血清miR-4463和miR-1293表達(dá)水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的臨床價(jià)值

張 嘯，李 濤，鄭 植，陳鑫源，陸 江

1.上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院普外科，上海 201803；2.江蘇省人民醫(yī)院溧陽(yáng)分院普外科，江蘇常州 213300

結(jié)腸癌是外科的常見(jiàn)惡性腫瘤，位居城市居民腫瘤發(fā)病率的第2位，病死率的第4位。結(jié)腸癌的早期常常無(wú)特異性癥狀，多數(shù)患者在確診時(shí)均已經(jīng)處于中晚期，術(shù)后5年生存率仍較低[1]。全球每年新發(fā)結(jié)腸癌患者在120萬(wàn)例以上，而約有60萬(wàn)例患者死于結(jié)腸癌[2]。我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年升高，目前臨床上仍缺乏對(duì)結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷的敏感指標(biāo)[3]，因此，探索靈敏度較高的結(jié)腸癌診斷和預(yù)后判斷指標(biāo)具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是單鏈非編碼RNA，與靶基因具有結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)靶基因具有調(diào)控作用，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移等生物學(xué)功能[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)腸癌患者血清miR-4463和miR-1293表達(dá)水平，分析二者在結(jié)腸癌預(yù)后判斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2019年1月至2021年12月上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院(25例)和江蘇省人民醫(yī)院溧陽(yáng)分院(90例)收治的115例結(jié)腸癌手術(shù)患者納入結(jié)腸癌組，其中男65例，女50例；年齡35～79歲，平均(53.85±15.12)歲；有飲酒史21例，無(wú)飲酒史94例；有吸煙史27例，無(wú)吸煙史88例；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.79±3.28)kg/m2。選擇同期65例在上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院(5例)和江蘇省人民醫(yī)院溧陽(yáng)分院(60例)進(jìn)行結(jié)腸良性疾病手術(shù)治療患者納入良性疾病組，其中男34例，女31例；年齡31～77歲，平均(52.94±11.00)歲；有飲酒史3例，無(wú)飲酒史34例；有吸煙史26例，無(wú)吸煙史39例；BMI為(22.48±4.10)kg/m2。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均進(jìn)行病理學(xué)檢查確診，結(jié)腸良性疾病均為結(jié)腸腺瘤；結(jié)腸癌患者均為首次發(fā)病，術(shù)前沒(méi)有接受過(guò)放化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤；患者有手術(shù)禁忌證或者不愿意接受手術(shù)；合并血液性和免疫性疾??；結(jié)直腸有急慢性感染；存在心、肝、腎等重要臟器功能不全；合并高血壓、糖尿病、冠心病等慢性疾?。淮嬖谥橇φ系K或者精神疾病。選擇同期30例在上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院進(jìn)行健康體檢的健康者納入健康對(duì)照組，其中男17例，女13例；年齡36～80歲，平均(53.07±11.92)歲；有飲酒史14例，無(wú)飲酒史16例；有吸煙史17例，無(wú)吸煙史13例；BMI為(23.63±3.38) kg/m2。3組研究對(duì)象年齡、性別、BMI等基線(xiàn)資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)兩家醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2方法

1.2.1癌胚抗原(CEA)檢測(cè) 結(jié)腸癌和結(jié)腸良性疾病患者入院時(shí)，結(jié)腸癌患者術(shù)后7 d，健康對(duì)照組在門(mén)診體檢時(shí)均抽取清晨空腹靜脈血約5 mL，在室溫下靜置30 min后，用離心機(jī)分離上層血清放置在-80 ℃的冰箱中待測(cè)。采用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀(Cobas e601型，羅氏公司，化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法)對(duì)CEA進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒為博奧生物有限公司產(chǎn)品。

1.2.2反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR) 結(jié)腸癌和結(jié)腸良性疾病患者入院時(shí)，結(jié)腸癌患者術(shù)后7 d，健康對(duì)照組在門(mén)診體檢時(shí)均采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集外周靜脈血3 mL，放置在-80 ℃的冰箱中待檢。采用Trizol試劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)提取血清總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Sigma公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并放置在-20 ℃的冰箱中保存。然后采用熒光染料法以cDNA為模板在IQ5 RT-PCR上進(jìn)行擴(kuò)增。采用Primer express 3.0軟件設(shè)計(jì)合成引物探針，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。miR-4463的正向引物為5′-GGCCCACCCCAGTCTC-3′；反向引物為5′-GCAGGAGACTGGGGTG-3′。miR-1293的正向引物為5′-CCTGCCGGGGCTAAAGTGCTG-3′；反向引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。U6的正向引物為5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAA TTGGAA-3′；反向引物為5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′。采用PCR儀[美谷分子儀器(上海)有限公司，ABI 7900型]進(jìn)行檢測(cè)，采用20 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系，其組成為引物1 μL，cDNA 1 μL，TaqMan GEx MASTER Mix 10 μL，加入雙蒸餾水補(bǔ)充至20 μL。通過(guò)如下循環(huán)：預(yù)變性5 min，預(yù)變性溫度調(diào)節(jié)為95 ℃，之后在95 ℃條件下變性15 s，然后在60 ℃的條件下進(jìn)行退火，時(shí)間為30 s，之后在72 ℃條件下延長(zhǎng)1 min，總共40個(gè)循環(huán)，最終采用循環(huán)閾值法定量分析miR-4463和miR-1293的表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參，以2-ΔΔCt計(jì)算miR-4463、miR-1293相對(duì)表達(dá)量。

