豬肺炎支原體、豬圓環(huán)病毒2型和3型多重熒光定量PCR檢測方法的建立與初步應(yīng)用

肖 婷，何 穎，趙 碩，蔣家霞，陳忠偉，郭 旋，盧冰霞，林昌華，趙 武，秦毅斌，段群棚，全琛宇，許心婷，陳婷婷，許藝蘭，胡庭俊，張 寧,6*

(1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，廣西南寧 530001；3.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團新興有限公司，廣西柳州 545000；4.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團金光有限公司，廣西南寧 530042；5.廣西農(nóng)墾永新畜牧集團西江有限公司，廣西貴港 537100；6.廣西桂墾牧業(yè)有限公司，廣西南寧 530022)

豬支原體肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine,MPS)是由豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)引起的一種慢性呼吸道疾病，具有持續(xù)周期長、難治愈、易出現(xiàn)免疫抑制而誘發(fā)患病豬繼發(fā)感染其他病原[1]，如豬圓環(huán)病毒、多殺性巴氏桿菌和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等[2]，使病原感染的程度進一步嚴重，造成較高的病死率，導(dǎo)致養(yǎng)豬業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus，PCV)是圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬的一種呈球形、無囊膜的單股負鏈環(huán)狀DNA病毒，是目前已知的具有自主復(fù)制能力的最小的動物病毒[3]。PCV2(Porcine circovirus 2，PCV2)首次報道于1997年，能夠引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(Postweaning multisystemic wasting syndrom，PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(Porcine dermatitis nephropathy syndrome，PDNS)和繁殖障礙等豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(Porcine circovirus associated disease，PCVAD)[4]。2016年，PCV3(Porcine circovirus 3，PCV3)從患有PDNS、繁殖障礙的母豬和關(guān)節(jié)腫脹、消瘦等疾病的母豬或仔豬中分別被檢測到[5]。臨床上PCV2和PCV3常以混合感染的方式感染豬群，且癥狀相似，難以區(qū)分[6]。

近年對Mhp、PCV2和PCV3的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、分離培養(yǎng)等方法和普通PCR及熒光定量PCR等分子生物學(xué)方法[2,5]。這些方法主要存在耗時長、操作繁瑣、不能同時鑒別多種病原、敏感性較低及較難分離培養(yǎng)等問題[2,7]，不利于快速鑒別診斷日趨復(fù)雜的混合病原體感染。多重熒光定量PCR是一種具有較高特異性、靈敏性和精確性的實時定量檢測特定核酸的技術(shù)，可同時鑒別檢測多種病原，縮短檢測時間，降低檢測成本。Mhp、PCV2和PCV3感染均可引起呼吸系統(tǒng)疾病，且癥狀相似，臨床上很難直接區(qū)分這3種病原是單一感染還是混合感染。本文建立了可同時檢測Mhp、PCV2和PCV3的多重熒光定量PCR檢測方法，并以β-Actin作為內(nèi)參基因，為上述病原的臨床快速檢測以及流行病學(xué)調(diào)查奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、疫苗毒株及臨床樣品 本研究所用的豬肺炎支原體(J株)疫苗、PCV2、PCV3、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、偽狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus，PRV)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)、豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea，PEDV)、傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine，TGEV)、豬口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)及臨床表現(xiàn)呼吸道疫病癥狀的豬臨床病料樣品，均由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所病毒研究室于-80℃保存。

1.1.2 主要試劑 大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細胞、pMD18-T Vector、2×TaqMan Fast qPCR預(yù)混液,生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒,Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000,Takara生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒,OMEGA公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純級別試劑。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 QuantStudio 5實時熒光定量PCR儀,美國賽默飛公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-rad公司產(chǎn)品；電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；臺式高速離心機，德國Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物和探針合成 Mhp引物參照文獻[8]，根據(jù)GenBank收錄的PCV2、PCV3和β-Actin基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件針對保守序列區(qū)域設(shè)計特異性的引物及探針(表1)。引物及探針均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 Mhp、PCV2、PCV3和β-Actin的引物與探針序列

