長(zhǎng)距離神經(jīng)損傷動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

李斯佳，陳宇婷，陳丹丹，付海洋

周圍神經(jīng)損傷是一種常見的疾病，擠壓、缺血、切割、牽引、電擊等意外、交通事故及醫(yī)源性獲得性神經(jīng)損傷都是這一疾病的原因。全世界每年約有100 萬(wàn)患者需要進(jìn)行周圍神經(jīng)手術(shù)[1]。 大約2.8%創(chuàng)傷患者會(huì)出現(xiàn)周圍神經(jīng)損傷， 導(dǎo)致殘疾和生存質(zhì)量顯著下降，造成終身功能障礙， 伴隨著感覺和運(yùn)動(dòng)功能的喪失，在某些情況下還伴有頑固性疼痛，需要進(jìn)行長(zhǎng)期的周圍神經(jīng)康復(fù)治療[2]。

如今，橋接神經(jīng)間隙的“金標(biāo)準(zhǔn)”是自體神經(jīng)移植。 然而這種技術(shù)伴隨著一些明顯缺點(diǎn)，如供體組織有限、供體部位發(fā)病率高（疼痛、瘢痕、神經(jīng)瘤、感覺喪失等），以及需要額外的手術(shù)等[3～6]。 而異體移植則往往伴隨著免疫排斥反應(yīng)，一些自體移植替代物的神經(jīng)再生狀況也難以達(dá)到自體移植的效果。

了解周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)再生和生理機(jī)能對(duì)于促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后的功能恢復(fù)至關(guān)重要，因此需要評(píng)估不同藥物、 產(chǎn)品和材料的毒性和生物相容性。長(zhǎng)期以來(lái)，嚙齒動(dòng)物、豬、小反芻動(dòng)物和靈長(zhǎng)類是神經(jīng)科學(xué)中最常使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[7]。與小鼠相比，大鼠周圍神經(jīng)手術(shù)所需的顯微外科技術(shù)少，且大鼠的四肢和神經(jīng)足夠長(zhǎng)， 可以在坐骨神經(jīng)進(jìn)行至少1.5 ～2.0 cm 的間隙修復(fù)研究。雖然用于分子和組織學(xué)檢查的大鼠特異性抗體的可用性相當(dāng)受限， 但是由于它們飼養(yǎng)經(jīng)濟(jì)、易于照顧和處理，可以獲得足夠的樣本，評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)或感覺恢復(fù)的功能測(cè)試也更為標(biāo)準(zhǔn)化，因而成為在周圍神經(jīng)修復(fù)研究中最廣泛使用的動(dòng)物模型[3]。

3 cm 的神經(jīng)缺損長(zhǎng)度是一個(gè)臨界值， 對(duì)于長(zhǎng)度不超過(guò)3 cm 的短缺損和直徑較小的神經(jīng)缺損， 已經(jīng)有可靠的人工神經(jīng)移植或自體靜脈移植方法橋接或重建神經(jīng)缺損。所有上市的神經(jīng)移植物都能夠在不超過(guò)3 cm 的小距離內(nèi)證明足夠的神經(jīng)再生能力， 該領(lǐng)域現(xiàn)存的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題是是否可能對(duì)更長(zhǎng)的大缺陷長(zhǎng)度進(jìn)行神經(jīng)重建[4]，因此需要建立一些長(zhǎng)距離神經(jīng)損傷的模型，下面列舉了一些近年來(lái)較長(zhǎng)距離或在大動(dòng)物上進(jìn)行的神經(jīng)損傷再生研究。

1 犬模型

犬的坐骨神經(jīng)和腓神經(jīng)被用于建立長(zhǎng)度5 cm 以上的神經(jīng)損傷模型。坐骨神經(jīng)是哺乳動(dòng)物中較長(zhǎng)的神經(jīng)干，手術(shù)相對(duì)容易，也最常被用于研究神經(jīng)損傷。坐骨神經(jīng)起源于腰骶神經(jīng)叢，終止于膝關(guān)節(jié)水平，支配下肢的運(yùn)動(dòng)和感覺功能。神經(jīng)的復(fù)雜性使得當(dāng)測(cè)定有髓神經(jīng)纖維數(shù)量和大小的定量數(shù)據(jù)時(shí)坐骨神經(jīng)再生的形態(tài)學(xué)分析變得復(fù)雜[8]，可以想見隨著再生神經(jīng)長(zhǎng)度增加，分析難度會(huì)更加明顯。此外，評(píng)估動(dòng)物坐骨神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的方式較有限，并且可能需要對(duì)動(dòng)物預(yù)先訓(xùn)練，例如Qiu S 等[9]術(shù)前、術(shù)后1 個(gè)月和6 個(gè)月在寵物跑步機(jī)上以3 km/h 的速度記錄每只犬的步態(tài)，Xue C 等[10]預(yù)先訓(xùn)練犬熟悉環(huán)境和壓力感應(yīng)走道，在傳感走道上測(cè)量了步態(tài)的動(dòng)力學(xué)和時(shí)空參數(shù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析，這些實(shí)驗(yàn)都需要對(duì)動(dòng)物進(jìn)行訓(xùn)練才得以繼續(xù)進(jìn)行。

