǎng)3 d。

1.2 實驗主要藥品和試劑

實驗使用的Meth 由云南省公安廳公安部重點實驗室合法提供，經(jīng)過萃取、分離純化。干燥后將其制成鹽酸鹽結晶體保存，純度在98%以上。實驗使用的天麻素純度98.0%，由昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程中心陸地教授提供，為白色粉狀物，室溫干燥后保存。TLR4 抗體（sc-293072、美國Santa Cruz Biotechnology 公司）；MyD88 抗體（ab2064，美國Abcam 公司）；NF-κB p65 抗體（8142s、德國CST 公司）；p-NF-κB p65 抗體（sc-136548、美國Santa Cruz Biotechnology 公司）；IκB-α 抗體（9242、德國CST 公司）；p-IκBα 抗體（2859、德國CST 公司）；TRAF6 抗體（66494、美國Proteintech 公司）；β-actin 抗體（ab6276，美國Abcam 公司）；HRP 標記羊抗兔二抗（L3012、美國SAB 公司）；HRP 標記羊抗鼠二抗（A21010、美國Abbkine 公司）；熒光定量試劑盒（DBI-2043、德國DBI 公司）；BestarTMqPCR RT Kit（DBI-2220、德國DBI 公司）；引物合成由擎科生物科技有限公司合成。

1.3 主要實驗儀器

大鼠 CPP 實驗箱（XR-XT401，上海欣軟信息有限公司）；酶標儀（Touch 2，美國BioTek 公司）；普通PCR 儀、熒光定量 PCR 儀（T100TMThermal Cycler、C1000 TouchTMThermal Cycler，美國Bio-Rad 公司）；垂直電泳儀、半干轉膜儀（552BR、221BR，美國Bio-Rad 公司）。

1.4 動物分組及處理

實驗動物以隨機的形式被分為6 組，每組10 只。這6 組包括對照組、Meth 組、天麻素組、Meth+低中高劑量天麻素干預組（10、30、100 mg/kg）。對照組和Meth 組分別給予10 mg/kg生理鹽水和10 mg/kg Meth；天麻素組給予100 mg/kg 天麻素。給藥方式皆使用腹腔注射（intraperitonealinjection，IP），1 次/d，連續(xù)不間斷給藥14 d。根據(jù)給藥方法，Meth 依賴CPP 大鼠模建立成功[10]。Meth+低中高劑量天麻素干預組（10、30、100 mg/kg），前14 d 和Meth 組操作相同；在Meth 依賴模型建立成功后，根據(jù)組別分別予以對應劑量的天麻素（10、30、100 mg/kg）干預，每天1 次，持續(xù)14 d。

1.5 CPP 實驗

CPP 實驗適應階段（d1～3），打開2 個箱體之間的隔板，讓大鼠自由探索，每次30 min，每日1 次。在d4，讓大鼠在CPP 箱內(nèi)訓練15 min，測定每只大鼠15 min 內(nèi)在兩箱的停留時間，評判大鼠的天然偏愛性，將大鼠停留時間短的箱體指定為伴藥箱。CPP 訓練階段（Day5-Day18），封閉2箱體連接通道，連續(xù)14 d 對大鼠采用腹腔注射后，立刻放入伴藥箱進行適應30 min。d19，將隔板打開，使大鼠在CPP 箱體內(nèi)自由探索15 min，測定大鼠在伴藥箱的停留時間。天麻素干預階段（d20-35），確保大鼠產(chǎn)生CPP 效應后，再采用低中高劑量的天麻素（10、30、100 mg/kg）連續(xù)不間斷干預14 d，干預結束后再將大鼠放入箱體內(nèi)進行CPP 測試，用時15 min。

1.6 實驗大鼠海馬組織取材

CPP 測試結束后，經(jīng)乙醚吸入麻醉所有大鼠，暴露其胸腔和腹腔，灌注生理鹽水至肝臟發(fā)白，斷頭取出全腦，參照《大鼠立體定位圖譜》（第2 版），暴露海馬組織并分離，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 Western Blot 實驗

