牛諾如病毒病研究進(jìn)展

苗 艷，朱慶賀，鐘 鵬，陳 亮，蘭世捷，張 蕾，馮萬宇，李 丹，沈思思，田秋豐，薛沾枚，劉雪松

(黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161000)

犢牛腹瀉引起的犢牛發(fā)病和死亡給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。諾如病毒(Noroviruses，NoVs)是一種在世界范圍內(nèi)引起人急性胃腸炎的重要病原。最初于1968年在俄亥俄州諾沃克的患有腸胃炎的人糞便中發(fā)現(xiàn)該病毒，因此諾如病毒原型株被命名為諾沃克病毒(Norwalk virus，NV)[1]。牛諾如病毒(Bovine noroviruse，BNoV)于1976年首次在英國(guó)紐伯里腹瀉犢牛糞便中發(fā)現(xiàn)，該毒株被命名為紐伯里2(Newbury agent 2)[1]。BNoV可能是一種致犢牛腸炎的一種病因，但常規(guī)對(duì)犢牛腹瀉的診斷未將該病毒包含其中，其對(duì)犢牛的影響仍不清楚。本文從BNoV的病原學(xué)、流行病學(xué)、 致病機(jī)制和診斷等方面進(jìn)行綜述，為該病的進(jìn)一步研究提供參考。

1 病原學(xué)

1.1 病毒結(jié)構(gòu)

NoVs是一種無囊膜的RNA病毒，為杯狀病毒科、諾如病毒屬成員。病毒粒子由一個(gè)20面體衣殼組成，該衣殼由90個(gè)單衣殼蛋白VP1的二聚體組成，形成32個(gè)杯形凹陷，諾如病毒外觀呈羽毛狀。病毒粒子直徑為27 nm～35 nm,基因組長(zhǎng)度為7.3 kb～7.7 kb，基因組RNA的5′端與基因組連接病毒蛋白(VPg)共價(jià)連接，5′端的非翻譯區(qū)(UTR為5-78位核苷酸)，基因組包含3個(gè)開放閱讀框(ORF)。ORF1編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，一種大小約為195 ku的多聚蛋白，該多聚蛋白通過自動(dòng)催化裂解產(chǎn)生6種非結(jié)構(gòu)蛋白，包括NS1-2(p48)、NS3核苷三磷酸酶、NS4蛋白(p22)、NS5蛋白(VPg)、NS6(3C樣蛋白)和RNA依賴性RNA聚合酶(RdRp)，它們可能在細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞膜運(yùn)輸和形成復(fù)制復(fù)合物中發(fā)揮作用；ORF2編碼大小約為60 ku的主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1，其包含兩個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，一個(gè)保守的殼結(jié)構(gòu)域(S)形成病毒粒子的核心，一個(gè)較為可變的突出結(jié)構(gòu)域(P)從中心核向外延伸，P域進(jìn)一步劃分為P1子域和高度可變的P2子域，后者參與與宿主細(xì)胞膜的相互作用，擁有最主要的表位。VP1在自組裝、衣殼形成、受體識(shí)別、宿主特異性、菌株多樣性和免疫原性等方面發(fā)揮作用。ORF3位于基因組的3′末端，編碼一種大小約20 ku的次要結(jié)構(gòu)蛋白VP2，與VP1蛋白的表達(dá)穩(wěn)定性相關(guān)，VP2可能參與衣殼組裝和基因組衣殼化[2-3]。

1.2 分類

國(guó)際病毒分類委員會(huì)(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)在2002年將杯狀病毒科分為4個(gè)屬，即Vesivirus、Lagovirus、Norovirus和Sapovirus，最近又分出第5個(gè)屬，暫定名為Nabovirus或Becovirus[4-5]?；赗dRp基因和VP1衣殼基因的保守區(qū)域的序列，將諾如病毒進(jìn)一步細(xì)分為基因群和基因型。目前，諾如病毒分為5個(gè)基因群，即GⅠ～GⅤ。人諾如病毒位于GⅠ、GⅡ、GⅣ基因群，GⅠ基因群被進(jìn)一步分為8個(gè)基因型，GⅡ基因群被進(jìn)一步分為19個(gè)基因型[6]。牛諾如病毒位于GⅢ基因群[7]，GⅢ基因群分為4個(gè)基因型(GⅢ.1～GⅢ.4)，Bo/Jena/80/DE和Bo/Newbury2/76/UK毒株分別為GⅢ.1和GⅢ.2的2個(gè)原型毒株，其中GⅢ.2在世界范圍內(nèi)分布最為普遍。Wolf等在新西蘭豬和羊糞便樣本中發(fā)現(xiàn)了與牛GⅢ型諾如病毒密切相關(guān)的諾如病毒，可能代表了第3個(gè)GⅢ基因型[8]。此外，鼠諾如病毒位于GⅤ基因群，豬諾如病毒位于GⅡ基因群，獅子、貓和狗諾如病毒位于GⅣ基因群[7]。還有報(bào)道提出了另外2個(gè)基因群，即GⅥ和GⅦ基因群[9-10]。此外，還有文獻(xiàn)報(bào)道了幾種新型諾如病毒，基因群總數(shù)增加到10個(gè)(GⅠ～GⅩ)，基因型增加到49個(gè)，即GⅠ基因群9個(gè)、GⅡ基因群27個(gè)、GⅢ基因群3個(gè)、GⅣ～GⅥ基因群各2個(gè)、GVⅡ～GⅩ基因群各1個(gè)[4]。