1.2.2 核酸提取 按照抽提試劑盒的操作說明抽提樣品核酸，所提取的核酸置-80℃保存?zhèn)溆?。使用同樣方法提取收集豬的組織臨床樣品核酸，置-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 陽性標準品構(gòu)建 對選定的Mhp、PCV2、PCV3和β-Actin的保守基因引物序列為：Mhp(F：5′-GCCTTGGTATGACTGGATCTC-3′，R：5′-CG CGAAATCCTGAGGATTTAG-3′)；PCV2(F：5′-CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3′，R：5′-ACCCCC GCCACCGCTACC-3′)；PCV3(F：5′-TTACTTAGAGAACGGACTTGTAACG-3′，R：5′-AAATGAGACACAGAGCTATATTCAG-3′)；β-Actin(F：5′-CTCCATCATGAAGTGCGACGT-3′，R：5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′)。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃終延伸10 min。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳試驗鑒定條帶大小正確后，將產(chǎn)物回收純化，連接pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞大腸埃希氏菌DH5α，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單菌落，篩選出陽性重組質(zhì)粒進行測序，測序正確的陽性重組質(zhì)粒作為標準品，分別命名為pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin，于-20℃保存?zhèn)溆?。根?jù)質(zhì)粒濃度計算出pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin的拷貝數(shù)分別為2.64×1010、6.66×109、2.56×1010、5.99×109copies/μL。

1.2.4 多重熒光定量PCR方法建立與優(yōu)化 在已建立的單項Mhp、PCV2、PCV3和β-Actin熒光定量PCR方法基礎(chǔ)上對20 μL反應(yīng)體系的混合引物和探針濃度及退火延伸溫度做進一步優(yōu)化，以篩選最適反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

1.2.5 標準曲線的建立 對pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin進行10倍倍比稀釋，按1.2.4優(yōu)化的反應(yīng)條件對各稀釋度的質(zhì)粒標準品進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后以Ct值為橫坐標、各重組質(zhì)粒起始拷貝數(shù)濃度的對數(shù)為縱坐標，繪制4個標準品的標準曲線。

1.2.6 特異性試驗 以PRV、PPV的DNA，PRRSV、CSFV、JEV、PEDV、TGEV、FMDV的cDNA為模板，以pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3為陽性對照，DEPC水為空白對照，用優(yōu)化的多重熒光定量PCR條件進行特異性試驗。

1.2.7 敏感性試驗 將pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin分別進行10倍倍比稀釋，按優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)條件進行試驗，同時進行普通PCR擴增，以確定該熒光定量PCR方法與常規(guī)PCR方法的敏感性差異。

1.2.8 重復(fù)性試驗 選取3個濃度的pMD18-T-Mhp(2.64×104copies/μL～2.64×106copies/μL)、pMD18-T-PCV2(6.67×104copies/μL～6.67×106copies/μL)、pMD18-T-PCV3(2.57×104copies/μL～2.57×106copies/μL)、pMD18-T-β-Actin(5.99×104copies/μL～5.99×106copies/μL)為模板，進行重復(fù)試驗，以評價該方法組內(nèi)和組間的重復(fù)性。

1.2.9 多重熒光定量PCR的臨床應(yīng)用 應(yīng)用建立的多重熒光定量PCR方法和普通PCR方法對本中心收集的101例豬臨床樣品進行檢測，設(shè)置pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin為陽性對照，DEPC水作為陰性對照，計算兩種方法的符合性。

2 結(jié)果

2.1 多重熒光定量PCR方法建立與優(yōu)化

完成退火溫度和引物探針配比優(yōu)化，確定本方法20 μL反應(yīng)體系：2×TaqMan Fast qPCR 10 μL，4條TaqMan探針各0.1 μL(10 μmol/L)，8條引物各0.25 μL(10 μmol/L)，核酸模板4 μL，DEPC水4.4 μL。 擴增參數(shù)：94℃ 3 min；94℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。

