前列腺素D2-DP1受體途徑對細(xì)菌性奶牛子宮內(nèi)膜炎炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響

楊效林，包海霞，毛 偉，劉 博，曹金山*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

在正常情況下，奶牛子宮是一個無菌的微環(huán)境，但在交配或分娩期間，很容易被細(xì)菌感染而導(dǎo)致慢性子宮內(nèi)膜炎[1]。當(dāng)奶?；技?xì)菌性子宮內(nèi)膜炎時，前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)參與炎癥反應(yīng)[2]。前列腺素D2(PGD2)是前列腺素家族的成員，通過其特異性受體在抑制肺部炎癥和子宮內(nèi)膜炎癥的過程中發(fā)揮重要作用[3]。研究證實，當(dāng)犬子宮受到細(xì)菌感染時，子宮組織中COX-2表達(dá)升高的同時，PGD2受體表達(dá)量也顯著升高[4]。煙酸通過激活PGD2/DP1信號通路對DSS/TNBS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性結(jié)腸炎具有多方面的有益作用[5]。然而，PGD2/DP1受體途徑是否在大腸埃希氏菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)感染奶牛子宮內(nèi)膜組織導(dǎo)致炎癥過程中發(fā)揮作用，目前尚不明確。

研究證實，1×105CFU/mL～1×109CFU/mL致病性E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h可引起炎癥反應(yīng)，其中以濃度1×106CFU/mL的E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織引起組織的炎癥反應(yīng)最為明顯[7]。E.coli感染后，促炎性細(xì)胞因子表達(dá)被顯著上調(diào)，而S.aureus感染后破壞子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞程度更加嚴(yán)重[1]。PGE2及EP2、EP4受體在E.coli引起的奶牛子宮內(nèi)膜組織炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[6-7]。而在哺乳動物子宮生理狀態(tài)的維持與抗感染過程中，PGD2/DP1受體途徑是否發(fā)揮著重要的調(diào)控作用目前尚不明確。本試驗用20 μL、濃度為1×106CFU/mL的E.coli與S.aureus混合感染體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織，分別與PGD2的DP1受體激動劑、DP1受體抑制劑共孵育12 h，通過檢測炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α和NOS-2的表達(dá)探究PGD2在奶牛子宮內(nèi)膜炎過程中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣本及菌株 奶牛子宮從當(dāng)?shù)赝涝讏鲑徺I；E.coli和S.aureus均是由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院實驗室保存的奶牛臨床型子宮內(nèi)膜炎致病性細(xì)菌(E.coli鑒定號：SYS110017，S.aureus鑒定號：SYR110018)。

1.1.2 主要試劑 LB培養(yǎng)基和M-H培養(yǎng)基，OXOID公司產(chǎn)品；DP1受體激動劑(BW-245C，15d-PGJ2)和DP1受體抑制劑(S5751，MK-0524)，CAYMAN公司產(chǎn)品；胎牛血清，Ex Cell公司產(chǎn)品；DMEM/F12培養(yǎng)基和青霉素和鏈霉素，Gibco公司產(chǎn)品；兩性霉素B，Generay公司產(chǎn)品；mRNA提取試劑盒，Axygen Scientific公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；SYBR Green Master ，Rox公司產(chǎn)品；所有引物均由Invitrogen公司合成；IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒，R&D公司產(chǎn)品；NOS-2抗體，Novus Bio公司產(chǎn)品；驢抗兔熒光二抗，Abcam公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱和低溫高速離心機(jī)，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，培英公司產(chǎn)品；激光共聚焦顯微鏡LSM800，熒光定量PCR儀和圖片處理系統(tǒng)，Zeiss公司產(chǎn)品；組織勻漿儀TP-24，杰靈儀器制造有限公司產(chǎn)品；超凈工作臺，AIRTECH公司產(chǎn)品；電子分析天平，TOLEDOD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 子宮內(nèi)膜組織的體外收集和培養(yǎng) 采集發(fā)情前期的健康荷斯坦奶牛的新鮮雙側(cè)子宮角進(jìn)行實驗室初步處理，4℃環(huán)境下在含50 g/L青-鏈霉素和20 g/L兩性霉素B的PBS中浸泡30 min，重復(fù)3次。在超凈臺中縱向剪開奶牛子宮內(nèi)膜組織并剪下條狀的子宮內(nèi)膜組織置于含20 g/L青-鏈霉素和10 g/L兩性霉素B的PBS中，4℃環(huán)境靜置20 min，重復(fù)2次。把子宮內(nèi)膜組織剪成直徑大約為2 mm的碎塊，并放入含有3.5 mL培養(yǎng)液(DEME/F12、200 mL/L胎牛血清、20 g/L青-鏈霉素)的6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(5% CO2、37℃)，每24 h更換一次培養(yǎng)基[6-7]。

1.2.2 細(xì)菌懸液的制備E.coli在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，S.aureus在M-H培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h(在37℃、200 r/min搖床中培養(yǎng))[1]。4℃、6 000 r/min離心10 min收集細(xì)菌，用無菌PBS洗滌菌體沉淀后重懸于組織培養(yǎng)液中，用于后期感染試驗[11]。

