代謝工程改造微生物固定二氧化碳研究進展

陶雨萱，郭亮，高聰，宋偉，陳修來

（1 江南大學食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2 江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214122）

在過去的4萬年中，大氣中的二氧化碳（CO2）濃度始終穩(wěn)定在200～280μL/L，而隨著石化燃料使用量的急劇增加，在近50年內，CO2濃度猛增到414μL/L，未來將會導致約24%的動植物滅絕[1?2]。因此，在控制CO2排放的基礎上，還需從大氣中去除CO2以減輕氣候變化造成的破壞性影響[3]。除了天然的植物封存外，多年來研究者們致力于采用物理、化學等多種手段以實現(xiàn)CO2的捕集和利用。例如，改造現(xiàn)有發(fā)電廠的后燃技術[4]、用于燃料預處理的一體化氣化聯(lián)合循環(huán)技術[5]和CO2膜分離技術[6]等。但是，由于CO2捕集設備安裝成本較高、CO2封存運輸過程復雜、部分設施運行效率低下等問題，使得傳統(tǒng)CO2捕集與封存技術在實際應用過程中存在困難[7]。

微生物CO2固定是促進碳利用與減排的新思路，主要側重于CO2固定酶的挖掘與改造、CO2固定路徑的探索與優(yōu)化以及CO2固定微生物的進化與設計，為實現(xiàn)“碳達峰、碳中和”的國家重大戰(zhàn)略目標提供技術支撐。微生物CO2固定技術不僅具有污染小、成本低、能源消耗少等優(yōu)點，而且可以綠色合成高價值化學品，包括生物柴油、生物塑料和生物醫(yī)藥等。目前，對于CO2固定酶的研究已經(jīng)從天然CO2固定酶的挖掘與強化逐漸發(fā)展為CO2固定人工酶的從頭設計與理性改造。例如，通過在光合作用生物Synechocystissp. PCC 6803中過量表達卡爾文（CBB）循環(huán)路徑關鍵酶——1,5?二磷酸核酮糖羧化酶（RuBisCo），有效增強了Synechocystissp.的CO2固定效率，提高了乙醇的產(chǎn)量[8]。而在異養(yǎng)微生物大腸桿菌（Escherichia coli）中過量表達來自產(chǎn)琥珀酸曼氏桿菌（Mannheimia succiniciproducens）的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）羧激酶（PECP）后，成功提高羧化反應效率與蘋果酸的生產(chǎn)強度[9]。對于CO2固定途徑的研究，已經(jīng)從天然CO2固定途徑的挖掘與表達優(yōu)化，逐漸發(fā)展為人工CO2固定途徑的從頭設計、合成與應用。目前，天然CO2固定途徑主要包括CBB 循環(huán)、還原三羧酸（RTCA）途徑和3?羥基丙酸（3?HP）雙循環(huán)等，人工CO2固定途徑主要包括巴豆酰輔酶A/乙基丙二酰輔酶A/羥基丁酰輔酶A（CETCH）循環(huán)、丙酮酸羧化酶（Pyc）?草酰乙酸乙酰水解酶（Oah）?乙酸輔酶A連接酶（Acs） ?鐵氧化還原蛋白氧化還原酶（Pfor）（POAP）循環(huán)和人工還原甘氨酸（rGly）途徑等。對于CO2固定微生物的研究，已經(jīng)從自養(yǎng)/異養(yǎng)微生物CO2固定的代謝改造，逐漸發(fā)展為異養(yǎng)人工微生物的固碳重構。例如，在E. coli中引入CBB循環(huán)，并借助定向進化策略，成功獲得了以CO2為唯一碳源、甲酸為唯一能源的化能自養(yǎng)型E. coli。另外，采用類似的策略也成功獲得了以CO2為唯一碳源、甲醇為唯一能源的化能自養(yǎng)型畢赤酵母（Pichia pastoris）[10]。

本綜述圍繞微生物固定CO2過程中的關鍵問題，從自養(yǎng)微生物、異養(yǎng)微生物和人工微生物三個方面，闡述了強化微生物CO2固定效率的代謝工程與合成生物學策略，并展望了微生物固定CO2的進一步發(fā)展與應用的方向。

1 自養(yǎng)微生物固定CO2

通過CO2固定獲得的有機碳是有機化學品和能源物質的主要來源。地球上自養(yǎng)生物的總CO2固定能力可達每年3800 億噸左右[11]。雖然自養(yǎng)微生物能夠以CO2為唯一碳源進行生長，但是其生長速度相對緩慢且生產(chǎn)強度也較低，在工業(yè)上的應用仍然存在一定的限制。隨著代謝工程與合成生物學的快速發(fā)展，可以通過挖掘、改造與優(yōu)化天然CO2固定途徑、增強自養(yǎng)微生物光合作用等策略來改善自養(yǎng)微生物的CO2固定能力。