1.1 腓神經(jīng)損傷模型

Matsumoto K 等[11]驗(yàn)證層粘連蛋白涂層膠原纖維填充的聚乙醇酸膠原管橋接8 cm 間隙， 選擇比格犬的左腓神經(jīng)， 在左側(cè)大腿外側(cè)進(jìn)行10 cm 的皮膚切口，通過(guò)分離肌肉暴露坐骨神經(jīng)和腓神經(jīng)。 用手術(shù)剪沿坐骨神經(jīng)腘分叉到腓腸神經(jīng)分支遠(yuǎn)端，切斷腓骨分支， 去除8 cm 長(zhǎng)的腓神經(jīng)段。 將神經(jīng)導(dǎo)管插入間隙中，神經(jīng)斷端的近端和遠(yuǎn)端殘端插入神經(jīng)導(dǎo)管5 mm，導(dǎo)管兩端用6-0 聚丙烯神經(jīng)外膜縫線固定。 其中4只犬的左側(cè)腓神經(jīng)切斷并保持未橋接作為陰性對(duì)照。 術(shù)后每個(gè)月在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行電生理記錄，采用不銹鋼雙極針電極對(duì)坐骨神經(jīng)切跡進(jìn)行電刺激后，記錄脛前肌的復(fù)合肌肉動(dòng)作電位（compound muscle action potential，CMAP）、 體感誘發(fā)電位（somatosensory evoked potential，SEP）和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（motor evoked potential，MEP）以評(píng)價(jià)感覺和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)作為全神經(jīng)系統(tǒng)的恢復(fù)情況。在相同的刺激和記錄位點(diǎn)以相同的姿勢(shì)進(jìn)行測(cè)量以獲得可重復(fù)的結(jié)果。 此外，在植入組部分犬中，對(duì)第6 腰椎棘突外側(cè)經(jīng)皮穿刺刺激腓神經(jīng)后的脊髓誘發(fā)電位 （spinal cord evoked potential，SCEP）進(jìn)行詳細(xì)的分析。 術(shù)后12 個(gè)月處死2 只植入組犬和1 只未植入組犬，制備神經(jīng)標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。 用甲苯胺藍(lán)染色坐骨神經(jīng)再生段近端、再生段中端、再生段遠(yuǎn)端的橫斷面有髓神經(jīng)纖維，圖像經(jīng)計(jì)算機(jī)處理以測(cè)定軸突密度、軸突直徑、神經(jīng)組織總面積和髓鞘厚度。證明周圍神經(jīng)能夠經(jīng)研究所用神經(jīng)導(dǎo)管橋接通過(guò)80 mm 的缺口再生。 并且隨后課題組使用同層粘連蛋白浸泡膠原海綿充填聚羥基乙酸-膠原神經(jīng)導(dǎo)管，在同樣的模型上驗(yàn)證了新材料在同樣距離缺損上較為良好的誘導(dǎo)神經(jīng)間隙恢復(fù)能力[12]，顯示出犬左腓神經(jīng)可以用作長(zhǎng)距離神經(jīng)間隙恢復(fù)的研究。

1.2 坐骨神經(jīng)損傷模型

縱向定向膠原導(dǎo)管（longitudinally oriented collagen conduit，LOCC）由于具有良好的生物相容性、生物可降解性和低毒性等特點(diǎn)， 用于神經(jīng)再生材料的生產(chǎn)。 Yao Y 等[13]采用LOCC 聯(lián)合神經(jīng)生長(zhǎng)因子（nerve growth factor，NGF）修復(fù)成年犬坐骨神經(jīng)35 mm 缺損。20 只成年比格犬被分為4 組（LOCC 組，LOCC/NGF 組，自體移植組，對(duì)照組），麻醉后切除坐骨神經(jīng)，留下一個(gè)35 mm 長(zhǎng)的神經(jīng)間隙。 術(shù)后9 個(gè)月，對(duì)雙側(cè)坐骨神經(jīng)進(jìn)行電生理學(xué)檢查， 對(duì)側(cè)未受傷側(cè)作為正常對(duì)照。收集神經(jīng)組織制成切片標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析、快速藍(lán)染色分析、電子顯微鏡分析；解剖移植的鄰近神經(jīng)組織，切除受傷和未受傷后肢的腓腸肌，稱其質(zhì)量，測(cè)定其肌質(zhì)量比以評(píng)價(jià)腓腸肌功能；計(jì)算CMAP振幅比值作為各組受傷側(cè)與對(duì)側(cè)未受傷側(cè)的比值。免疫組織化學(xué)和快速藍(lán)染色結(jié)果均表明再生狀況良好度為自體移植組＞LOCC/NGF 組＞LOCC 組。 課題組隨后在同樣模型中進(jìn)一步驗(yàn)證了在LOCC 中載入人類臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSC）對(duì)損傷修復(fù)的影響[14]。術(shù)后9 個(gè)月進(jìn)行評(píng)估，LOCC/hUC-MSC 組比單獨(dú)使用LOCC 更好地恢復(fù)了神經(jīng)功能， 證實(shí)了hUC-MSC 促進(jìn)外周神經(jīng)再生的潛力。