1.3 理化特性

諾如病毒在氯化銫(CsCl)中的浮力密度為1.33/cm3～1.41g/cm3。諾如病毒在環(huán)境中可保持?jǐn)?shù)周的傳染性，并能抵抗高達(dá)60℃的高溫和用于飲用水消毒的10 mL/L氯化消毒。通過非電離輻射(UV輻射)和電離輻射(γ輻射)可使諾如病毒失活。通過乙醇、高溫、改變pH、較高的氯濃度以及脈沖光處理可降低病毒滴度[11-12]。

2 流行病學(xué)

流行病學(xué)研究表明，NoVs在世界范圍內(nèi)廣泛存在，人、牛、豬和小鼠常感染該病毒。BNoV的相關(guān)研究較少，該病毒對(duì)牛的致病性尚不清楚。在世界多個(gè)大洲國(guó)家的牛中均檢測(cè)到BNoV，如亞洲[13]、歐洲[14]、非洲[15]、美洲[16]、大洋洲[17]的一些國(guó)家，包括韓國(guó)、美國(guó)、埃及、烏拉圭、澳大利亞等國(guó)家。目前，對(duì)該病毒的大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查較少，BNoV的感染情況在各項(xiàng)研究中的差異較大。英國(guó)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室局(Veterinary laboratories agency，VLA)和皇家獸醫(yī)學(xué)院(Royal veterinary college，RVC)進(jìn)行了一項(xiàng)合作研究，以確定BNoV在腹瀉牛中的流行情況。RVC通過RT-PCR對(duì)VLA提供的398份牛腹瀉樣品進(jìn)行BNoV的檢測(cè)，結(jié)果顯示BNoV的陽(yáng)性率為11%(44/398)[18]。但在對(duì)美國(guó)俄亥俄州的一項(xiàng)研究中，所檢測(cè)的糞便樣品中BNoV陽(yáng)性率則高達(dá)72%[14]。此外，用RT-PCR方法對(duì)美國(guó)密歇根州和威斯康星州奶牛場(chǎng)犢牛腹瀉糞便樣本中諾如病毒的存在進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示密歇根州和威斯康星州的NoV陽(yáng)性率分別為80%和25%[19]。以上研究結(jié)果表明，NoV感染率的高低可能與多種因素相關(guān)，包括地域的不同、牛場(chǎng)和飼養(yǎng)環(huán)境的不同、牛的品種等因素。我國(guó)對(duì)BNoV的研究較少，缺乏大規(guī)模的流行病調(diào)查，2017年第1次在牛糞便樣品中檢測(cè)到牛諾如病毒[20]。對(duì)河南部分地區(qū)的牛腹瀉病料進(jìn)行BNoV的PCR檢測(cè)[21]，結(jié)果顯示BNoV的檢出率為11.41%(21/184)。對(duì)我國(guó)6省份的25個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)采集的211份腹瀉牛糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，BNoV的陽(yáng)性率為20.5%，表明BNoV在我國(guó)也有較高的流行率[22]。但目前還無法確定BNoV是否可以作為引起腹瀉的原發(fā)病原或合并感染的主要病原。對(duì)埃及2個(gè)農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)[23]，在4%的腹瀉犢牛樣本中唯一檢測(cè)到的病原體是BNoV，20%的樣本中還檢測(cè)到其他病原。然而,該研究?jī)H對(duì)BRoV、 BAstV、BNoV、BCoV、 BToV和 BVDV共6種病毒病原進(jìn)行了檢測(cè)，未對(duì)細(xì)菌和寄生蟲病原進(jìn)行調(diào)查，因此無法確定BNoV是引起犢牛腹瀉的主要病原體。但有研究以GⅢ型 BNoV感染無菌犢牛[24]，結(jié)果無菌犢牛表現(xiàn)出厭食和水樣腹瀉癥狀，并伴有腸上皮壞死和絨毛萎縮。然而，目前證明BNoV是犢牛腹瀉的重要病原的證據(jù)仍有限。BNoV在健康犢牛中的潛在高流行率以及健康犢牛和腹瀉犢牛之間的病毒的排放量之間沒有顯著差異。用RT-qPCR方法對(duì)761份牛糞便或腸道內(nèi)容物進(jìn)行分析，BNoV總檢出率為66.1%，在腹瀉型和非腹瀉型犢牛樣品中BoNoV的檢出率相似，分別為78.8%和76.2%[16]。通過RT-qPCR對(duì)419份腹瀉和非腹瀉犢牛糞便樣品進(jìn)行BNoV檢測(cè)，結(jié)果在腹瀉和非腹瀉樣本中，BNoV的總體流行率無顯著差異[25]。表明BNoV的臨床相關(guān)性較有限，可能無法作為一種致腹瀉的主要病原體。BNoV在某些情況下作為唯一的感染因子或作為共同感染因子是否具有致病性目前尚不清楚。因此，BNoV與犢牛腹瀉之間的明確因果關(guān)系仍有待確定。