1.1 天然CO2固定途徑

目前，已經(jīng)報道了6 種天然CO2固定途徑（表1），分別是CBB循環(huán)、RTCA途徑、3?HP雙循環(huán)、Wood Ljungdah（WL）途徑或還原乙酰輔酶A途徑、對羥基丁酸二羧酸酯（DC?4HB）循環(huán)和3?羥基丙酸/4?羥基丁酸（3HP?4HB）循環(huán)（圖1）。然而，自養(yǎng)微生物（包括光合微生物和非光合微生物）在利用天然CO2固定途徑過程中存在催化效率低、能量損失大等問題。為了實現(xiàn)高效的CO2固定，需要挖掘催化效率高、能量需求小的新型天然CO2固定途徑[12]。

圖1 天然CO2固定途徑

表1 天然CO2固定途徑

1.1.1 光合微生物的CO2固定途徑

光合微生物同化CO2的路徑[圖1(a)]主要有CBB循環(huán)、RTCA途徑和3?HP雙循環(huán)[19]。CBB循環(huán)為好氧途徑，關鍵酶為RuBisCo[20]，每固定3mol CO2需消耗9mol ATP 與6mol NAD(P)H，產(chǎn)物為3?磷酸甘油醛[13]。RTCA途徑在厭氧和微氧條件下均可運行，關鍵酶為2?酮戊二酸合成酶和ATP?檸檬酸裂解酶，每固定2mol CO2需消耗2mol ATP 與4mol NAD(P)H，產(chǎn)物為乙酰輔酶A[11,21]。3?HP 雙循環(huán)是好氧循環(huán)，關鍵酶為丙酰輔酶A合成酶和丙二酰輔酶A還原酶，每固定3mol HCO?3需消耗5mol ATP與5mol NAD(P)H，產(chǎn)物為丙酮酸[15]。目前，研究人員雖然充分解析了光合微生物的CO2固定途徑，但光合微生物仍然面臨光能轉化效率低、菌株生長緩慢等問題，從而限制了光合微生物的工業(yè)化應用進程。

1.1.2 非光合微生物的CO2固定途徑

非光合微生物可以通過不同的固定CO2途徑進行生長[圖1(b)]，主要包括WL 途徑、RTCA 途徑、DC?4HB 循環(huán)和3HP?4HB 循環(huán)[22]。WL 途徑只能在嚴格的厭氧條件下運行，關鍵酶為一氧化碳脫氫酶、甲酸脫氫酶和甲?；秽摎涿竅16]，每固定2mol CO2需消耗1mol ATP 與4mol NAD(P)H，產(chǎn)物為乙酰輔酶A[14]。DC?4HB 循環(huán)可以在厭氧和微氧條件下運行，關鍵酶為4?羥基丁酰輔酶A脫水酶，每固定1mol CO2與1mol HCO?3需消耗3mol ATP 與4mol NAD(P)H，產(chǎn)物為乙酰輔酶A[17]。3HP?4HB循環(huán)是好氧循環(huán)，關鍵酶為4?羥基丁酰輔酶A 脫水酶，每固定2mol HCO?3需消耗4mol ATP 與4mol NAD(P)H，產(chǎn)物為乙酰輔酶A[18]。為了提供CO2固定循環(huán)所需的ATP 和還原力，非光合微生物已經(jīng)進化出各種能量供給模塊，如可以從光、氫、硫等獲取能量，但是由于CO2中的碳原子處于最高的正價態(tài)，在熱力學上極為不利，仍有極大的改造空間[23]。

1.2 強化CO2固定途徑

自養(yǎng)微生物可利用CO2作為唯一碳源，將無機碳轉化為有機代謝物，直接合成各種高值化學品，包括生物柴油、生物活性物質、生物肥料等[24]。但由于自養(yǎng)微生物生長速度較慢、轉化效率較低、改造工具不夠完備等缺點，極大地限制了其在工業(yè)上的應用。目前，通過提高CO2固定途徑效率、開發(fā)能量捕集系統(tǒng)、調節(jié)碳代謝流分布等策略（圖2），可以有效改善CO2的生物資源化利用效率[25]。