另一項(xiàng)研究在15 只比格犬中驗(yàn)證脫細(xì)胞神經(jīng)基質(zhì)水凝膠 （decellularized nerve matrix hydrogel，DNMG）和膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 （glial-derived neurotrophic factor，GDNF） 修飾的脫細(xì)胞神經(jīng)支架（decellularized nerve matrix scaffolds，DNM-S） 橋接5 cm的坐骨神經(jīng)缺損[9]。 15 只比格犬隨機(jī)分為3 組，即自體移植組、DNM-S 組和GDNF-DNMG 修飾的DNMS（DNM-S/GDNF-DNMG）組。 麻醉后，通過(guò)皮膚切口和分離下面的肌肉暴露坐骨神經(jīng)， 切除坐骨神經(jīng)節(jié)段，在神經(jīng)末梢收縮后留下5 cm 長(zhǎng)的缺損。在自體移植組中， 移除的神經(jīng)段逆轉(zhuǎn)180°并重新植入；在DNM-S 組中， 坐骨神經(jīng)缺損由5 cm DNM-S 橋接。DNM-S/GDNF-DNMG 組在坐骨神經(jīng)缺損處多點(diǎn)注射0.05 mL GDNF-DNMG 后，將DNM-S 植入缺損處。術(shù)前和術(shù)后1 個(gè)月、6 個(gè)月在寵物跑步機(jī)上以3 km/h速度記錄每只犬的步態(tài)。行為觀察、電生理評(píng)估、再生神經(jīng)和神經(jīng)化靶肌肉檢查評(píng)估結(jié)果提示， 與DNM-S組相比，DNM-S/GDNF-DNMG 組在移植6 個(gè)月后肢體功能、電生理反應(yīng)和組織學(xué)檢查均有改善，與自體移植組之間的差距較小， 從而表明DNMG 和GDNF修飾DNM-S 可促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，DNM-S的非細(xì)胞修飾是治療長(zhǎng)段神經(jīng)缺損的一種有效方法。

Peng Y 等[15]設(shè)計(jì)了神經(jīng)引導(dǎo)膠原-殼聚糖（collagen-chitosan，CCH）支架，促進(jìn)修復(fù)比格犬30 mm 長(zhǎng)坐骨神經(jīng)缺損。 植入后12 周和24 周，CCH 人工神經(jīng)移植物完全被組織吸收和取代，神經(jīng)樣外觀連接兩個(gè)神經(jīng)殘端。 記錄每只犬的姿勢(shì)和步態(tài)，并進(jìn)行電生理測(cè)試、熒光金逆行追蹤測(cè)試、腓腸肌組織學(xué)評(píng)估和神經(jīng)再生免疫熒光染色， 結(jié)果表明刺激后CMAP 峰值振幅、CMAP 潛伏期、神經(jīng)傳導(dǎo)速度、軸突再生和髓鞘形成程度與自體移植組相當(dāng)，逆行標(biāo)記感覺神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量上無(wú)顯著性差異。這些結(jié)果證實(shí)再生神經(jīng)途徑是完整的，并且在再生神經(jīng)中存在有效軸突運(yùn)輸，提示組織工程化神經(jīng)移植物是較大缺損周圍神經(jīng)治療的有利方案。

靜電紡絲技術(shù)制備的支架具有孔隙率高、表面積大等特點(diǎn)，可增強(qiáng)細(xì)胞與支架的接觸，促進(jìn)移植片段的新血管生成、 營(yíng)養(yǎng)交換和代謝產(chǎn)物的生成。 Xue C等[10]使用電紡絲技術(shù)制備絲素蛋白神經(jīng)支架，并用絲素纖維填充管腔形成神經(jīng)支架， 用于橋接犬3 cm 坐骨神經(jīng)間隙，自體移植組和非移植組作為對(duì)照組。 術(shù)后12 個(gè)月進(jìn)行評(píng)估，所有功能、組織學(xué)和形態(tài)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)均表明絲素蛋白神經(jīng)支架的再生效果良好，與自體神經(jīng)移植組相當(dāng)。研究驗(yàn)證了絲素蛋白神經(jīng)支架修復(fù)神經(jīng)的優(yōu)越表現(xiàn)，而且有助于評(píng)估以絲素蛋白為基礎(chǔ)的治療的安全性，這對(duì)于臨床試驗(yàn)是必要的。

Chen C 等[16]探討了在犬3 cm 坐骨神經(jīng)缺損中，丙酸睪丸素（testosterone propionate，TP）對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）填充的同種異體神經(jīng)移植物（acellular nerve allograft，ANA）修復(fù)能力的促進(jìn)作用。將ANA+BMSC 植入缺損處，并在缺損小腿外側(cè)注入TP。 以正常組、自體移植組、ANA+BMSC 組、ANA 組和非移植組為對(duì)照組。術(shù)后5 個(gè)月，TP+ANA+BMSC 組犬能夠正常步行和跳躍，自體移植組和ANA+BMSC 組盡管有輕微的跛行，但表現(xiàn)幾乎相同。 TP+ANA+BMSC 組損傷側(cè)未損傷部位復(fù)合肌肉動(dòng)作電位顯著高于ANA +BMSC 組，且有髓神經(jīng)的直徑比值和再生髓鞘的厚度比值均顯著大于其他組，表明TP 可以顯著提高ANA+BMSC 組的修復(fù)效果。