1.2.3 細(xì)菌體外感染試驗 按照文獻(xiàn)[1]方法培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織3 d，將培養(yǎng)基更換為僅含100 mL/L胎牛血清的DEME/12培養(yǎng)基3455 μL，在組織培養(yǎng)液中分別加入5 μL濃度為1×10-6mol/L DP1受體激動劑(BW-245C；15d-PGJ2)或DP1受體抑制劑(MK-0524；S5751)，同時加入20 μL預(yù)先稀釋到使用濃度(1×106CFU/mL)的E.coli和S.aureus共同培養(yǎng)12 h，收集組織和上清繼續(xù)后期試驗。試驗具體分組為：空白對照組，致病性E.coli和S.aureus組，BW-245C組，15d-PGJ2組，MK-0524組和S5751組。除對照組外，其他所有組別都各加入20 μL致病性E.coli和S.aureus。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 總mRNA提取具體試驗步驟按照說明書進(jìn)行，且所有樣品的總RNA濃度需調(diào)整為同一濃度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10 μL，上、下游引物各0.75 μL， cDNA模板1 μL，總體積25 μL。在ABI Quantstudio 7上以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，循環(huán)條件如下：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s,40個循環(huán)[8]。用2-ΔΔCt(ΔΔCt=ΔCt-ΔCt對照組，ΔCt=Ct目的基因-Ctβ-actin)的計算方法進(jìn)行目的基因表達(dá)的統(tǒng)計與分析[1]。RT-qPCR檢測用引物信息見表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

1.2.5 ELISA檢測 收集培養(yǎng)12 h所有組別的培養(yǎng)基上清液，對其進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋，根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作步驟測定相應(yīng)細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α)的含量，最終濃度需乘以稀釋倍數(shù)[4]。

1.2.6 免疫熒光試驗 包埋在O.C.T中的組織置于-20℃的冰凍切片中并切成6 μm厚度的冰凍組織切片，室溫干燥10 min，冷丙酮固定15 min后在含30 g/L牛血清白蛋白的PBS中室溫封閉1 h，用2.5 mL/L吐溫的冷PBS洗滌3次。置于濕盒內(nèi)避光4℃過夜孵育一抗，NOS-2一抗稀釋比例1∶100，次日濕盒內(nèi)室溫避光孵育二抗(1∶1 000)1 h[9]。使用激光共聚焦顯微鏡捕獲圖像并分析熒光強(qiáng)度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 每組試驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)統(tǒng)計用Graph-pad 6.0中的單因素方差分析(One-way ANOVA)，數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。

2 結(jié)果

2.1 PGD2/DP1受體途徑對IL-6、TNF-α、NOS-2 mRNA表達(dá)的影響

為研究PGD2/DP1受體途徑對E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織的細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)表達(dá)影響，用RT-qPCR法檢測奶牛子宮內(nèi)膜組織中IL-6、TNF-α和NOS-2 的表達(dá)(圖1)，E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織后IL-6、TNF-α和NOS-2的mRNA表達(dá)水平均顯著高于對照組(P<0.05)；使用DP1受體激動劑BW-245C和15d-PGJ2處理E.coli和S.aureus感染的奶牛子宮內(nèi)膜組織顯著抑制組織中IL-6、TNF-α和NOS-2的mRNA表達(dá)(P<0.05)，但DP1受體抑制劑(MK-0524、S5751)處理后IL-6、TNF-α和NOS-2的表達(dá)顯著高于細(xì)菌感染組(P<0.05)。表明PGD2/DP1受體途徑的激活參與了E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中IL-6、TNF-α和NOS-2的表達(dá)，并且在其中可能發(fā)揮著抑制炎癥反應(yīng)的作用。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 ELISA檢測結(jié)果

為進(jìn)一步研究PGD2/DP1受體途徑的激活對E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞因子的影響，分別收集培養(yǎng)奶牛子宮內(nèi)膜組織12 h的培養(yǎng)基上清液，檢測IL-6、TNF-α的表達(dá)水平(圖2)。E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中IL-6、TNF-α的分泌顯著高于空白對照組(P<0.05)；DP1受體激動劑BW-245C和15d-PGJ2處理顯著抑制組織中IL-6、TNF-α的分泌(P<0.05)；而DP1受體抑制劑MK-0524和S5751處理后，IL-6、TNF-α的分泌較細(xì)菌感染組顯著升高(P<0.05)，表明PGD2/DP1受體途徑參與了E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織IL-6、TNF-α的表達(dá)，進(jìn)一步證實了PGD2/DP1途徑對E.coli和S.aureus感染的奶牛子宮內(nèi)膜組織中細(xì)胞因子的表達(dá)具有抑制作用。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 PGD2/DP1受體途徑對NOS-2蛋白表達(dá)的影響