圖2 自養(yǎng)微生物CO2固定的強化策略

1.2.1 提高CO2固定效率

代謝改造自養(yǎng)微生物強化CO2封存是一種環(huán)境友好的方案，同時還可以生產(chǎn)高值化學品，提高經(jīng)濟效益[19]。近年來，研究人員通過提高羧化酶催化效率、改造與優(yōu)化CO2固定途徑等策略[圖2(a)]，提高了自養(yǎng)微生物的CO2固定效率。在CBB 循環(huán)中，雖然羧化酶發(fā)揮了至關重要的作用，但是RuBisCo也是限制藍藻CO2固定效率的瓶頸之一，主要原因在于RuBisCo 催化的1,5?二磷酸核酮糖（RuBP）氧化反應與羧化反應競爭能量與碳流。基于此，通過引入一種蛋白質融合標簽（FLAGtag），提高了RuBisCo 的表達水平與活性，改善了Synechocystissp. PCC 6803 的光合作用與菌株生物量[26]，且在Synechocystissp. PCC 6803 中 過 量 表 達RuBisCo 后，乙醇產(chǎn)量提高了55%[8]。然而，部分天然的RuBisCo 每秒只能固定3 個CO2分子，羧化效率仍有很大的提高空間[27]。因此，研究人員通過蛋白質工程改造RuBisCo 獲得突變體SP5?V330T，改善了羧化酶的結構以及酶活性，使沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris）的比生長速率提高了80%[28]。通過對伴侶蛋白GroEL/ES 和RbcX 進行表達調控后，使用RuBisCo 依賴型E. coli對藍藻Ⅰ型RuBisCo 進行了定向進化，從而將羧化效率提高了約3 倍，且該突變體的應用能使SynechocystisPCC 6803的光合作用速率提高了約55%[29]。另外，近年來通過新酶資源挖掘，RuBisCo 效率也得到了進一步提升。例如，通過在細胞質中表達來自巨型管蟲（Riftia pachyptila）的Ⅱ型RuBisCo（RPE RuBisCo），有效改善了Synechocystissp. PCC 6803的RuBisCo氧合酶活性，乙醇酸產(chǎn)量達到了2.8g/L[30]。在改造與優(yōu)化CO2固定途徑方面，通過引入異丙醇合成途徑消耗胞內NADH以干擾ATP和NADH需求，從而驅動光反應和暗反應的耦合，使SynechocystisPCC 6803的CO2固定率提高了38%[31]。丙二酰輔酶A?草酰乙酸?乙醛酸（MOG）途徑也是一種更具潛力的CBB循環(huán)替代方案，CO2催化周轉率為CBB循環(huán)的2～3 倍[32]。此外，對已知的CO2固定路徑進行重組，能夠進一步合成具有高轉化效率與動力學優(yōu)勢的CO2固定途徑，包括還原甘氨酸途徑、C4?乙醛酸循環(huán)等[33?34]。將上述CO2固定路徑引入到自養(yǎng)微生物中，有望進一步提高自養(yǎng)微生物的CO2固定效率。

1.2.2 開發(fā)能量捕集系統(tǒng)

自養(yǎng)微生物CO2固定需要大量能量，藻類可以通過光能誘導葉綠體類囊體膜上的電子傳遞鏈產(chǎn)生NADH，為CBB 循環(huán)提供還原力[35]。發(fā)展能量捕集系統(tǒng)的重要方法之一是優(yōu)化光能和電能的利用[圖2(b)]。對于能夠自主捕集光能的微生物，可以通過調節(jié)質子泵視紫紅質（PR）改善藻類對太陽光譜的利用率[36]，例如：通過在Synechocystissp. PCC 6803中異源表達質子泵，證明了優(yōu)化PR的表達可以將太陽能轉化為可利用的代謝能量，使工程菌株具備了一定的生長優(yōu)勢[37]。另外，由于過度吸收光輻射會造成光損傷和光抑制，表達截短的捕光天線復合體（TLA）也能夠提高藻類的光合作用效率。例如：將TLA 技術應用于Synechocystis后，有效地限制了細胞過度吸收光子的能力，最終使光合生產(chǎn)效率提高了約57%[38]。對于不能自主捕集光能的微生物，可以使用納米材料搭建人工光系統(tǒng)，如納米沸石材料[39]、雙頻納米線[40]、基于鈷酞菁的納米管[41]等。例如：利用熱醋穆爾菌（Moorella thermoacetica）與鎘離子（Cd2+）共培養(yǎng)形成沉淀CdS 后，光照下CdS產(chǎn)生電子供給WL途徑并促進CO2轉化為乙酸，其光能轉化為乙酸的峰值量子產(chǎn)率為2.44%[42]。未來可利用基因工程優(yōu)化自養(yǎng)微生物的光合系統(tǒng)，運用蛋白質工程開發(fā)新的捕光蛋白，并應用新型材料增加微生物細胞與材料的親和性，改善電子的傳輸效率。

1.2.3 調節(jié)碳代謝流分布

大多數(shù)藍藻過量合成的化合物是由中間代謝物轉化而來，其中使用最廣泛的中間代謝物是丙酮酸，遠離中心碳代謝的胞內代謝物濃度會明顯低于胞內丙酮酸濃度[43]。因此，通過強化合成途徑和增加碳源供給[圖2(c)]，可以改善碳代謝流通量，從而提升目標代謝物的產(chǎn)量[44]。增強產(chǎn)物合成途徑可以從中間代謝物中提取碳流，用于提高碳固定池的儲量，誘導微生物細胞上調碳捕集機制，從而增加碳固定初始前體的積累量[44]。例如，在Synechocystissp. PCC 6803 中，通過強化表達甲基赤蘚糖醇磷酸（MEP）途徑，增加了類異戊二烯的代謝流通量，最終使類胡蘿卜素產(chǎn)量提高了1.5倍[45]。另一方面，轉錄因子可以對代謝網(wǎng)絡進行更全面的碳代謝流通量調控。例如，轉錄因子PSR1 是觸發(fā)細胞溶質脂質積累的關鍵開關，能夠介導微藻脂質的高效積累[46]。此外，補充碳源可以提供額外的碳結構單元和能量，促進自養(yǎng)微生物的生長與生物量轉化，進而提高固碳能力與代謝物產(chǎn)量。例如，在葡萄糖與光混合營養(yǎng)條件下，工程菌株細長聚球藻（Synechococcus elongatesPCC 7942）固定CO2生產(chǎn)2,3?丁二醇的產(chǎn)量提高了2倍，而且在添加90mmol/L乙酸鹽的條件下可以進一步合成22mg/L 異丙醇[47]。隨著基因組工程和代謝工程的快速發(fā)展，通過精細化調節(jié)自養(yǎng)微生物固碳途徑的碳代謝流通量，從而提高自養(yǎng)微生物目標代謝物合成效率，為實現(xiàn)工業(yè)化應用奠定基礎。