將海馬組織清洗剪碎，加入適量RIPA 組織裂解液，將組織超聲破碎后室溫放置30 min，每10 min 上下振搖1 次。離心15 min 后進行蛋白定量分析。進行電泳、轉膜、封閉、一抗孵育（抗體配制比例除β-actin 為1∶10000，TLR4、MyD88、TRAF6、IκB -α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α 配制比例均為1∶1000），置于4℃孵育過夜。洗膜后孵育二抗（室溫/2 h），再次洗膜，利用ECL 顯影。以β-actin 作為標準化的對照。Image J 軟件計算條帶的平均灰度值（OD 值）。

1.8 熒光定量PCR 實驗

海馬組織中加入適量Trizol 裂解液，獲取組織內(nèi)總RNA，使用酶標儀測定RNA 濃度，一般測定兩次取平均值。之后按照說明書逆轉錄合成cDNA。之后擴增目標基因，經(jīng)預變性（5 min/94 ℃），變性（10 s/ 94 ℃），退火（10 s/53 ℃），延伸（20 s/60 ℃）共展開40 個循環(huán)。完成后檢測得到擴增曲線從而計算出Ct 值。目標基因相對表達量采取2-ΔΔCt法進行計算。引物序列，見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer Sequences

1.9 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 19.0、GraphPad Prism 5.0 等軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，采取單因素方差分析及t檢驗對數(shù)據(jù)進行比較分析。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

實驗結果見圖1、圖2，與對照組比較，Meth 組TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達均升高（P<0.01、P<0.05 或P<0.001），p-NF-κB p65、p-IκB-α 的蛋白表達升高（P<0.01 或P<0.05），IκB-α 蛋白和mRNA 表達均降低（P<0.01）。與Meth 組相比，經(jīng)低中高不同劑量的天麻素（10、30、100 mg/kg）持續(xù)作用14 d 后，天麻素呈劑量相關性地升高了IκB-α 的蛋白和mRNA 表達（P<0.01 或P<0.05）。TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達（P<0.001、P<0.01 或P<0.05）與p-NF-κB p65 的蛋白表達（P<0.01 或P<0.05）均降低，且與天麻素給藥呈劑量相關性。p-IκB-α 的蛋白表達降低（P<0.01）。

圖1 不同劑量天麻素對甲基苯丙胺依賴CPP 大鼠海馬TLR4、MyD88、TRAF6、p-IκB-α、IκB-α、NF-κB p65、p-NFκB p65 蛋白表達的影響Fig.1 The effect of different doses of gastrodin on the expression of TLR4，MyD88，TRAF6，p-IκB-α，IκB-α，p-NF-κB p65，NF-κB p65 proteins in the hippocampus of methamphetamine-dependent rats

圖2 不同劑量天麻素對Meth 依賴大鼠海馬TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κB p65 mRNA 表達的影響Fig.2 The effect of different doses of gastrodin on the mRNA expression of TLR4，MyD88，TRAF6，IκB-α，NF-κB p65 in the hippocampus of meth-dependent rats

3 討論

甲基苯丙胺作為一種高度成癮的精神興奮劑，是世界上濫用最廣泛的藥物之一。持續(xù)使用Meth會導致神經(jīng)退行性病變和認知功能障礙，炎癥可能是Meth 導致神經(jīng)毒性的一個重要原因。大量研究表明，Meth 通過激活小膠質細胞，影響海馬等大腦相關區(qū)域炎癥因子的變化，最終影響海馬的多種生理功能[3，11?13]。海馬是大腦中與學習和記憶密切相關的腦區(qū)，在研究成癮物質的復吸性和成癮記憶形成方面有著重要價值[14]。CPP 模型是研究情景關聯(lián)和獎勵相關行為的經(jīng)典動物模型[15?17]。本研究通過連續(xù)不間斷給予10 mg/kg Meth 14d（ip，qd）成功建立Meth 依賴CPP 大鼠模型。