1.3 下腹神經(jīng)損傷模型

下腹神經(jīng)（hypogastric nerve，HGN）是位于腹膜腔的交感神經(jīng)，控制泌尿和精液功能。 Ito T 等[17]驗(yàn)證了使用人工神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)自主神經(jīng)間隙進(jìn)行干預(yù)的情況。研究采用聚乙醇酸-膠原蛋白神經(jīng)導(dǎo)管填充膠原海綿，觀察兩只犬HGN 的再生情況。 通過(guò)下正中切口進(jìn)行10 cm 的剖腹手術(shù)，在植入組中暴露右側(cè)HGN，從周圍組織仔細(xì)解剖以避免神經(jīng)損傷，用手術(shù)剪去除10 mm 長(zhǎng)的HGN 段，將神經(jīng)導(dǎo)管插入間隙中。手術(shù)后8 個(gè)月測(cè)量精管、 膀胱頸和前列腺的反應(yīng)來(lái)評(píng)價(jià)HGN 的再生。在神經(jīng)刺激之前切斷左側(cè)HGN 以消除替代途徑。 切除HGN 再生部分后，反應(yīng)減弱，證明了HGN 的再生， 提示這種神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)于患有泌尿和精液紊亂的患者有潛在幫助。

2 綿羊模型

綿羊的身體和周圍神經(jīng)尺寸與人類相似[18]，神經(jīng)再生速度也相同[19，20]。 綿羊神經(jīng)在組織形態(tài)學(xué)上與人類相同，是多束的[21]，其與人類具有相對(duì)確定的年齡對(duì)應(yīng)關(guān)系[22]，同時(shí)綿羊也是較為溫順的動(dòng)物，容易獲得和飼養(yǎng)，使用時(shí)比其他物種引起的倫理問(wèn)題更少[23]。在綿羊后肢進(jìn)行的腓總神經(jīng)切除手術(shù)創(chuàng)傷小、操作比較容易，手術(shù)入路、神經(jīng)隔離、病變誘導(dǎo)和治療干預(yù)得以有效進(jìn)行。 Kornfeld T 等[24]使用綿羊脛神經(jīng)創(chuàng)建6 cm 神經(jīng)缺損， 綿羊在手術(shù)后表現(xiàn)出與腓神經(jīng)損傷類似的步態(tài)改變。Diogo CC 等[22]提到確定與腓總神經(jīng)（common peroneal nerve，CPN） 損傷相關(guān)的臨床表現(xiàn)對(duì)于確認(rèn)預(yù)期的神經(jīng)損傷隨著時(shí)間的推移而恢復(fù)至關(guān)重要， 應(yīng)包括評(píng)估動(dòng)物的精神狀態(tài)和自由活動(dòng)能力、姿勢(shì)反應(yīng)和傷害性反應(yīng)，并提出了測(cè)定動(dòng)物健康側(cè)與損傷側(cè)反應(yīng)差異時(shí)的一種簡(jiǎn)便方法：在綿羊腳下墊一片薄板，逐漸抽出，計(jì)算重新調(diào)整回固有姿勢(shì)的時(shí)間。 綿羊前腿正中神經(jīng)是一種大型混合神經(jīng)，其大小與人類腕部尺神經(jīng)相似，并且綿羊蹄受來(lái)自尺神經(jīng)和橈神經(jīng)的雙重感覺神經(jīng)支配，因此蹄感覺喪失和隨后的創(chuàng)傷和敗血癥很少發(fā)生。 另一方面，綿羊正中神經(jīng)或感覺橈神經(jīng)的損傷不會(huì)產(chǎn)生任何可辨別的功能缺陷， 因此此模型在一定程度上不適用于行為研究。在不同的實(shí)驗(yàn)中，綿羊的正中神經(jīng)、坐骨神經(jīng)和CPN被用來(lái)作為創(chuàng)建神經(jīng)缺損的模型。

2.1 前肢正中神經(jīng)損傷模型

Strasberg SR 等[21]使用20 只體質(zhì)量30 ～35 kg 的近交母綿羊，在前肢正中神經(jīng)上進(jìn)行ANA 重建，對(duì)比ANA 的自體神經(jīng)移植、 神經(jīng)移植物預(yù)先冷凍保存對(duì)神經(jīng)再生的影響。 在前肢前外側(cè)行14 cm 切口，從橈側(cè)皮膚神經(jīng)獲得16 ～18 cm 的皮供神經(jīng)。 然后通過(guò)5 ～6 cm 皮膚切口暴露前肢內(nèi)側(cè)正中神經(jīng)，分離一段8 cm 長(zhǎng)的正中神經(jīng)，并創(chuàng)建5 cm 的神經(jīng)缺損，在缺損處置入2 根8 cm 長(zhǎng)的新鮮或冷凍保存的神經(jīng)移植物。 通過(guò)體內(nèi)神經(jīng)傳導(dǎo)評(píng)估新鮮/冷保存的自體移植物和同種異體移植物的周圍神經(jīng)再生，移除神經(jīng)移植物及近端和遠(yuǎn)端宿主神經(jīng)節(jié)段，使用甲苯胺藍(lán)染色切片在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)測(cè)量分析以檢查神經(jīng)纖維形態(tài)。結(jié)果顯示無(wú)論新鮮或冷保存的自體移植物都比ANA 表現(xiàn)出更良好的結(jié)構(gòu)， 并具有正常有髓神經(jīng)纖維的分布，而ANA 片段與致密瘢痕密切相關(guān)，神經(jīng)移植物萎縮。新鮮和冷保存的組別之間的神經(jīng)再生無(wú)顯著差異。