2 異養(yǎng)微生物固定CO2

異養(yǎng)微生物可以通過代謝途徑中的羧化反應來固定CO2，所需底物和能量都源自有機物的分解[48]。在異養(yǎng)微生物生產(chǎn)化學品的過程中，理論上需要足夠的能量才能驅動CO2固定途徑的正常運行，實現(xiàn)CO2固定的凈收益。因此，加強異養(yǎng)微生物的CO2固定策略，主要包括強化CO2羧化途徑、重構CO2固定途徑、優(yōu)化CO2固定過程中的能量供給等（圖3）。

圖3 異養(yǎng)微生物CO2固定的強化策略

2.1 強化CO2羧化途徑

異養(yǎng)微生物具有各種天然的羧化反應，最典型的為PEP 羧化反應[49]和巴豆酰羧化反應[50]。羧化反應的通量是決定異養(yǎng)微生物固碳能力的重要因素，但是已知的羧化酶在固定途徑中的催化效率仍然存在不足。因此可以通過強化羧化反應效率、構建人工羧酶體等策略[圖3(a)]，提升異養(yǎng)微生物的羧化效率。

2.1.1 強化羧化反應效率

為促進異養(yǎng)微生物封存CO2合成高價值化學品，通?？梢酝ㄟ^增強羧化反應效率、優(yōu)化底物或產(chǎn)物轉運速率等策略強化異養(yǎng)微生物的羧化途徑。以E. coli生產(chǎn)蘋果酸為例，通過過量表達來自M. succiniciproducens的PEP 羧激酶，成功提高了PEP羧化反應效率，同時改善了蘋果酸前體（草酰乙酸）的合成效率，最終使蘋果酸的生產(chǎn)強度達到了0.77g/(L·h)[9]。此外，轉運蛋白也可以協(xié)助提升羧化反應的效率。例如，通過在米曲霉（Aspergillus oryzaeNRRL 3488）中過量表達丙酮酸羧化酶與C4?二羧酸轉運蛋白C4T318，使蘋果酸的生產(chǎn)強度提升至0.94g/(L·h)[51]。通過在E. coli中過量表達CO2轉運蛋白（sbtA或bicA）和異源PEP羧化酶，工程菌株的琥珀酸產(chǎn)量增加了10%[49]。除此之外，針對不同的羧化反應需求與羧化酶特性，借助合成生物學方法將蛋白質工程、開關工程等策略用于進一步改進羧化效率。

2.1.2 構建人工羧酶體

羧酶體由緊密堆積的分子層構成，具有六聚體單元，僅允許較小的代謝物通過[52]，并且已經(jīng)成功在異養(yǎng)微生物E. coli中構建出具有六面體結構的人工羧酶體[53]。通過將來源于硫氧化菌（Halothiobacillus neapolitanus）羧酶體的編碼基因HnCB 引入E. coliDH5α，獲得了功能性的六面體結構，且具有更高的CO2固定效率[53]。另外，通過在E. coli中共表達輔助模塊（來自E. coli的伴侶蛋白GroEL/S 和來自藍藻的RbcX）和遺傳模塊（來自海洋原綠球藻（Prochlorococcus marinusMED4）羧酶體的7 個結構蛋白和結構穩(wěn)定因子csoS1D），成功合成了源于P. marinusMED4的人工羧酶體，為實現(xiàn)E. coli高效同化CO2提供了一個模塊化的平臺[54]。然而，由于人工羧酶體的構建過程非常復雜，并且多種外源基因的引入會對宿主菌株的代謝和生長會造成不可避免的抑制作用，因此，在異養(yǎng)微生物中借助人工羧酶體固定CO2生產(chǎn)化學品距離實際的工業(yè)化應用還有一定的差距。

2.2 重構CO2固定途徑

與異養(yǎng)微生物的天然羧化反應相比，重構CO2固定途徑能夠更好地調節(jié)碳通量，實現(xiàn)目標產(chǎn)物的合成。但是，構建高效的CO2固定途徑需要對多種異源酶進行合理的整合與優(yōu)化，這仍然是一個重大挑戰(zhàn)。目前，對于異養(yǎng)微生物CO2固定途徑重構的研究，主要集中于天然固碳途徑的異源引入與優(yōu)化、混菌固碳路徑的創(chuàng)建等方面[圖3(b)]。