3 臨床特征和致病機(jī)制

腹瀉是感染BNoV的最主要臨床癥狀，此外還可能伴有嘔吐、短暫性厭食、精神沉郁和消化不良綜合征等癥狀。研究顯示，感染Bo/Jena/80/DE和 Bo/Newbury2/76/UK毒株?duì)倥５慕M織病理學(xué)損傷包括近端小腸黏膜下層的絨毛萎縮、隱窩增生和水腫，胃黏膜和直腸黏膜無損傷；感染CV186-OH/00/US毒株的犢牛表現(xiàn)為急性腹瀉，糞便排毒延長(zhǎng)，但無明顯的腸道損傷[2]。目前對(duì)BNoV的致病機(jī)制尚不清楚，但從其他物種的諾如病毒特別是從人諾如病毒上推斷，BNoV可以通過糞-口途徑進(jìn)行傳播，通過受污染的食物或飲水進(jìn)行傳播；另一種自然感染途徑可能是通過嘔吐物中的氣溶膠顆粒進(jìn)入呼吸道。諾如病毒具有高度感染性，約20個(gè)病毒粒子即可引起感染，通常在最初臨床癥狀之前或期間可檢測(cè)到排放的病毒粒子。NoVs一年四季均可感染，但通常有季節(jié)性，表現(xiàn)為冬季多發(fā)。與其他腸道病毒(如輪狀病毒、冠狀病毒、病毒性腹瀉病毒等)混合感染可能會(huì)影響諾如病毒感染的嚴(yán)重程度。

4 診斷

常規(guī)電鏡和免疫電鏡檢測(cè)方法由于檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，不足以用于常規(guī)診斷，已逐步被分子檢測(cè)方法取代。通常用RT-PCR或RT-qPCR對(duì)諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)。常用的引物可以檢測(cè)到諾如病毒屬的所有分離物，也可用特異性引物對(duì)諾如病毒所屬基因群進(jìn)行檢測(cè)和確定。在疫情暴發(fā)的情況下，可以對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，從而揭示感染病毒的遺傳進(jìn)化關(guān)系。多數(shù)檢測(cè)諾如病毒的RT-PCR引物都是根據(jù)RdRp基因末端高度保守區(qū)域、ORF2基因起始區(qū)域和NS3編碼序列進(jìn)行設(shè)計(jì)的[2,21]。使用不同的引物組合可對(duì)病毒完整的基因組進(jìn)行測(cè)定。新的分子技術(shù)，如二代測(cè)序、宏基因組測(cè)序等已開發(fā)用于諾如病毒的檢測(cè)和分析[26]。ELISA方法可用于對(duì)糞便樣本進(jìn)行抗原檢測(cè)、對(duì)血清樣品進(jìn)行抗體檢測(cè)。但抗原ELISA相對(duì)RT-PCR或RT-qPCR敏感性和特異性較低，可能對(duì)于低成本、高通量篩選多種糞便樣品中的諾如病毒有一定價(jià)值。不同模式的抗體ELISA檢測(cè)方法已被開發(fā)用于評(píng)估人和動(dòng)物諾如病毒的血清流行情況?？贵wELISA較抗原ELISA具有更廣泛的活性，且在遺傳關(guān)系密切的毒株之間很難區(qū)分異源反應(yīng)。因此，不能通過抗體ELISA來確定是否感染某種特定毒株。因目前還無法對(duì)諾如病毒進(jìn)行體外培養(yǎng)，因此對(duì)其血清學(xué)檢測(cè)方法的開發(fā)是一種障礙，但有研究人員通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并組裝成與感染性病毒顆粒具有相似形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性的VLP，以其作為病毒抗原進(jìn)行抗原/抗體ELISA檢測(cè)[27]。