Forden J 等[25]從薩?？搜虻那爸巴鈧?cè)獲取18 cm的橈神經(jīng)段， 切斷成兩個(gè)7 cm 段反向并列放置以覆蓋正中神經(jīng)5 cm 缺損的橫截面， 裁去多余長(zhǎng)度進(jìn)行無(wú)張力修復(fù)。 分別在6 和9 個(gè)月時(shí)進(jìn)行電生理學(xué)評(píng)估，記錄神經(jīng)動(dòng)作電位（nerve action potential，NAP），測(cè)量包括NAP 的存在與否，以及波形的延遲、傳導(dǎo)速度、振幅和面積，并切除神經(jīng)移植片段用于組織學(xué)、免疫組織化學(xué)和形態(tài)計(jì)量學(xué)分析。所有綿羊都具有可記錄的明顯NAD， 與對(duì)照組相比神經(jīng)傳導(dǎo)速度和振幅略有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，移植部位幾乎沒有瘢痕或纖維化，移植束中含有大量的再生軸突。 這項(xiàng)研究顯示綿羊前肢中的正中神經(jīng)是評(píng)估長(zhǎng)距離周圍神經(jīng)缺損通過(guò)神經(jīng)移植物再生的可重復(fù)、可靠模型。

Siemionow M 等[26]在綿羊模型上測(cè)試了自體神經(jīng)鞘管（epineural sheath conduit，ESC）修復(fù)6 cm 正中神經(jīng)缺損的可行性，實(shí)驗(yàn)選用8 只6 ～8 個(gè)月齡母綿羊，分為無(wú)缺損修復(fù)組、自體移植對(duì)照組和生理鹽水灌注自體ESC 組。 取綿羊正中神經(jīng)6 cm 段構(gòu)建ESC。 在神經(jīng)修復(fù)后6 個(gè)月， 測(cè)量神經(jīng)傳導(dǎo)速度和SEP 評(píng)估神經(jīng)感覺恢復(fù)， 通過(guò)甲苯胺藍(lán)染色評(píng)估髓鞘厚度、軸突密度和纖維直徑。 結(jié)果顯示移植物保留了ESC 的結(jié)構(gòu)完整性、血液運(yùn)行重建良好。 ESC 組與鄰近組織黏附程度、再生軸突的直徑和髓鞘厚度、最大傳導(dǎo)速度和動(dòng)作電位波幅與自體移植對(duì)照組相當(dāng)，但N2 潛伏期較長(zhǎng)；自體移植組平均軸突密度顯著高于ESC。

2.2 坐骨神經(jīng)損傷模型

Roballo KCS 等[27]在綿羊的坐骨神經(jīng)腓支上建立5 cm 損傷模型， 對(duì)比二分法和反向自體移植修復(fù)效果，與反向自體移植相比，二分法能顯著改善復(fù)合肌肉動(dòng)作電位和肌肉質(zhì)量，減少肌肉纖維化。 認(rèn)為在兩個(gè)相似的實(shí)驗(yàn)組之間，這些指標(biāo)持續(xù)保持著可辨別的差異，表明了這個(gè)神經(jīng)的敏感性及其對(duì)比研究的潛在適用性。

2.3 脛神經(jīng)損傷模型

Kornfeld T 等[24]使用黑頭羊坐骨神經(jīng)研究蛛絲神經(jīng)移植物促進(jìn)綿羊長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損軸突再生的情況。解剖左后肢， 暴露坐骨神經(jīng)并在脛神經(jīng)上創(chuàng)建6 cm的缺損，通過(guò)解剖脛神經(jīng)作為蛛絲神經(jīng)構(gòu)建體及6 cm長(zhǎng)自體神經(jīng)移植物的供體。 在植入后20、30、40、50、90、120、150 和180 d 記錄脛神經(jīng)損傷后的CMAP，測(cè)量運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（motor nerve conduction velocity，MNCV）和CMAP 波幅。 在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)解剖脛神經(jīng)并進(jìn)行免疫組織化學(xué)處理；橫切面染色抗s-100 和抗神經(jīng)絲進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，觀察神經(jīng)元再生和髓鞘再生的進(jìn)展；Masson-Goldner-tricchrome 染色觀察瘢痕形成和結(jié)締組織；并測(cè)量不同位置神經(jīng)纖維束的直徑以確定軸突再生率。結(jié)果表明，基于生物材料的蜘蛛絲神經(jīng)導(dǎo)管在促進(jìn)神經(jīng)再生方面與自體神經(jīng)植入物一樣有效。研究同時(shí)評(píng)估了兩種模型中的軸突再生速度，人工神經(jīng)移植物中神經(jīng)再生發(fā)生了10 d 左右的初始延遲，這被解釋為內(nèi)源性雪旺細(xì)胞浸潤(rùn)需要一些時(shí)間。