2.2.1 引入異源CO2固定途徑

通過將CO2固定途徑引入異養(yǎng)微生物，從而可以在異養(yǎng)微生物體內構建獲得完整的CO2固定模塊，包括3?HP 循環(huán)和CBB 循環(huán)等。由于3?HP 循環(huán)中的CO2固定率較高，受氧氣限制較小，研究人員將3?HP 循環(huán)細分為4 個子路徑，即丙酰輔酶A合成、琥珀酸合成、乙醛酸生成和乙酰輔酶A 再生、丙酮酸生成和乙酰輔酶A 再生，并在E. coliK12 中以操縱子的形式表達了3?HP 循環(huán)中的關鍵酶mcra和pcs[55]。雖然部分3?HP 循環(huán)已經(jīng)成功在E. coli中構建，但是3?HP 循環(huán)仍然不能完整地運行[55]。因此，研究人員進一步嘗試了CBB循環(huán)和還原甘氨酸途徑。例如，通過在E. coli中表達源自藍藻CBB循環(huán)的關鍵酶——磷酸核糖激酶（PRK）和RuBisCo，并結合藍藻中參與碳富集的碳酸酐酶，有效地改善了E. coli的CO2固定效率，最終工程菌株的CO2固定速率提升至22.5mg CO2/g DCW/h[56]。為進一步強化異源CO2固定途徑的功能，通過計算機模型設計與實驗室定向進化相結合，將完整的CBB循環(huán)分為兩個模塊（TCA循環(huán)模塊和CBB循環(huán)模塊），最終在異源宿主E. coli中構建了功能齊全的CO2固定循環(huán)，能夠在無外源輸入有機碳的情況下合成己糖和戊糖，獲得了首個半自養(yǎng)型E. coli[57]。然而，在宿主菌株中完全引入異源且催化步驟較多的CO2固定路徑會造成較大的菌株代謝負荷，且部分路徑關鍵酶會對菌株生長產(chǎn)生不利影響。因此，如何在保障宿主菌株細胞生長與產(chǎn)物合成的基礎上充分合理地分配胞內資源改善宿主菌株的CO2固定效率仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。

2.2.2 構建混菌CO2固定體系

混菌發(fā)酵體系可以有效地結合不同微生物各自的優(yōu)點，往往具有更高的魯棒性和生產(chǎn)效率。將混菌發(fā)酵體系應用于CO2固定過程，可實現(xiàn)不同菌株的勞動分工，先利用固碳微生物將CO2轉化成更易代謝的底物或者中間代謝物，再利用非固碳微生物將中間代謝物應用于目標產(chǎn)物的合成[58]。通過將混菌體系中的不同菌株安排在不同功能模塊中，有利于充分發(fā)揮菌株各自的最佳生理功能，最終建立新的多步固碳路徑[59]。2016年，研究人員提出了一種兩階段系統(tǒng)的集成轉換方法，可以將氣態(tài)一碳原料轉化為生物脂質，最終用于生產(chǎn)生物柴油。在第一階段，在厭氧生物反應器中使用M. thermoacetica將氣體混合物（CO2、CO、H2）轉化為乙酸；在第二階段，利用解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）以乙酸為底物生產(chǎn)C16～C18三?；视王?，總生產(chǎn)強度達到了0.19g/(L·h)[60]。不久后，研究人員進一步采用細菌共培養(yǎng)體系，以CO2為原料生產(chǎn)聚羥基鏈烷酸酯（PHA）。首先利用S. elongatus cscB將CO2轉化為蔗糖，再借助惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida cscAB）以蔗糖為底物生產(chǎn)PHA，生產(chǎn)強度可達23.8mg/(L·d)[61]。未來可以通過以下幾個方面進一步提高混菌發(fā)酵體系的適用性，主要包括開發(fā)更廉價的生物反應器、研究更適宜的生長條件、確立更合理的碳源分配策略和探索更高效的模塊化生產(chǎn)等。

2.3 優(yōu)化CO2固定能量供給

在異養(yǎng)微生物固定CO2生產(chǎn)化學品的過程中，對能量有著較高的要求。不僅如此，CO2固定長路徑的驅動也需要較多的能量供應。穩(wěn)定持續(xù)的能量供給對于維持代謝流通量和微生物生產(chǎn)性能都具有重要作用，如在工業(yè)高密度發(fā)酵過程中，微生物的細胞生長和產(chǎn)物合成通常受到還原力供應的限制[62]?；诖耍环矫婵梢詢?yōu)化內源能量的供給直接為細胞提供更多的能量，另一方面也可以利用外源易獲取的能量來彌補能量缺口[圖3(c)]。