TLR4 作為天然免疫識別受體，通過MyD88通路發(fā)揮作用。其過程為TLR4 與MyD88 橋接，其中涉及TRAF6 的激活，增強IκB 的磷酸化，從而導致NF-κB 級聯(lián)的活化[18，19]。TLR4/MyD88/NF-κB 信號的過度活化可引起機體產(chǎn)生大量炎性物質，從而誘發(fā)或加重神經(jīng)炎癥反應。在Meth大鼠毒性模型中，大鼠紋狀體中的神經(jīng)炎癥反應與TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB 等蛋白的高表達相關，大鼠海馬CA1 區(qū)也會因炎性因子表達增加而產(chǎn)生神經(jīng)炎癥[8,20]。Re G F 等[21]發(fā)現(xiàn)，在急性戒斷期間，Meth 會導致小鼠紋狀體和海馬釋放的小膠質細胞活化和促炎細胞因子增加，引起神經(jīng)炎癥。本研究采用Western Blot 和RT-qPCR同時檢測通路相關蛋白和mRNA 的表達情況，筆者發(fā)現(xiàn)，與空白對照組相比，Meth 組的通路相關蛋白和mRNA 表達顯著增加，結果提示Meth 激活TLR4/MyD88/NF-κB 通路誘導Meth 依賴大鼠海馬產(chǎn)生神經(jīng)炎癥。天麻素是一種酚類糖苷，具有鎮(zhèn)靜、抗眩暈、抗焦慮、改善記憶、抗炎、抑制膠質細胞活化等藥理作用，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療具有潛力[22]?，F(xiàn)有研究表明[23?25]，天麻素在炎癥調控方面效果顯著，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。劉英杰等的研究以毛果蕓香堿誘發(fā)癲癇大鼠為模型，發(fā)現(xiàn)天麻素會產(chǎn)生抗炎作用，主要表現(xiàn)在天麻素可降低大鼠海馬組織中TLR4/NF-κB 信號通路關鍵蛋白的表達[26]。Mei Z X 等[27]的研究發(fā)現(xiàn)天麻素可降低先兆子癇引起的 MyD88 表達上調。文歡等[28]研究發(fā)現(xiàn)天麻素干預使NF-κB p65、p-NF-κB p65 等炎癥相關信號分子的表達下調，從而減輕皮層神經(jīng)細胞糖氧剝奪再復供的炎性損傷。Zheng X 等學者[29]研究發(fā)現(xiàn)天麻素通過影響TLR4/NF-κB/NLRP3 通路改善由脂多糖誘導的大鼠海馬神經(jīng)炎癥。課題組前期的研究也證實天麻素在Meth 成癮和Meth 誘導的神經(jīng)毒性損傷方面皆有積極意義[30?31]。因此，從炎癥方面著手對Meth 依賴進行干預治療或許有很好的效果。本研究發(fā)現(xiàn)，與Meth 組相比，經(jīng)低中高劑量的天麻素干預14 d 后，Meth 依賴CPP 大鼠海馬中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65 的蛋白和mRNA 表達，p-NF-κB p65 的蛋白表達皆隨天麻素劑量呈依賴性降低；IκB-α 的蛋白和 mRNA 表達皆隨天麻素劑量呈依賴性升高；p-IκB-α 的蛋白表達降低。結果提示天麻素可通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB 通路關鍵因子的表達，改善Meth 依賴導致的神經(jīng)炎癥。本研究在Meth 依賴大鼠CPP 模型中通過蛋白和mRNA 水平首次提出天麻素可通過抑制 TLR4/MyD88/NF-κB 通路關鍵因子的表達，緩解Meth 依賴導致的神經(jīng)炎癥。

綜上所述，本研究重點闡述不同劑量的天麻素對Meth 依賴CPP 大鼠的干預作用。研究發(fā)現(xiàn)，Meth 依賴誘導的神經(jīng)炎癥與TLR4、MyD88、NFκB 等蛋白的高表達相關，天麻素可通過介導TLR4/MyD88/NF-κB 信號轉導通路，調節(jié)Meth誘導的神經(jīng)炎癥，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。進一步為天麻素對Meth 依賴所致的神經(jīng)炎癥的治療提供了新的思路。