2.2 標準曲線的建立

對pMD18-T-Mhp定量檢測范圍為2.64×102copies/μL～2.64×107copies/μL，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9992。對pMD18-T-PCV2定量檢測范圍為6.67×102copies/μL～6.67×107copies/μL，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9981。對pMD18-T-PCV3定量檢測范圍為2.57×102copies/μL～2.57×107copies/μL，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9923。對pMD18-T-β-Actin定量檢測范圍為5.99×103copies/μL～5.99×107copies/μL，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.9951(圖1)。

A.pMD18-T-Mhp(2.64×102 copies/μL～2.64×107 copies/μL)標準曲線；B.pMD18-T-PCV2(6.67×102 copies/μL～6.67×107 copies/μL)標準曲線；C.pMD18-T-PCV3(2.57×102 copies/μL～2.57×107 copies/μL)標準曲線；D.pMD18-T-β-Actin(5.99×103 copies/μL～5.99×107 copies/μL)標準曲線

2.3 特異性試驗

用本研究建立的方法對PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PPV、PEDV、TGEV、FMDV等核酸進行特異性試驗。結(jié)果顯示，只有pMD18-T-Mhp模板在反應(yīng)后收集到“FAM”熒光信號，pMD18-T-PCV2模板在反應(yīng)后收集到“CY5”熒光信號，pMD18-T-PCV3模板在反應(yīng)后收集到“VIC”熒光信號，所有病原核酸在反應(yīng)后收集到“ROX”熒光信號，且隨著反應(yīng)進行，熒光信號不斷增強，均出現(xiàn)典型的“S”型擴增曲線；其他豬病病原核酸模板和空白對照在“FAM”、“VIC”和“CY5”通道均無擴增熒光曲線(圖2)。表明該方法特異性強，能準確鑒別檢測Mhp、PCV2和PCV3，檢測其他病原核酸無交叉反應(yīng)。

1.Mhp；2.PCV2；3.PCV3；4～11.PRRSV、CSFV、PRV、JEV、PPV、PEDV、TGEV、FMDV；12.陰性對照

2.4 敏感性試驗

用本研究建立的多重熒光定量PCR方法及普通PCR方法對經(jīng)10倍倍比稀釋的pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin標準品模板進行擴增。結(jié)果顯示，pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin標準品對應(yīng)的最低檢測拷貝數(shù)分別為26.4 copies/μL、66.7 copies/μL、25.6 copies/μL和5.99×103copies/μL，比相應(yīng)的常規(guī)PCR方法的敏感性分別提高了10 000倍、10 000倍、10 000倍和100倍(圖3～圖6)。

M.DNA標準DL 2 000; 1～8.重組質(zhì)粒濃度分別為2.64×107 copies/μL～2.64×100 copies/μL;N.陰性對照

M.DNA標準DL 2 000; 1～9重組質(zhì)粒濃度分別為6.67×108 copies/μL～6.67×100 copies/μL;N.陰性對照

M.DNA標準DL 2 000; 1～8.重組質(zhì)粒濃度分別為2.56×107 copies/μL～2.56×100 copies/μL;N.陰性對照

M.DNA標準DL 2 000; 1～8.重組質(zhì)粒濃度分別為5.99×107 copies/μL～5.99×100 copies/μL;N.陰性對照

2.5 重復(fù)性試驗

按照已優(yōu)化的反應(yīng)條件，選擇3個稀釋度的pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin標準品為模板進行測試。對每個稀釋度的模板分別進行3次批內(nèi)和批間重復(fù)檢測，結(jié)果顯示，不同濃度同一模板檢測結(jié)果的批內(nèi)和批間變異系數(shù)均在2%以內(nèi)(表2)，表明所建的熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，能夠滿足臨床檢測需要。

