癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平及其臨床意義

趙錦華，楊霖崧，吳亞欣，賈麗娟，李文強(qiáng)，惠宇航

咸陽市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西咸陽 712000

癲癇是由各種原因?qū)е碌拇竽X神經(jīng)元異常放電，是一種臨時性、突發(fā)性腦功能紊亂的臨床綜合征，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全[1-2]。癲癇發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前病因尚未完全明確，探討與癲癇發(fā)作相關(guān)的基因或蛋白的表達(dá)有積極意義。CD69在急性病變，如腦血管損傷、心肌梗死、大手術(shù)等嚴(yán)重創(chuàng)傷中會導(dǎo)致外周血淋巴細(xì)胞亞群活性發(fā)生改變，即外周血T細(xì)胞的CD69表達(dá)上調(diào)[3]。研究顯示，CD69與缺血性腦卒中后的腦損傷有關(guān)[4]。微小核糖核酸(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，多種miRNA參與神經(jīng)元壞死、異常通路形成及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞增生等病理過程，從而調(diào)節(jié)皮質(zhì)發(fā)育及腦功能，在癲癇的發(fā)生及調(diào)控中起重要作用[5-6]。有研究顯示，精神分裂癥患者miR-130b表達(dá)上調(diào)，且在治療后其表達(dá)降低[7]。但關(guān)于CD69、miR-130b-3p在癲癇方面的研究相對較少，因此，本研究通過檢測癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平，探討二者與癲癇發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年2月至2019年2月本院神經(jīng)內(nèi)科收治的95例癲癇患者作為癲癇組。(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《臨床診療指南：癲癇病分冊》[8]癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)，均采用一線抗癲癇藥物單藥或多藥聯(lián)合治療患者；②根據(jù)患者家族史、腦電圖、體格檢查等確診患者。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腦外傷史、手術(shù)史患者；②伴有神經(jīng)及其他系統(tǒng)疾病患者；③合并聽力、視力障礙及失語等患者；④近期服用過抗焦慮、抗抑郁藥物或其他影響認(rèn)知功能藥物的患者。95例患者中男55例，女40例；年齡28～47歲；癲癇的發(fā)作類型：局灶性發(fā)作34例，全面性發(fā)作24例，全面性發(fā)作合并局灶性發(fā)作30例，不明類型7例。根據(jù)病情嚴(yán)重程度將癲癇患者分為輕度(2個月發(fā)作1次或更少)31例，中度(1個月發(fā)作<4次，但2個月發(fā)作>1次)22例，重度(1個月發(fā)作≥4次)42例。另選取同期來本院進(jìn)行健康體檢的健康者60例作為對照組，其中男33例，女27例；年齡27～48歲。癲癇組與對照組的性別、年齡等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見表1。所有研究對象均自愿加入本研究，并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

表1 兩組一般資料比較[n(%)或

組別n病程<1年1～<3年3～<6年≥6年居住地城市農(nóng)村對照組60----35(58.33)25(41.67)癲癇組9529(30.53)19(20.00)25(26.32)22(23.16)53(55.79)42(44.21)χ2/t-0.097P-0.755

1.2儀器與試劑 庫爾特Epics XL型流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀購自濟(jì)南千司生物技術(shù)有限公司。TRIzol試劑購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號J6547M)、qRT-PCR試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；miR-130b-3p、U6引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 采集癲癇患者在發(fā)作后24 h及對照者健康體檢時的空腹外周靜脈血4 mL，分為2份，1份置于抗凝管中，用于檢測外周血CD69表達(dá)水平；另1份室溫放置2 h自然凝固，4 ℃及12 000 r/min條件下，離心15 min，取上層血清分裝至無菌離心管，標(biāo)記后-80 ℃冰箱凍存，用于檢測miR-130b-3p表達(dá)水平。

1.3.2流式細(xì)胞儀檢測外周血CD69表達(dá)水平 在對照管和檢測管中加入100 μL乙二胺四乙酸二鈉(EDTANa2)抗凝全血，同時加入20 μL法國產(chǎn)熒光標(biāo)記單抗IgG2a-PE及P-gp-PE，使其混合均勻，進(jìn)行15 min的避光染色，采用同型IgG作為陰性對照，在Q-Prep標(biāo)本制備儀上自動溶血、固定，調(diào)整好流式細(xì)胞儀光路后檢測標(biāo)本。計數(shù)104以上個細(xì)胞。

1.3.3qRT-PCR檢測外周血miR-130b-3p表達(dá)水平 采用TRIzol試劑提取所有研究對象外周血中的總RNA，并以反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的方法將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行qRT-PCR，每份標(biāo)本重復(fù)3次。反應(yīng)條件：94 ℃ 15 s；60 ℃ 30 s；70 ℃ 10 s；39個循環(huán)。以U6作為內(nèi)參基因，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)qRT-PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線，采用2-ΔΔCt法計算miR-130b-3p的相對表達(dá)量。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平比較 與對照組比較，癲癇組外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平比較