2.3.1 內源能量的供給

在異養(yǎng)微生物中，天然能量代謝在所有生物過程中具有最高的質量通量密度，為后續(xù)的代謝與轉化提供了全部的能量驅動力[63]。目前，優(yōu)化異養(yǎng)微生物CO2固定過程中能量供給策略，主要側重于直接增加NAD(P)H 與ATP 供應、改善底物磷酸化水平、改造電子傳輸鏈等。優(yōu)化細胞內源能量代謝的最直接的方式是增加NAD(P)H與ATP 供應。例如，通過在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中功能性表達CBB循環(huán)關鍵酶——PRK和RuBisCo，促使S. cerevisiae工程菌株以CO2作為NADH 再氧化的電子受體，從而使乙醇產(chǎn)量提高了14%[64]。同樣的方法同樣也適用于E. coli。在E. coli中引入CBB 循環(huán)關鍵酶的基礎上，將ATP 再生型磷酸烯醇丙酮酸羧激酶與ATP 消耗型RuBisCo 相結合，有效改善了工程菌株的CO2固定效率，最終使蘋果酸產(chǎn)量提高至387mmol/L[65]。此外，異養(yǎng)微生物內源還原力的調控還可以通過改善底物磷酸化水平和改造電子傳輸鏈來實現(xiàn)[62]。例如，借助產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）以CO2和H2為底物直接生產(chǎn)乙醇時，利用雙功能醛/醇脫氫酶（AdhE）將乙酰輔酶A轉化為乙醛再生成乙醇。但是，當AdhE失活后，C. autoethanogenum先通過底物水平磷酸化，將乙酰輔酶A轉化為乙酸并產(chǎn)生ATP，再利用鐵氧還蛋白氧化還原酶（AOR）將乙酸還原為乙醛，最后通過NAD(P)H 依賴型乙醇脫氫酶（Adh）生成乙醇，實現(xiàn)了高效利用ATP 間接生產(chǎn)乙醇，最終乙醇產(chǎn)量增加了180%[66]。另外，通過在E. coliT110 中表達電子傳遞蛋白MtrCAB 復合物、富馬酸還原酶（FccA）和碳酸氫鹽轉運體（BT），并結合電化學系統(tǒng)，實現(xiàn)了電子從MtrCAB到FccA的傳遞，成功強化了CO2固定過程并將琥珀酸產(chǎn)率提高了近2 倍[67]?？傮w而言，在構建高效能量供給途徑實現(xiàn)“開源”的同時，減少微生物CO2固定途徑中的能量消耗進行“節(jié)流”，是解決微生物能量瓶頸的有效策略。

2.3.2 外源能量的利用

與自養(yǎng)微生物相比，異養(yǎng)微生物更容易從有機碳源中獲得能量。光能、電能與氫能的有效利用有利于進一步降低外源能量的成本。在光能利用方面，研究人員通過集成CO2固定模塊和CO2減排模塊，開發(fā)了異養(yǎng)微生物CO2模塊化封存策略[68]。首先，設計了一條新型的CO2固定途徑HWLS，并借助細胞外膜錨定型光敏感納米電子捕獲通道，促進NAD+還原產(chǎn)生NADH，用于補充HWLS 途徑所需的NADH。其次，設計了基于藍細菌轉錄因子NdhR 的CO2動態(tài)減排開關，并借助細胞內膜光敏感質子嗅探通道，產(chǎn)生跨膜質子動力勢，促進ADP高效轉化為ATP，用于補充CO2減排所造成的ATP 供應不足。最后，通過整合CO2固定模塊和CO2減排模塊，顯著提高了E. coli的CO2封存效率，使蘋果酸和丁酸的得率提高至1.48mol/mol 和0.79mol/mol。在電能利用方面，光合電子傳遞鏈循環(huán)電子流可以提供更多的ATP。研究人員將光敏劑苝二酰亞胺衍生物（PDI）和聚（芴?共亞苯基）（PFP）涂覆在M. thermoacetica膜表面并形成p?n異質結后，借助靜電相互作用，陽離子側鏈通過疏水相互作用插入細胞膜，保證電子有效地傳遞給目標菌株，避免氧化還原穿梭跨膜運輸時的額外能量消耗。因此，M. thermoacetica可從異質結中獲取光生電子，從而驅動WL 途徑固定CO2合成乙酸，將量子產(chǎn)率提高至1.6%[69]。在氫能利用方面，研究人員借助產(chǎn)乙酸菌（Clostridium ljungdahlii）證明了H2在丙酮生產(chǎn)中的實用性。由于丙酮生產(chǎn)過程中的脫羧步驟會造成CO2凈排放，因此補充H2可以提供C. ljungdahlii固定CO2所需的還原力，增強CO2的再吸收能力，最終丙酮的產(chǎn)量可以達到異養(yǎng)發(fā)酵理論最大值的138%[70]。未來可深入開發(fā)基于光能、電能的高效電子供給系統(tǒng)，在降低成本的前提下解決CO2固定過程中還原力和能量供給不足的問題。