2.4 腓神經(jīng)損傷模型

Alvites RD 等[28]建立了一個(gè)綿羊CPN 損傷模型，因?yàn)檠虻牟綉B(tài)動(dòng)力學(xué)和在環(huán)境探索中的表現(xiàn)能夠模仿人類在下肢受傷時(shí)觀察到的功能性后果，同時(shí)選擇CPN 避免了動(dòng)物不利帶來(lái)的嚴(yán)重功能性后果。 研究詳細(xì)展示了CPN 的解剖與定位關(guān)系，綿羊的姿勢(shì)、活動(dòng)反應(yīng)和精神狀態(tài)與神經(jīng)損傷評(píng)估的關(guān)系。

去細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植 （decellularized nerve allograft，DNC）是自體神經(jīng)移植（autograft，AG）修復(fù)嚴(yán)重末梢神經(jīng)損傷的替代方法，去細(xì)胞化過(guò)程完全消除了細(xì)胞性，同時(shí)保留了細(xì)胞外間質(zhì)。 Contreras E 等[29]評(píng)估了一個(gè)由VERIGRAFT 提供的新的DNC。 在綿羊腓神經(jīng)的7 cm 間隙中測(cè)定DNC， 并與AG 進(jìn)行比較。 通過(guò)臨床、電生理學(xué)和超聲波測(cè)試評(píng)估神經(jīng)再生和功能恢復(fù)情況。 各組間功能恢復(fù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 組織學(xué)顯示AG 和DNC 中再生軸突的組織結(jié)構(gòu)與數(shù)量不同，認(rèn)為是細(xì)胞成分發(fā)揮作用，但在細(xì)胞成分的保留和免疫排斥中存在一個(gè)平衡。 在綿羊5 cm腓神經(jīng)缺損中評(píng)估了另一個(gè)DNC[30]，其結(jié)果表明脫細(xì)胞移植物能夠修復(fù)綿羊5 cm 神經(jīng)間隙并支持有效軸突再生，由于缺乏雪旺細(xì)胞，觀察到功能恢復(fù)慢于自體移植。

隨后，在綿羊腓神經(jīng)創(chuàng)建了5 cm（AG5 組）和7 cm（AG7 組）缺損的手術(shù)模型，并在術(shù)后通過(guò)臨床評(píng)估來(lái)評(píng)價(jià)綿羊自體移植修復(fù)后感覺運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[31]。 其中本體感覺未發(fā)生明顯變化；右側(cè)脛前再生神經(jīng)支配肌的肌肉質(zhì)量與對(duì)側(cè)相比在術(shù)后1 個(gè)月明顯減少， 直到監(jiān)測(cè)期結(jié)束時(shí)AG5 組才檢測(cè)到相較術(shù)后30 d 的明顯改善；捏足背皮膚的退縮反射消失，在監(jiān)測(cè)期中緩慢恢復(fù)，其中肢體近端和中段接近正常水平（可能是側(cè)支神經(jīng)再支配所致），而遠(yuǎn)端的反射反應(yīng)與腓骨再神經(jīng)支配的恢復(fù)相匹配。兩組綿羊的恢復(fù)進(jìn)程一致，但AG7 組恢復(fù)效果更差。自體神經(jīng)移植物束狀結(jié)構(gòu)保持，近、遠(yuǎn)端縫合線上均可見神經(jīng)瘤；神經(jīng)束內(nèi)外可見再生有髓軸突和雪旺細(xì)胞，其中遠(yuǎn)端有髓軸突和雪旺細(xì)胞僅在束內(nèi)觀察到；AG5 組中有髓軸突的數(shù)量顯著高于AG7 組。 研究對(duì)于感覺功能的評(píng)估能夠作為電生理、組織學(xué)檢查的補(bǔ)充，使研究者能夠更全面地評(píng)估綿羊腓神經(jīng)缺損的恢復(fù)。

3 豬模型

與嚙齒動(dòng)物和兔子模型相比，豬有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)。 首先，大型動(dòng)物更接近于人類生物學(xué)和大小，這對(duì)于評(píng)估缺血和神經(jīng)再生的結(jié)果是至關(guān)重要的——兩者都取決于組織的大小和灌注與再生的距離。 第二，使用大型動(dòng)物模型，可以更精確地控制血管和神經(jīng)，由于結(jié)構(gòu)較大，手術(shù)時(shí)獨(dú)立地分離組織結(jié)構(gòu)。第三，大型動(dòng)物的藥理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)比嚙齒動(dòng)物和兔子更接近人類。 山羊和綿羊都被用作大型動(dòng)物模型，但它們腿很細(xì)，幾乎沒有軟組織覆蓋，因此傷口愈合成為一個(gè)問(wèn)題。此外，它們的遠(yuǎn)端肌肉質(zhì)量很小，使測(cè)量結(jié)果不太可靠；而豬的皮膚較厚，皮下組織和肌肉質(zhì)量大，很好地解決了這個(gè)問(wèn)題[32]。 3 個(gè)月大的美國(guó)約克夏豬的坐骨神經(jīng)直徑與人類成年上肢的周圍神經(jīng)相似，并且其坐骨神經(jīng)及分支支配大腿后側(cè)和小腿的所有肌肉，提高了臨床檢查和肌電圖/神經(jīng)傳導(dǎo)研究檢測(cè)損傷和恢復(fù)的敏感性。由于豬生理學(xué)和解剖學(xué)與人類的相似性，其腓神經(jīng)也可用于創(chuàng)建神經(jīng)損傷模型，并具有此物種的優(yōu)勢(shì)。