2.2不同嚴(yán)重程度癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平比較 與輕度患者比較，中度、重度患者外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與中度患者比較，重度患者外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.3癲癇患者外周血CD69與miR-130b-3p表達(dá)水平的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，癲癇患者外周血CD69與miR-130b-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.546，P<0.05)。

表4 不同嚴(yán)重程度癲癇患者外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平比較

2.4Logistic回歸分析癲癇發(fā)生的影響因素 將是否發(fā)生癲癇作為因變量(是=1，否=0)，排除年齡等混雜因素后，以外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平作為自變量，進(jìn)行Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，外周血CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平升高是癲癇發(fā)生的危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析癲癇發(fā)生的影響因素

3 討 論

癲癇是臨床上比較常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)以反復(fù)性、短暫性、發(fā)作性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂最為突出。相關(guān)研究顯示，世界總?cè)丝谥?‰～7‰的人群受癲癇疾病的折磨，部分癲癇患者需要使用抗癲癇藥物進(jìn)行長期治療以控制病情，抗癲癇藥物的使用可對患者神經(jīng)系統(tǒng)和胃功能造成一定影響，從而影響癲癇患者的生活質(zhì)量，且近年來癲癇的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢[9-11]。

CD69是T細(xì)胞活化后最早表達(dá)的抗原，當(dāng)其表達(dá)后可作為輔助刺激分子，使細(xì)胞進(jìn)一步活化和增殖，屬于自然殺傷(NK)細(xì)胞信號傳遞復(fù)合體基因家族的一員，在活化的NK細(xì)胞及T細(xì)胞表面均可表達(dá)，在未活化的NK細(xì)胞及T細(xì)胞上均不表達(dá)，故CD69可作為一種活化誘導(dǎo)分子來反映細(xì)胞的活化狀態(tài)。此外，CD69也是NK細(xì)胞殺傷活化性受體之一，其可以傳遞活化信號，反映NK細(xì)胞的殺傷功能和活化狀態(tài)，在NK細(xì)胞沒有殺傷功能時，CD69表達(dá)缺失[12]。楊立利等[13]研究結(jié)果表明，急性脊髓損傷患者CD69水平明顯高于健康對照者，表明外周血淋巴細(xì)胞對急性脊髓損傷的刺激產(chǎn)生了積極的免疫應(yīng)答。本研究結(jié)果表明，癲癇組外周血CD69表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)；與輕度患者比較，中度和重度患者外周血CD69表達(dá)水平升高，與中度患者比較，重度患者外周血CD69表達(dá)水平升高，提示CD69水平升高可能與癲癇的嚴(yán)重程度有關(guān)。此外，Logistic回歸分析結(jié)果表明，外周血CD69表達(dá)水平升高是癲癇發(fā)生的危險因素，進(jìn)一步提示CD69可能在癲癇病情進(jìn)展中發(fā)揮一定作用。

miRNA參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、神經(jīng)元可塑性，且miRNA轉(zhuǎn)錄后處理參與了神經(jīng)系統(tǒng)的生理學(xué)過程及信號通路的基因表達(dá)調(diào)控[14]。目前研究認(rèn)為，血清miRNA主要從患者組織細(xì)胞中主動分泌進(jìn)入血液循環(huán)，血清miRNA表達(dá)水平可反映病變組織內(nèi)的情況[15]。HU等[16]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠癲癇模型中大腦組織與外周血中的miRNA-34a、miRNA-22、miRNA-125a、miRNA-21表達(dá)水平均升高。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇組外周血miR-130b-3p表達(dá)水平高于對照組(P<0.05)，且隨著癲癇患者病情嚴(yán)重程度加重，外周血miR-130b-3p表達(dá)水平不斷升高，提示miR-130b-3p表達(dá)水平上調(diào)可能參與癲癇的發(fā)生及疾病進(jìn)展。本研究中Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，外周血miR-130b-3p表達(dá)水平升高是癲癇發(fā)生的危險因素，提示檢測miR-130b-3p表達(dá)水平可能對評估癲癇發(fā)生有積極意義。此外，Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，癲癇患者外周血CD69與miR-130b-3p表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，提示CD69、miR-130b-3p表達(dá)可能共同參與疾病發(fā)展，檢測二者表達(dá)水平對于評估癲癇患者病情具有一定的參考價值。

綜上所述，癲癇患者外周血中CD69、miR-130b-3p呈高表達(dá)，檢測CD69、miR-130b-3p表達(dá)水平可能對評估癲癇患者病情嚴(yán)重程度有幫助。