3 人工微生物固定CO2

近年來，研究人員致力于在異源宿主內運行完整的CO2固定途徑以構建人工的CO2固定微生物。然而，在提高CO2固定效率方面仍然存在很多挑戰(zhàn)，如：需要補充額外的能量源以滿足固碳能量需求、關鍵固碳酶的穩(wěn)定性與催化效率有待進一步提高、固碳途徑在異源宿主中的CO2同化效率較低等[71]。因此，需要開發(fā)人工微生物固定CO2的策略，主要的研究進展包括兩個方面：設計與構建人工CO2固定途徑（表2）、開發(fā)與合成人工CO2固定微生物。

表2 人工CO2固定途徑

3.1 人工CO2固定途徑

在對天然CO2固定途徑挖掘和解析的基礎上，近年來研究人員借助計算機輔助設計，提出了許多人工CO2固定途徑（圖4）。雖然人工設計的CO2固定途徑在理論上具有更好的熱力學可行性與更高的能量利用效率，但其仍然難以滿足工業(yè)生物制造的要求。目前，運用體外多酶體系構建路徑效率高、能量需求小的人工固碳途徑，并通過捕集外源能量以驅動固碳途徑。

圖4 人工CO2固定途徑

3.1.1 固碳路徑的設計與優(yōu)化

新興的合成生物學可以自由組合不同生物來源的酶促反應，為創(chuàng)建人工CO2固定途徑提供了新思路，大多數(shù)人工的CO2固定途徑在動力學或熱力學上均優(yōu)于自然進化的CO2固定途徑[33]。近年來，較為成熟的人工CO2固定途徑主要包括：CETCH 循環(huán)[50]、rGly 途徑[75]、POAP 循環(huán)[72]、乙酰輔酶A 雙循環(huán)（acetyl?CoA bicycle）[73]和還原乙醛酸?丙酮酸合成（rGPS）循環(huán)與蘋果酰輔酶A?甘油酸（MCG）途徑組成的rGPS?MCG 系統(tǒng)[74]。CETCH 循環(huán)是由17 種酶組成的好氧循環(huán)，關鍵酶為巴豆酰輔酶A羧化酶（Ccr），每將1mol CO2轉化為乙酰輔酶A需消耗1mol ATP 和4mol NAD(P)H[1]，CO2轉化率為5nmol CO2/(mg 蛋白·min)[50]。rGly 途徑是好氧途徑，關鍵酶為2?酮戊二酸合酶和 ATP?檸檬酸裂解酶，每將1mol CO2轉化為乙酰輔酶A 需消耗2mol ATP和4mol NAD(P)H[1]。POAP 循 環(huán) 是 由Pyc、Oah、Acs、Pfor 催化的厭氧循環(huán)，每將2mol CO2轉化為1mol草酸鹽需消耗2mol ATP和1mol NAD(P)H，CO2固定率為8.0nmol CO2/(mg CO2固定酶·min)[72]。乙酰輔酶A雙循環(huán)分為碳固定、糖異生和非氧化糖酵解三個功能模塊，每固定2mol CO2需消耗2mol 乙酰輔酶A并生產(chǎn)3mol乙酰輔酶A，關鍵酶為丙酮酸合酶（rPFOR）[73]。rGPS?MCG 系統(tǒng)對O2不敏感，關鍵酶為Ccr，每將2mol HCO3–轉化為1mol乙酰輔酶A需消耗5mol ATP和5mol NAD(P)H，CO2固定率為28.5nmol CO2/(mg 核心蛋白·min)[74]。雖然體外人工固碳路徑的設計突破了酶活性與生長量的限制，能夠獨立控制反應速率與減少能量消耗，但是人工路徑設計不僅要考慮途徑的能量成本，還要考慮維持途徑通量所需的酶蛋白成本[71]。

3.1.2 能量供給模塊的引入

一般來說，微生物可以通過消耗來自H2、自然光、電力或化學物質等外源能量的方式進行捕集與利用CO2[76]。目前，能量供給模塊的構建方式，主要包括運用電極?微生物雜化體、補充電能載體以及構建生物類囊體等。在電極?微生物雜化體的應用方面，將卵形孢子菌（Sporomusa ovata）與氟化碳納米乳劑結合后，該材料可作為H2的載體以提高H2的傳遞效果，從而可以強化H2驅動的CO2還原途徑，使乙酸的合成效率提高了1.9 倍[77]。另外，借助石墨氮化碳（g?C3N4）和H2O2降解酶建立了一種雜交光合系統(tǒng)，g?C3N4捕獲光能并將其轉化為電子，還原H+生成H2，H2O2降解酶分解H2O2生成O2?；贜AD(P)+轉氫酶和氧化磷酸化（OXPHOS）產(chǎn)生的H2和O2，有效改善了真養(yǎng)羅爾斯頓菌（Ralstonia. eutropha）的NAD(P)H和ATP供應，使得菌株利用CO2合成聚羥基丁酸的產(chǎn)量增加了1倍[78]。在電能載體補充方面，為了實現(xiàn)電力驅動CO2固定，借助甲酸作為電化學的能量載體，使得R. eutrophaH16能夠利用電能還原CO2生產(chǎn)高級醇，最終產(chǎn)量達到了1.4g/L[79]。在生物類囊體構建方面，基于光合作用原理的啟發(fā)，通過仿生系統(tǒng)將類囊體膜和CETCH 途徑酶結合以構建人工類囊體，在光驅動下可以將CO2轉化為多碳化合物（如乙醇酸）[80]。目前，人工光能、電能利用系統(tǒng)的轉化效率還有待進一步提高，未來可以通過引入新型材料，改善材料的穩(wěn)定性、生物相容性，提高固碳微生物的電子收集效率與能量利用效率，從而構建更高效的CO2固定驅動系統(tǒng)。

