新型冠狀病毒感染疫情下深圳地區(qū)患兒13種呼吸道病原體流行病學(xué)分析

鐘小珍，豆小文，闞麗娟，湯花梅，張水蘭，韋潔宏，張秀明，熊 丹△

1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭 515041；2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，廣東深圳 518000

急性呼吸道疾病(ARD)以急性病毒性呼吸道感染為首，占全球所有急性發(fā)病及死亡人數(shù)的很大比例[1-2]。兒童社區(qū)獲得性肺炎中約50%為ARD，成人社區(qū)獲得性肺炎中約25%為ARD[3]。在5歲以下的兒童中，全球每年僅流感病毒和呼吸道合胞病毒(HRSV)感染的病死人數(shù)就達(dá)到30萬人[4]，其他呼吸道病毒感染，如鼻病毒(HRV)和腺病毒(HADV)等，雖然引起的病死率較低，但發(fā)病率較高，給社會及患兒家庭帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6]。了解常見呼吸道病毒的感染情況及流行特征，可為臨床診療提供參考依據(jù)，有助于公共衛(wèi)生政策的制訂[7]。兒童急性呼吸道感染(ARI)中，病毒合并細(xì)菌感染時有發(fā)生，研究指出，呼吸道病毒合并細(xì)菌感染時，二者存在協(xié)同作用[8]。同時感染病毒和細(xì)菌的患兒往往住院時間更長，疾病嚴(yán)重程度更高[9]。了解新型冠狀病毒感染疫情下，本地區(qū)兒童病毒、細(xì)菌合并感染情況，可能為兒科ARI提供新的治療和預(yù)防策略，改善患兒預(yù)后。本研究對2020年2月至2022年1月于深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)(包括深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院、深圳市羅湖區(qū)中醫(yī)院、深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院，均送至深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院檢驗)就診的4 724例ARI患兒的13種呼吸道病原體檢測結(jié)果進(jìn)行了性別、年齡、季節(jié)分布等情況分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年2月至2022年1月于深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)因ARI就診的4 724例住院患兒為研究對象，其中男2 815例，女1 909例，年齡1 d至18歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合ARI診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]；患兒入院當(dāng)天均進(jìn)行咽拭子、痰液標(biāo)本等采集。同一患兒因ARI多次住院的，以每次入院首次采集送檢標(biāo)本為準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：住院期間接受免疫抑制劑治療或放化療；合并其他器質(zhì)性病變、先天性遺傳病等。依據(jù)年齡將研究對象分為嬰兒組(<1歲)993例，幼兒組(1～3歲)1 583例，學(xué)齡前期組(>3～6歲)1 667例，學(xué)齡期組(>6歲)481例。本研究通過深圳市羅湖醫(yī)院集團(tuán)醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 13種呼吸道病原體檢測儀器為Dx基因測序儀(美國ABI公司)，試劑為核酸提取試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司)及13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒(寧波海爾施基因科技有限公司)；細(xì)菌鑒定采用德國布魯克公司的基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.1咽拭子標(biāo)本采集 左手用壓舌板壓住患兒舌頭，右手將植絨拭子伸至咽峽處，適度用力擦拭咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位數(shù)次，并旋轉(zhuǎn)拭子以增加接觸面，應(yīng)避免接觸舌及口腔黏膜等處。取樣后迅速將拭子放入裝有3 mL采樣液的采樣管中，靠近采樣管頂端處折斷并棄去尾部，蓋緊管蓋。

1.3.2病原體檢測 將臨床咽拭子標(biāo)本，以及試劑盒提供的陰陽性對照樣品通過核酸提取試劑盒及全自動核酸提取儀(Smart LabAssist-32磁珠法)提取核酸，采用13種呼吸道病原體多重檢測試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，聯(lián)合多重反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)與毛細(xì)電泳技術(shù)進(jìn)行檢測。以常見的13種呼吸道病原體的高度保守序列為靶區(qū)域，通過13組特異性引物，在一個擴(kuò)增管中進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增；采用毛細(xì)電泳分離不同長度的擴(kuò)增產(chǎn)物，從而得到病原體的檢測結(jié)果。試劑盒帶有 RT-PCR內(nèi)參，可用于對核酸提取、RT-PCR和毛細(xì)電泳等整個檢測過程的監(jiān)控，同時通過對樣品中的人RNA和人DNA進(jìn)行檢測，對樣品質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測。檢測病原體包括甲型流感病毒(Inf A)、HADV、博卡病毒(Boca)、HRV、(2009)甲型H1N1流感病毒(09H1)、副流感病毒(HPIV)、衣原體(Ch)、偏肺病毒(HMPV)、乙型流感病毒(InfB)、肺炎支原體(Mp)、甲型H3N2流感病毒(簡稱H3)、冠狀病毒(HCoV)、HRSV。