1.3觀(guān)察指標(biāo) 觀(guān)察各組血清miR-4463、miR-1293和CEA表達(dá)水平的變化，對(duì)結(jié)腸癌患者發(fā)生預(yù)后不良的相關(guān)影響因素進(jìn)行單因素和多因素分析，分析血清miR-4463、miR-1293和CEA表達(dá)水平在預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良中的效能。

2 結(jié) 果

2.1各組3項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)水平比較 結(jié)腸癌組入院時(shí)miR-4463和CEA表達(dá)水平明顯高于良性疾病組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；良性疾病組的miR-4463表達(dá)水平高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。良性疾病組的CEA水平與健康對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)腸癌組術(shù)后7 d血清miR-4463和CEA表達(dá)水平分別為1.75±0.56、(1.76±0.54)ng/mL，二者均較入院時(shí)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)腸癌組入院時(shí)miR-1293表達(dá)水平明顯低于良性疾病組和健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；良性疾病組miR-1293表達(dá)水平明顯低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)腸癌組術(shù)后7 d血清miR-1293表達(dá)水平為4.52±1.18，較入院時(shí)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的單因素分析 所有結(jié)腸癌患者均隨訪(fǎng)3～36個(gè)月，平均(22.24±4.06)月，其中25例出現(xiàn)死亡，納入預(yù)后不良組，90例至隨訪(fǎng)結(jié)束時(shí)仍生存納入預(yù)后良好組。預(yù)后不良組與預(yù)后良好組性別、年齡和腫瘤部位構(gòu)成比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而兩組腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期構(gòu)成比及miR-4463、miR-1293、CEA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的多因素分析 將2.2中單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)(腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期及miR-4463、miR-1293、CEA表達(dá)水平)作為自變量，將是否發(fā)生預(yù)后不良作為因變量，進(jìn)行二元Logistic回歸分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤分期為Ⅲ期，miR-4463和CEA表達(dá)水平升高，以及miR-1293表達(dá)水平降低均是結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 各組3項(xiàng)指標(biāo)表達(dá)水平的比較

2.43項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的效能 血清miR-4463和miR-1293表達(dá)水平預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的曲線(xiàn)下面積(AUC)明顯大于CEA(P<0.05)。根據(jù)是否發(fā)生預(yù)后不良擬合二元Logistic回歸方程Y=1.35XmiR-4463-2.45XmiR-1293-1.92，得到聯(lián)合檢測(cè)指標(biāo)，聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的靈敏度為96.0%，特異度為78.9%，AUC為0.930，AUC明顯大于miR-4463(Z=2.221，P<0.05)和miR-1293(Z=2.680，P<0.05)單獨(dú)檢測(cè)，而兩項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)檢測(cè)的AUC比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表4和圖1。

2.5結(jié)腸癌患者血清miR-4463和miR-1293表達(dá)水平的相關(guān)性分析 結(jié)腸癌患者血清miR-4463表達(dá)水平與miR-1293表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.728，P<0.05)。

表2 結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的單因素分析 (n或

表3 結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的多因素分析

表4 血清miR-4463、miR-1293和CEA檢測(cè)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的效能

圖1 不同指標(biāo)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的ROC曲線(xiàn)