3.2 人工CO2固定微生物

合成生物學的一個重大挑戰(zhàn)是如何在將異養(yǎng)微生物轉化為自養(yǎng)微生物，也就是如何在異養(yǎng)微生物運行完整的CO2固定途徑使異養(yǎng)微生物以CO2為唯一碳源進行細胞生長與產(chǎn)物合成。目前，已經(jīng)分別構建完成了以CO2為唯一碳源、甲酸為唯一能源的化能自養(yǎng)型E. coli和以CO2為唯一碳源、甲醇為唯一能源的P. pastoris。

3.2.1 自養(yǎng)型大腸桿菌

E. coli具有遺傳背景清晰、遺傳操作工具完備、生長速度快等優(yōu)點，是一個良好的模式生物系統(tǒng)，可以作為利用CO2合成生物質的宿主菌株。2016 年，研究人員通過模塊分割CBB 循環(huán)，構建完成了首個半自養(yǎng)型E. coli，該菌株同化的碳來源于CO2與丙酮酸[57]。2020年，研究人員將自養(yǎng)系統(tǒng)構建與適應性進化相結合，在引入CBB 循環(huán)與甲酸能量供給系統(tǒng)的基礎上，將工程菌株進行適應性進化350 天后，獲得了以CO2為唯一碳源、甲酸為唯一能源的化能自養(yǎng)型E. coli[81]。這項研究是人工CO2固定微生物方面的重大突破，也證明了實驗室定向進化能夠將細胞適應性與所需功能相結合，幫助異養(yǎng)微生物整合CO2固定途徑[81]。

3.2.2 自養(yǎng)型畢赤酵母

甲基營養(yǎng)型P. pastoris可以利用甲醇作為唯一的能源和碳源進行生長，是生產(chǎn)酶和化學品的合適底盤，被廣泛應用于工業(yè)酶和藥物的生物制造[82]。2020 年，研究人員通過結合過氧化物酶體改造與多種異源酶表達，將P. pastoris原有的甲醇同化途徑改造為類似CBB循環(huán)的CO2固定途徑，并結合長期的適應性進化，獲得了以CO2為唯一碳源、甲醇為唯一能源的化能自養(yǎng)型P. pastoris，且細胞比生長速率達到了0.018/h[10]。這項研究再次證明了異養(yǎng)微生物向合成自養(yǎng)微生物轉化可能性，具有跨時代的科學意義，但是合成的自養(yǎng)型微生物的生長和生產(chǎn)速率相對較為緩慢，因此距離工業(yè)化應用還有很大差距。

4 結語

針對微生物實現(xiàn)CO2封存的研究，國內外研究人員采用合成生物學、代謝工程、材料科學、電化學等策略，對自養(yǎng)微生物、異養(yǎng)微生物和人工微生物的CO2固定途徑進行了重構與優(yōu)化。然而，目前微生物CO2固定的相關研究尚處于初步發(fā)展階段，仍然存在很多不足，例如：固碳反應的能量供給與轉換效率仍需提高、高效的CO2固定有待進一步開發(fā)、CO2固定微生物的碳利用效率常常達不到工業(yè)化要求等。因此，未來的研究重點可以圍繞CO2固定關鍵酶、途徑和微生物三個方面進行。

（1）在CO2固定關鍵酶方面，系統(tǒng)挖掘天然固碳酶和理性設計人工固碳酶。一方面，從極端微生物中篩選更加適合于微生物CO2固定的高性能固碳酶；另一方面，借助AlphaFold 進行結構預測并理性設計人工固碳酶，提高CO2固定效率。

（2）在CO2固定途徑方面，挖掘與優(yōu)化天然固碳途徑、逆向設計人工固碳途徑和開發(fā)能量捕獲與再生系統(tǒng)。深入挖掘天然微生物的固碳機理，根據(jù)機理進一步優(yōu)化已知天然固碳途徑；借助ATLASx、RetroPath 等工具預測固定CO2合成目標化合物的代謝途徑及其催化酶，通過對比篩選生物逆合成途徑，獲得新的人工固碳途徑；利用高效捕獲光能的新型材料與高特異性的生物催化系統(tǒng)，開發(fā)能量捕獲與再生系統(tǒng)，實現(xiàn)光驅生物催化與高價值化學品合成。

（3）在CO2固定微生物方面，仿生構建人工固碳組件，如人工羧酶體、人工葉綠體、人工葉片、無膜細胞器等，并與微生物進行耦合，最終使微生物真正具備固定CO2的“功能性器官”。