1.3.3細(xì)菌檢測 將痰標(biāo)本分別接種于血瓊脂平板、巧克力血瓊脂平板、麥康凱平板(鄭州瑞貝特智能科技有限公司)，置于5% CO2培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)24～48 h。采用MALDI-TOF MS系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS24.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.113種呼吸道病原體單一及混合陽性檢出情況 4 724例ARI患兒13種呼吸道病原體檢測陽性患兒共3 250例，總陽性率為68.80%。單一陽性率為61.8%(2 921例)；混合陽性率為6.96%(329例)；以HRV(27.77%)陽性率最高，HRSV(19.75%)次之，HPIV(10.69%)再次之。見表1。

表1 4 724例患兒13種呼吸道病原體陽性檢出情況

2.2不同性別患兒病原體陽性檢出情況比較 4 724例患兒中，男性患兒總陽性率為69.24%，女性患兒總陽性率為69.15%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。男性患兒HRV陽性率高于女性患兒，女性患兒Boca陽性率高于男性患兒，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.739、4.480，P<0.05)，其余11種病原體陽性率在不同性別患兒間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3不同季節(jié)13種呼吸道病原體檢出情況比較 不同季節(jié)13種呼吸道病原體總陽性率由高到低依次為秋季(75.82%)、夏季(68.68%)、冬季(63.95%)、春季(61.78%)，不同季節(jié)病原體陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。秋季、夏季、冬季、春季病毒混合陽性率分別為7.96%(136/1 708)、4.31%(40/929)、8.70%(111/1 276)、5.18%(42/811)。秋季及夏季以HRV和HRSV檢出為主，冬季以HRV和HMPV檢出為主，春季以HRV和HPIV檢出為主；各病原體除了Mp及Ch陽性率在不同季節(jié)間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)外，其余病原體陽性率在不同季節(jié)間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4不同年齡組患兒13種呼吸道病原體檢出情況比較 各年齡組病原體總陽性率由高到低依次為幼兒組(73.28%)、嬰兒組(70.69%)、學(xué)齡前期組(68.27%)、學(xué)齡期組(51.98%)。幼兒組、嬰兒組、學(xué)齡前期組、學(xué)齡期組混合陽性率分別為7.96%(126/1 583)、5.24%(52/993)、7.62%(127/1 667)、5.00%(24/481)。幼兒組以HRV及HRSV檢出為主。各病原體除HCoV陽性率在不同年齡組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)外，其余病原體陽性率在不同年齡組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表2 不同性別患兒13種呼吸道病原體檢出情況[n(%)]

性別nHCoVBocaMpInfAH3Ch09H1男281567(2.38)39(1.39)36(1.28)22(0.78)14(0.50)9(0.32)7(0.25)女190941(2.15)42(2.20)19(1.00)18(0.94)16(0.84)8(0.42)2(0.10)χ20.2754.4800.7950.3532.0940.3131.239P0.6000.0340.3730.5530.1480.5760.266

表3 不同季節(jié)13種呼吸道病原體檢出情況[n(%)]

季節(jié)nHCoVBocaMpInfAH3Ch09H1春季8116(0.74)7(0.86)7(0.86)0(0.00)0(0.00)5(0.62)0(0.00)夏季92915(1.61)5(0.54)11(1.18)0(0.00)0(0.00)1(0.11)0(0.00)秋季170841(2.40)36(2.11)15(0.88)1(0.06)0(0.00)7(0.41)1(0.06)冬季127646(3.61)33(2.59)22(1.72)39(3.06)30(2.35)4(0.31)8(0.63)χ220.5918.445.33101.7481.583.3317.67P<0.001<0.0010.149<0.001<0.0010.343<0.001

表4 不同年齡組患兒13種呼吸道病原體檢出情況[n(%)]