E.coli和S.aureus共感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中NOS-2的熒光強(qiáng)度顯著高于空白對照組(P<0.05)；DP1受體激動劑BW-245C和15d-PGJ2處理，兩種細(xì)菌共感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中NOS-2的熒光強(qiáng)度顯著減弱(P<0.05)；而DP1受體抑制劑MK-0524和S5751與E.coli和S.aureus感染的奶牛子宮內(nèi)膜組織共培養(yǎng)后，奶牛子宮內(nèi)膜組織的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，說明組織中NOS-2蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)(圖3)。表明PGD2/DP1受體途徑對E.coli和S.aureus感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中炎癥介質(zhì)的分泌具有調(diào)控作用。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

前列腺素(prostaglandins，PGs)的形成過程是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)在環(huán)氧合酶(cyclooxygenases，COX-2)的作用下轉(zhuǎn)化為前列腺素H2(prostaglandin H2，PGH2)，前列腺素合成酶(prostaglandin synthetase)將PGH2轉(zhuǎn)化為PGs[10]。PGD2合成酶包括組織型前列腺素D合成酶(L-PGDS)和血源型前列腺素D合成酶(H-PGDS)。Peter S等研究證實，在奶牛子宮內(nèi)膜炎后期或幾乎痊愈狀態(tài)下的子宮內(nèi)膜組織中均保持較高水平的PGD2合成酶表達(dá)，并且其表達(dá)與 IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α、趨化因子(CXCL1/2、CXCR2、CXCL3和CXCL5)、NOS-2、PTAFR 等具有一定的相關(guān)性[11]。Murata T和 Maehara T的綜述文獻(xiàn)中詳細(xì)的闡述了PGD2對急性肺炎、大腸炎、皮炎等的炎癥反應(yīng)過程中的不同階段具有抗炎作用[12]。PGD2通過兩種不同的受體發(fā)揮其生物學(xué)功能，即D型前列腺素(DP)受體1和Th2細(xì)胞上表達(dá)的趨化受體同源分子(CRTH2，也稱為DP2受體)。

本研究圍繞PGD2/DP1受體途徑，探討PGD2對E.coli和S.aureus誘導(dǎo)的奶牛子宮內(nèi)膜組織炎癥反應(yīng)的影響。用E.coli和S.aureus共感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中建立體外培養(yǎng)的奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷模型，通過RT-qPCR、ELISA、IFA等方法評估PGD2/DP1受體途徑對炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α和NOS-2表達(dá)的影響。研究表明，PGD2除了抑制中性粒細(xì)胞向炎癥部位浸潤炎癥組織中IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、iNOS 等炎癥因子表達(dá)而發(fā)揮抗炎作用[3]，提示DP1受體主要參與抑制受損傷組織、細(xì)胞炎性介質(zhì)的表達(dá)與分泌。本研究結(jié)果與此相一致(圖1)。E.coli與S.aureus共感染子宮內(nèi)膜組織中IL-6、TNF-α和NOS-2的表達(dá)均顯著高于空白對照組，DP1受體激動劑處理后顯著抑制了組織中IL-6、TNF-α和NOS的表達(dá)，但DP1受體抑制劑處理反而促進(jìn)組織中IL-6、TNF-α和NOS-2的表達(dá)，說明PGD2/DP1受體途徑可調(diào)控組織中IL-6、TNF-α和NOS-2的表達(dá)，并且PGD2/DP1受體途徑激活可能對奶牛子宮內(nèi)膜炎的組織損傷具有保護(hù)作用。IL-6和TNF-α含量的ELISA檢測結(jié)果與其mRNA表達(dá)趨勢一致(圖2)。NOS-2和奶牛子宮內(nèi)膜組織具有非常重要的聯(lián)系[13-14]。一氧化氮(NO)由多種參與免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的細(xì)胞合成。參與其中的主要酶是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的2型異構(gòu)體(NOS-2)，它能產(chǎn)生高水平的NO。NO可調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的活性、生長和死亡，包括巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、抗原提呈細(xì)胞、肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞。NOS-2在靜息態(tài)細(xì)胞中不表達(dá)，但多種刺激，如細(xì)菌、脂多糖(LPS)、細(xì)胞因子(如IL-1、TNF-α或IFN-γ)等能誘導(dǎo)其表達(dá)[15]。此外，NOS-2在亞臨床型子宮內(nèi)膜炎牛的子宮內(nèi)膜中高表達(dá)[13]，我們的研究結(jié)果與此一致。IFA結(jié)果顯示(圖3)，被細(xì)菌感染后子宮內(nèi)膜組織中NOS-2熒光強(qiáng)度較空白對照組顯著增強(qiáng)，DP1受體激動劑與細(xì)菌感染的奶牛子宮內(nèi)膜組織共孵育后，NOS-2熒光強(qiáng)度顯著減弱，但DP1受體抑制劑處理后，NOS-2熒光強(qiáng)度較細(xì)菌感染組顯著增強(qiáng)。說明PGD2/DP1受體途徑的激活在細(xì)菌感染奶牛子宮內(nèi)膜組織中可能發(fā)揮著抗炎作用,并且對奶牛子宮內(nèi)膜炎的組織損傷具有保護(hù)作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步探究PGD2對細(xì)菌性奶牛子宮內(nèi)膜組織損傷的調(diào)控作用機(jī)制積累了數(shù)據(jù)資料。