Burrell JC 等[33]建立了一個(gè)豬周圍神經(jīng)損傷模型。研究使用年輕的成年尤卡坦小型豬，詳細(xì)表征了使用大隱神經(jīng)或自體腓腸神經(jīng)移植修復(fù)CPN 或腓深神經(jīng)（deep peroneal nerve，DPN）節(jié)段性缺損的方法：從髖關(guān)節(jié)到外踝直線切開，將臀肌縱向分開，暴露坐骨神經(jīng)及其分叉至脛骨和膝關(guān)節(jié)。 CPN 起源于坐骨神經(jīng)外側(cè)，進(jìn)入腓骨頸周圍的腘窩，分叉至腓淺神經(jīng)（superficial peroneal nerve，SPN）和DPN。 部分切除股二頭肌的肌腱，暴露合適的CPN 長(zhǎng)度。在對(duì)側(cè)小腿腹股溝區(qū)相對(duì)于第一CPN 修復(fù)部位進(jìn)行4 cm 的切口，解剖皮下和筋膜層，分離股薄肌和縫匠肌以暴露隱神經(jīng)的一部分。 切除隱神經(jīng)的一部分（≥6 cm）。 采用自體無(wú)張力逆行神經(jīng)移植，修復(fù)5 cm 的CPN 節(jié)段。 對(duì)于腓腸神經(jīng)自體移植修復(fù)DPN 的長(zhǎng)節(jié)段缺損， 可在膝關(guān)節(jié)遠(yuǎn)端1.5 cm 的后肢外側(cè)面， 相對(duì)于原來(lái)的DPN修復(fù)部位， 在同側(cè)小腿上向外踝延伸一個(gè)線性切口。解剖筋膜層并剝離腓骨長(zhǎng)肌以暴露遠(yuǎn)端CPN。 解剖指長(zhǎng)伸肌與腓骨、腓長(zhǎng)肌與腓骨之間的筋膜面，進(jìn)一步暴露DPN。 在外踝后約3 cm 處進(jìn)行縱向切口，切除一段5.5 ～6.0 cm 的腓腸神經(jīng)片段。 從分叉遠(yuǎn)端0.5 cm 處切除5 cm 片段并完成無(wú)張力逆行腓腸神經(jīng)移植。 在修復(fù)后9 個(gè)月觀察到小CAMP，表明再生軸突已經(jīng)穿過(guò)移植區(qū)，并開始在離損傷部位約27 cm 的遠(yuǎn)端分布區(qū)重新支配神經(jīng)。

Su CF 等[34]在1.5 cm 豬周圍神經(jīng)修復(fù)模型中評(píng)估人羊水干細(xì)胞在神經(jīng)導(dǎo)管中使用的效果時(shí)，采用了磁共振彌散成像來(lái)提供一種有效且無(wú)創(chuàng)的方法用以顯示坐骨神經(jīng)并監(jiān)測(cè)損傷神經(jīng)再生進(jìn)程的追蹤研究。脛前肌和趾短伸肌CMAP 的測(cè)定用于評(píng)估修復(fù)的MNCV。

4 靈長(zhǎng)類模型

4.1 正中神經(jīng)損傷模型

Fadia NB 等[35]在恒河猴模型中研究了一種可生物降解的聚己內(nèi)酯（polycaprolactone，PCL）導(dǎo)管，在恒河猴5 cm 的正中神經(jīng)缺損中植入了一個(gè)PCL/膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF） 聚合物神經(jīng)導(dǎo)管和一個(gè)微球輸送系統(tǒng)，能夠持續(xù)釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，并與自體反向移植和含空雙壁微球的聚合物神經(jīng)導(dǎo)管（PCL/無(wú)細(xì)胞組）進(jìn)行比較。 為了測(cè)試功能恢復(fù)，訓(xùn)練了恒河猴，讓它們只用拇指和食指從特制的板上取出糖丸，其中如果只使用拇指和食指，動(dòng)作被記錄為正確；若使用如手掌參與動(dòng)作，則被記錄為不正確。 在術(shù)后第3 周至第50 周， 分析這些取物的動(dòng)作， 并記錄正確的次數(shù)。并且對(duì)正中神經(jīng)復(fù)合神經(jīng)動(dòng)作電位、對(duì)拇短展肌、小指展肌和第一背側(cè)骨間肌進(jìn)行肌內(nèi)記錄， 獲得CMAP。 結(jié)果表明PCL/GDNF 組和自體移植組在1 年時(shí)表現(xiàn)出相似的正確動(dòng)作百分比；PCL/Empty 組功能恢復(fù)最低， 明顯低于PCL/GDNF 組和自體移植組，顯示神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)此缺損的恢復(fù)是必要的。