組別nHCoVBocaMpInfAH3Ch09H1嬰兒組99325(2.52)13(1.31)4(0.40)1(0.10)1(0.10)14(1.41)0(0.00)幼兒組158345(2.84)49(3.10)14(0.88)8(0.51)6(0.38)1(0.06)1(0.06)學(xué)齡前期組166728(1.68)19(1.14)15(0.90)17(1.02)12(0.72)1(0.06)6(0.36)學(xué)齡期組48110(2.08)0(0.00)22(4.57)14(2.91)11(2.29)1(0.21)2(0.42)χ25.2730.5455.6933.7827.1338.9170.50P0.153<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.5幾種主要ARI患兒13種呼吸道病原體的陽性率比較 不同ARI患兒中，檢出的病原體陽性率排名居前3位的疾病依次為支氣管肺炎[35.60%(1 682/4 724)]、急性上呼吸道感染[32.90%(1 554/4 724)]、急性支氣管炎[22.35%(1 056/4 724)]。支氣管肺炎患兒以檢出HRSV(29.73%)為主，其次為HRV(24.20%)及HPIV(12.84%)。見圖1。

2.6HRV、HRSV、HPIV陽性患兒痰培養(yǎng)結(jié)果 選取陽性率居前3位的呼吸道病原體陽性患兒，對其痰培養(yǎng)細(xì)菌陽性檢出結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，在1 022例呼吸道病毒陽性患兒中，痰培養(yǎng)陽性率為54.11%(553/1 022)，痰培養(yǎng)陽性率居前4位的細(xì)菌依次為金黃色葡萄球菌[23.29%(238/1 022)]、卡他莫拉菌[13.21%(135/1 022)]、肺炎鏈球菌[(11.45%(117/1 022)]、流感嗜血桿菌[6.46%(66/1 022)]。其中HRV及HPIV以合并金黃色葡萄球菌和卡他莫拉菌陽性為主，HRSV以合并金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌陽性為主。見表5。

圖1 幾種主要ARI患兒13種呼吸道病原體的陽性率比較

表5 HRV、HRSV、HPIV陽性患兒痰培養(yǎng)結(jié)果[n(%)]

病原體n銅綠假單胞菌鮑曼不動桿菌大腸埃希菌其他χ2PHRV39113(3.32)8(2.05)12(3.07)7(1.79)214.72<0.001HRSV4417(1.59)15(3.40)20(4.54)18(4.08)288.63<0.001HPIV1905(2.63)1(0.53)5(2.63)7(3.68)144.56<0.001合計102225(2.45)24(2.35)37(3.62)32(3.13)594.77<0.001

3 討 論

本研究采用多重RT-PCR與毛細(xì)電泳技術(shù)檢測13種呼吸道病原體，與細(xì)胞培養(yǎng)法及血清學(xué)檢測法相比，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、高效、覆蓋面廣等優(yōu)勢，該方案是一種可靠的檢測多種呼吸道病原體的方法[11]。本研究結(jié)果顯示，本院4 724例ARI患兒中，13種呼吸道病原體檢測總陽性率為68.80%，與相同地區(qū)羅小娟等[12]報道的總陽性率(63.13%)幾乎一致，但低于國內(nèi)徐佳楠等[13]報道的總陽性率(89.1%)。本研究中ARI患兒檢出的病原體陽性率排名居前4位的為HRV、HRSV、HPIV、HMPV，也與羅小娟等[12]報道相符，但與徐佳楠等[13]報道的呼吸道病原體譜存在差異，可能與不同地區(qū)及不同的檢測方法有關(guān)。

呼吸道病原體的流行與季節(jié)有密切關(guān)系，本研究結(jié)果顯示，深圳市羅湖區(qū)不同季節(jié)呼吸道病原體總陽性率由高到低依次為秋季(75.82%)、夏季(68.68%)、冬季(63.95%)、春季(61.78%)。秋季及夏季以HRV和HRSV檢出為主，冬季以HRV和HMPV檢出為主，春季以HRV和HPIV檢出為主，深圳地區(qū)秋季應(yīng)著重加強(qiáng)呼吸道病原體防護(hù)。這與王麗等[14]報道的冬季及春季呼吸道病毒陽性率高于夏季及秋季的結(jié)果不相符?？赡芘c不同地區(qū)、不同年份氣候不同有關(guān)，深圳屬于亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，氣候濕熱，夏季長，冬季陰冷但時間短，呼吸道病原體流行時間比北方地區(qū)短。