5 基因重組和種間傳播

RNA重組是病毒進(jìn)化的重要驅(qū)動(dòng)力，重組可能會(huì)導(dǎo)致病毒毒力增強(qiáng)，或產(chǎn)生具有未知致病潛力的新毒株。隨著對(duì)諾如病毒屬重組病毒認(rèn)識(shí)的增加，諾如病毒重組病毒的鑒定也越來越多，重組點(diǎn)多位于ORF1和ORF2連接區(qū)。諾如病毒遺傳變異性較高，常發(fā)生基因重組，目前已發(fā)現(xiàn)兩種重組的BNoV：GⅢ.P1/GⅢ.2和GⅢ.P2/GⅢ.1，重組點(diǎn)位于ORF1/ORF2連接起始點(diǎn)上游的16-19位核苷酸。有研究鑒定了第1株重組BNoV毒株Bo/Thirsk10/00/UK，該毒株具有與GⅢ.1相關(guān)的RdRp序列和與GⅢ.2相關(guān)的衣殼編碼序列，隨后，在比利時(shí)、挪威和意大利都發(fā)現(xiàn)了GⅢ.P1/GⅢ.2重組毒株[2]。但目前僅鑒定出了1株具有與GⅢ.2相關(guān)的RdRp序列和與GⅢ.1相關(guān)的衣殼編碼序列的重組BNoV毒株，即B-1SVD/03/US[28]。目前關(guān)于BNoV重組毒株的鑒定和研究較少，無法確定上述2種重組BNoV毒株哪種占優(yōu)勢(shì)或流行范圍較廣。

人諾如病毒是全球食源性胃腸炎的主要原因。NoVs可感染多種動(dòng)物，尚不清楚動(dòng)物諾如病毒對(duì)人諾如病的發(fā)病是否存在一定作用。分子生物學(xué)分析結(jié)果表明，動(dòng)物和人諾如病毒毒株密切相關(guān)，尤其是豬諾如病毒，它們與一些人諾如病毒毒株屬于同一基因組(GⅡ)[2]。英國(guó)學(xué)者對(duì)諾如病毒的人畜共患可能性進(jìn)行了定性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將BNoVs歸類為0級(jí)(在4級(jí)之前不存在人畜共患病)[29]。有研究以Gn犢牛為動(dòng)物模型研究人諾如病毒(GⅡ.4-HS66)致病機(jī)制和宿主免疫應(yīng)答[30]，結(jié)果顯示，感染了含有人糞便懸浮液的犢牛會(huì)發(fā)生輕度腹瀉，病毒在腸細(xì)胞中的復(fù)制可能伴隨著病毒的排放，近端小腸的病變與Newbury agent 2的病變相似，但程度較輕，這表明NoV可能在人與動(dòng)物之間進(jìn)行傳播。目前尚未在人糞便樣本中檢測(cè)到動(dòng)物諾如病毒，但人與動(dòng)物諾如病毒可能在某些條件或環(huán)境下混合存在，這就為動(dòng)物諾如病毒和人諾如病毒的重組提供了有利條件。重組是否會(huì)產(chǎn)生新的能夠在人和動(dòng)物之間傳播的諾如病毒仍未知，目前還無法排除諾如病毒的人畜共患傳播可能。人感染諾如病毒主要是通過受污染的食物或飲水以及人與人之間的傳播，是否可能通過動(dòng)物源性食物或與患病動(dòng)物接觸傳播仍不確定。

6 小結(jié)與展望

諾如病毒屬包含可感染人、豬、牛和小鼠等多種動(dòng)物的諾如病毒，因此存在人畜共患傳播的可能。通常，人畜共患病的傳播可以通過食物鏈間接發(fā)生，也可以通過動(dòng)物接觸直接發(fā)生。將動(dòng)物病毒傳播給人類可能會(huì)產(chǎn)生更嚴(yán)重的感染，如高致病性禽流感病毒(H5N1)、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS)冠狀病毒。如果諾如病毒具有人畜共患病傳播潛力，那么監(jiān)測(cè)新出現(xiàn)的病毒株并追蹤其毒力特征對(duì)于限制病毒傳播至關(guān)重要。目前尚無特定的抗諾如病毒治療藥物和疫苗，人和動(dòng)物諾如病毒的相關(guān)研究都面臨著重大挑戰(zhàn)。NOV的遺傳多樣性，新的突變體和重組體的周期性出現(xiàn)，對(duì)相關(guān)保護(hù)的知識(shí)有限，缺乏培養(yǎng)病毒的有效細(xì)胞系，以及缺乏易于使用和合適的動(dòng)物模型，這些問題給諾如病毒的進(jìn)一步研究都帶來巨大困難。BNoV作為腸道病原體的作用已在犢牛中得到證實(shí)，應(yīng)在犢牛腹瀉的鑒別診斷中對(duì)該病毒予以考慮。