4.2 橈神經(jīng)損傷模型

Holzer P 等[36]使用自體移植和異種異體移植修復(fù)恒河猴橈神經(jīng)4 cm 缺損。橈神經(jīng)鄰近神經(jīng)少，不易對(duì)其他神經(jīng)代償功能評(píng)估造成影響；其缺損導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)障礙易于通過(guò)孤立動(dòng)作觀察；同時(shí)不會(huì)對(duì)動(dòng)物福利產(chǎn)生較大影響。異種異體移植物是與人類及非人靈長(zhǎng)類神經(jīng)結(jié)構(gòu)相似的豬坐骨神經(jīng)， 包括新鮮組和冷凍組，在恒河猴對(duì)側(cè)上臂進(jìn)行自體反向移植為對(duì)照組。術(shù)后進(jìn)行神經(jīng)傳導(dǎo)速度與功能、 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估和病理學(xué)、免疫原性、血液學(xué)及臨床化學(xué)檢測(cè)。 受體無(wú)任何組織發(fā)生排異相關(guān)損害， 到檢測(cè)時(shí)供體組織已被完全替代； 異種移植的再生神經(jīng)能夠再支配洋地黃伸肌，功能恢復(fù)、電生理和形態(tài)學(xué)結(jié)果與自體對(duì)照相似。

5 總結(jié)與展望

盡管周圍神經(jīng)再生的研究大多使用小動(dòng)物模型，但物種之間的差異限制了臨床結(jié)果的可遷移性，在小動(dòng)物中被認(rèn)為是長(zhǎng)間隙神經(jīng)缺損的損傷范圍，在人類中可能不被認(rèn)為是嚴(yán)重的神經(jīng)損傷；此外，結(jié)締組織在嚙齒動(dòng)物神經(jīng)中的比例是不同的，而且該物種具有極高的神經(jīng)再生率，這導(dǎo)致神經(jīng)修復(fù)方法的有效性評(píng)定可能存在明顯誤差[37]。

在中大型哺乳動(dòng)物中坐骨神經(jīng)常被選為創(chuàng)建神經(jīng)損傷的部位，因?yàn)樽巧窠?jīng)損傷導(dǎo)致的脛前肌失去支配進(jìn)而導(dǎo)致的足下垂是較容易觀測(cè)和評(píng)估的行為指標(biāo)，同時(shí)坐骨神經(jīng)也擁有足夠長(zhǎng)度，近年人工神經(jīng)導(dǎo)管修復(fù)犬坐骨神經(jīng)缺損已經(jīng)成為一個(gè)常用的模型；但坐骨神經(jīng)損傷也會(huì)造成動(dòng)物較嚴(yán)重的疼痛和行動(dòng)能力失調(diào)，增加護(hù)理難度。 綿羊腓神經(jīng)也是常用的長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損模型，該神經(jīng)有較好的可及性及較多損傷后評(píng)估方法的數(shù)據(jù)累積。豬神經(jīng)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)在于其許多解剖學(xué)特征、細(xì)胞外基質(zhì)組分、雪旺細(xì)胞分布與人類類似，但其飼養(yǎng)和護(hù)理要求較高。 恒河猴是常用的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其前臂神經(jīng)常被用于創(chuàng)建神經(jīng)損傷模型，通常需要專門設(shè)計(jì)測(cè)試來(lái)評(píng)估修復(fù)后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物由于與人類的相似性，是很好的平移模型，但也因此受到倫理上的使用限制。它們或許有助于測(cè)試合成神經(jīng)移植物的安全性和有效性，但在早期臨床前實(shí)驗(yàn)中相比其他動(dòng)物并無(wú)突出優(yōu)勢(shì)。

較大的動(dòng)物模型能更可靠地復(fù)制人類神經(jīng)的某些特征，例如它們的結(jié)構(gòu)組成、尺寸、直徑和再生過(guò)程[29]，同時(shí)可以創(chuàng)造更大的間隙，具有更長(zhǎng)的再生距離， 自體神經(jīng)移植物可以獲得更長(zhǎng)的用于修復(fù)的片段，有望成為模擬人類周圍神經(jīng)損傷中觀察到的長(zhǎng)距離神經(jīng)缺損和再生現(xiàn)象的有利模型。這也表明在大動(dòng)物中建立更長(zhǎng)距離的神經(jīng)間隙再生模型的必要性和可行性。 隨著神經(jīng)導(dǎo)管、神經(jīng)支架和人工移植物的改進(jìn)和豐富，越來(lái)越多研究選擇使用犬、綿羊和小型豬作為神經(jīng)損傷動(dòng)物模型，筆者對(duì)多種長(zhǎng)距離神經(jīng)損傷動(dòng)物模型進(jìn)行了總結(jié)，并對(duì)各自特點(diǎn)進(jìn)行了闡述。 研究者可以根據(jù)各自的研究目的和考察指標(biāo)選擇使用不同的動(dòng)物種屬， 使用的神經(jīng)損傷不限于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)。期望通過(guò)在大動(dòng)物模型構(gòu)建長(zhǎng)距離神經(jīng)損傷，在一定程度上高度模擬人類長(zhǎng)神經(jīng)損傷的再生環(huán)境。助力治療長(zhǎng)距離神經(jīng)損傷的生物材料產(chǎn)品成功上市。