此外，本研究從性別、年齡分析了深圳地區(qū)呼吸道病原體感染的流行特點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，男性患兒HRV陽性率高于女性患兒(P<0.05)，女性患兒Boca陽性率高于男性患兒(P<0.05)。由于目前關(guān)于不同性別呼吸道病原體感染的比較研究尚少，結(jié)論仍需進(jìn)一步證實。本研究將研究對象分為嬰兒組、幼兒組、學(xué)齡前期組、學(xué)齡期組4個年齡組，各年齡組病原體總陽性率由高到低依次為幼兒組(73.28%)、嬰兒組(70.69%)、學(xué)齡前期組(68.27%)、學(xué)齡期組(51.98%)?！?歲嬰幼兒易發(fā)生感染，陽性率為70.69%～73.28%，可能與該年齡段嬰幼兒免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，抵抗力較弱，不配合佩戴口罩有關(guān)。在全球范圍內(nèi)，HRSV感染是5歲兒童發(fā)生呼吸道疾病和死亡的主要原因之一[15]。本研究從年齡段分析，HRSV在<1歲的嬰兒組中陽性率位于第1位(31.92%)，與國內(nèi)報道的結(jié)果相符[16]，隨著年齡的增長，HRSV陽性率降低，Mp、InfB、InfA和H3陽性率逐漸升高。

不同ARI患兒中，檢出的病原體陽性率排名居前3位的疾病依次為支氣管肺炎(35.60%)、急性上呼吸道感染(32.90%)、急性支氣管炎(22.35%)。支氣管肺炎患兒以檢出HRSV(29.73%)為主，其次為HRV(24.20%)及HPIV(12.84%)。這與文獻(xiàn)[17]報道的在各種呼吸道疾病中，Mp為首要感染病原體，其次為HADV不相符。國內(nèi)研究報道，新型冠狀病毒感染的常態(tài)化防控減少了常見呼吸道病原體在兒童中的傳播，尤其是流感病毒及Mp[18]，參考文獻(xiàn)[12]報道的深圳市疫情前數(shù)據(jù)(2019年9月至2020年2月檢出InfA陽性率為7.59%，Mp為15.4%)可知，深圳市羅湖區(qū)2020年2月至2022年1月檢出InfA(0.85%)、Mp(1.16%)陽性率明顯降低。可能與新型冠狀病毒感染的常態(tài)化防控下，居家隔離、佩戴口罩、減少人員流動性和聚集性活動等防控措施的實施有效阻斷了這些通過呼吸道飛沫和密切接觸傳播的病原體的傳播和流行有關(guān)。

人鼻咽通常被潛在的細(xì)菌定植，包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌等[19]。有研究顯示，60%的呼吸道病毒感染(包括HADV、流感病毒和HRSV)發(fā)生在幼兒上呼吸道潛在致病性細(xì)菌共存的環(huán)境中[20]。通常與呼吸道病毒共同檢出的細(xì)菌是條件性致病菌，如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌[8]。本研究選取陽性率居前3位的呼吸道病原體陽性患兒，對其痰培養(yǎng)陽性菌檢出結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，病毒合并細(xì)菌感染患兒，細(xì)菌陽性率居前4位的細(xì)菌依次為金黃色葡萄球菌(23.29%)、卡他莫拉菌(13.21%)、肺炎鏈球菌(11.45%)、流感嗜血桿菌(6.46%)。其中HRV及HPIV以合并金黃色葡萄球菌和卡他莫拉菌陽性為主，HRSV以合并金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌陽性為主。與JUNG等[20]報道的病毒合并細(xì)菌感染幼兒中檢出的細(xì)菌以卡他莫拉菌檢出率最高，流感嗜血桿菌次之有差異。這可能與地區(qū)、年齡、接觸的環(huán)境和遺傳背景不同，以及下呼吸道標(biāo)本被上呼吸道菌群污染有關(guān)。有研究報道，肺炎鏈球菌的聯(lián)合檢出降低了呼吸道疾病嚴(yán)重程度，流感嗜血桿菌的聯(lián)合檢出降低了喘息的風(fēng)險[20]。本研究檢出的3種陽性率最高的病毒(HRV、HRSV、HPIV)中，肺炎鏈球菌合并HRSV陽性率最高(13.61%)，流感嗜血桿菌合并HRV陽性率最高(8.70%)。

綜上所述，新型冠狀病毒感染疫情下，兒童感染的呼吸道病原體區(qū)別于疫情前，本研究為新型冠狀病毒感染疫情防控下深圳地區(qū)兒童呼吸道病原體的診療提供了病原學(xué)依據(jù)，還為當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心制訂進(jìn)一步的ARD預(yù)防控制計劃提供了參考。