3 討 論

雖然結(jié)腸癌的治療方法不斷改進(jìn)，但術(shù)后仍有不少患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響結(jié)腸癌患者的預(yù)后[5]。隨著對(duì)結(jié)腸癌分子機(jī)制研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)靶向藥物能夠在一定程度上改善患者的預(yù)后[6]。腫瘤分期高、分化程度低和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素，但結(jié)腸癌具有明顯的異質(zhì)性，即使相同腫瘤分期的患者對(duì)同樣治療方案的敏感性也不一樣，部分患者甚至存在治療抵抗[7-8]。因此，尋找預(yù)測(cè)結(jié)腸癌預(yù)后的指標(biāo)對(duì)于進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)腸癌治療方案具有重要的臨床價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，預(yù)后不良組與預(yù)后良好組性別、年齡和腫瘤部位構(gòu)成比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而兩組腫瘤最大徑、腫瘤分化程度、腫瘤分期構(gòu)成比及miR-4463、miR-1293和CEA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示腫瘤分期為Ⅲ期，miR-4463和CEA表達(dá)水平升高，以及miR-1293表達(dá)水平降低均是結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。同時(shí)進(jìn)行ROC曲線(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-4463和miR-1293在預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良中的效能明顯優(yōu)于CEA。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組入院時(shí)血清miR-4463表達(dá)水平明顯高于良性疾病組和健康對(duì)照組，并且結(jié)腸癌組術(shù)后 7 d血清miR-4463表達(dá)水平較入院時(shí)明顯降低，說(shuō)明miR-4463參與了結(jié)腸癌疾病的發(fā)生、發(fā)展。miR-4463是新發(fā)現(xiàn)的miRNA，現(xiàn)已知其與細(xì)胞增殖和侵襲關(guān)系密切，最早發(fā)現(xiàn)其主要在血管閉塞性疾病中能夠抑制低密度脂蛋白誘導(dǎo)平滑肌的遷移，機(jī)制可能為通過(guò)靶向調(diào)控下游人血管肌的基因，從而達(dá)到對(duì)血管平滑肌的調(diào)控[9-10]。而miR-4463在癌癥中的研究仍比較少，一項(xiàng)關(guān)于肝癌的研究發(fā)現(xiàn)，在甲胎蛋白水平?jīng)]有升高前，肝癌患者血清中miR-4463表達(dá)水平已出現(xiàn)明顯升高，并且高表達(dá)miR-4463患者術(shù)后生存期明顯縮短，認(rèn)為miR-4463是肝癌預(yù)后不良的潛在指標(biāo)[11]。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中miR-4463表達(dá)水平明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織，在結(jié)腸癌細(xì)胞體外研究中發(fā)現(xiàn)miR-4463具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和抑制細(xì)胞凋亡的作用，并認(rèn)為miR-4463可能成為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌預(yù)后的潛在指標(biāo)[12]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-4463表達(dá)水平升高是結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)于miR-4463表達(dá)水平升高的患者是否需要采取進(jìn)一步治療措施仍需深入研究明確。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)血清miR-4463為4.17時(shí)，其預(yù)測(cè)預(yù)后不良的靈敏度為72.0%，特異度為87.8%，AUC為0.856，說(shuō)明血清miR-4463檢測(cè)預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良具有較高的效能。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組入院時(shí)血清miR-1293表達(dá)水平明顯低于良性疾病組和健康對(duì)照組，并且發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組術(shù)后7 d血清miR-1293表達(dá)水平較入院時(shí)明顯升高，說(shuō)明miR-1293參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，miR-1293基因是結(jié)腸癌的抑癌基因。miR-1293基因位于12q1312染色體上，目前，對(duì)miR-1293基因在癌癥中的生物學(xué)行為研究結(jié)論存在爭(zhēng)議。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，肺癌組血清miR-1293表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤浸潤(rùn)程度關(guān)系密切，血清miR-1293表達(dá)水平與肺腺癌患者的生存期明顯相關(guān)，在肺腺癌中miR-1293基因表現(xiàn)為促癌基因[13-14]；而在三陰乳腺癌中，miR-1293則起到抑癌基因的作用，可抑制乳腺癌的增殖和遷移[15]，說(shuō)明miR-1293基因的功能具有一定的組織依賴(lài)性。本研究結(jié)果還顯示，血清miR-1293表達(dá)水平升高是結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素，并且發(fā)現(xiàn)當(dāng)血清miR-1293為1.86時(shí)，其預(yù)測(cè)預(yù)后不良的靈敏度為84.0%，特異度為73.3%，AUC為0.826，說(shuō)明血清miR-1293檢測(cè)在預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良中具有較高的效能。本研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-1293和miR-4463檢測(cè)聯(lián)合預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良的靈敏度為96.0%，特異度為78.9%，AUC為0.930，其AUC明顯大于miR-1293和miR-4463單獨(dú)檢測(cè)，說(shuō)明二者在預(yù)測(cè)結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后不良中具有一定互補(bǔ)性，確切的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)血清miR-1293表達(dá)水平與miR-4463表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明miR-1293基因在結(jié)腸癌中表現(xiàn)為抑癌基因，而miR-4463基因在結(jié)腸癌中表現(xiàn)為促癌基因，在人體中二者存在某種平衡，若該平衡出現(xiàn)紊亂會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-4463和miR-1293參與了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展，血清miR-4463和miR-1293是結(jié)腸癌術(shù)后預(yù)后的獨(dú)立影響因素，在預(yù)測(cè)不良預(yù)后中具有較高的效能。