表2 多重熒光定量PCR重復(fù)性試驗結(jié)果

2.6 臨床樣本檢測結(jié)果

應(yīng)用建立的多重熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法，對實驗室收集滅活的101份豬臨床樣品進行檢測，分別以pMD18-T-Mhp、pMD18-T-PCV2、pMD18-T-PCV3和pMD18-T-β-Actin為陽性對照。結(jié)果顯示，檢出Mhp陽性21份，PCV2陽性37份，PCV3陽性34份，陽性率分別為20.8%、36.6%和33.7%。Mhp和PCV2、PCV3的混合感染樣品分別有14份和5份，PCV2和PCV3均呈陽性樣品有8份，有3份樣品檢測結(jié)果三者均呈陽性，陽性對照出現(xiàn)典型的擴增曲線，與普通PCR法檢測結(jié)果一致。

3 討論

隨著中國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；⒓s化發(fā)展，豬病的發(fā)生和流行對養(yǎng)豬生產(chǎn)的危害日趨加重，多病原混合感染已成為當前豬群疫病流行的主要形式與特點[9]。豬支原體肺炎一直被認為是最常見、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一，豬圓環(huán)病毒2型感染是全球公認的危害養(yǎng)豬業(yè)的重大經(jīng)濟影響性疾病，被稱為豬的“艾滋病”[10]，PCV3是一種新發(fā)豬病毒性傳染病病原，近年來在國內(nèi)外廣泛流行，嚴重影響我國甚至世界各國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[11]。 Mhp、PCV2和PCV3均可引起呼吸系統(tǒng)疾病，PCV2和Mhp的混合感染是豬呼吸道病綜合征主要的表現(xiàn)形式之一[12]。在山西省豬呼吸道疾病綜合征病原感染調(diào)查中發(fā)現(xiàn),Mhp與病毒混合感染的陽性率為74.7%，主要為Mhp+PCV3或Mhp+PCV2+PCV3混合感染，臨床上難以區(qū)分這3種病原是單一感染還是混合感染[13]。Mhp、PCV2和PCV3多重熒光PCR檢測方法的建立有利于臨床上對感染發(fā)病及處于亞臨床狀態(tài)生豬的早期診斷，早發(fā)現(xiàn)早治療能大大減少因Mhp、PCV2和PCV3暴發(fā)感染導(dǎo)致的豬場經(jīng)濟損失。

國內(nèi)外研究人員已建立了多種單病原或多病原熒光PCR檢測技術(shù)[5，14-16]，但尚未檢索到多重熒光定量PCR方法同時區(qū)分Mhp、PCV2和PCV3的報道。本研究為了解決Mhp、PCV2和PCV3感染后癥狀相似且常發(fā)生混合感染，不易鑒別的問題，選擇Mhp、PCV2和PCV3基因序列的保守區(qū)域，通過大量試驗篩選特異性的引物和探針，建立了以β-actin作為內(nèi)參基因鑒別檢測Mhp、PCV2和PCV3的多重熒光定量PCR方法。結(jié)果表明，本研究建立的多重熒光定量PCR方法可實現(xiàn)Mhp、PCV2和PCV3的鑒別檢測，其相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.999、0.998和0.992，檢測常見豬疫病病毒基因組無交叉反應(yīng)；應(yīng)用該方法最低可檢測到26.5 copies/μL(Mhp)、66.7 copies/μL(PCV2)和25.7 copies/μL(PCV3)的病毒核酸，靈敏度較高，其最低檢測限高于郭慧娟等[17]建立的PCV2TaqMan熒光定量PCR檢測方法的靈敏度，與吳江等[18]建立的PCV2、PCV3雙重熒光定量檢測方法靈敏度相當，Mhp引物與探針序列引用自武昱孜[8]，最低限度較其略高但差距不大，可能是試驗環(huán)境等差異導(dǎo)致，因此該方法可用于Mhp、PCV2和PCV3感染早期的病原鑒別檢測，實現(xiàn)Mhp、PCV2和PCV3同時定性、定量檢測，亦可應(yīng)用在Mhp、PCV2和PCV3在豬體內(nèi)不同組織器官中分布情況及病毒載量的研究。

將本研究建立的多重熒光定量PCR方法與普通PCR檢測方法進行符合率分析，所有臨床樣品的兩者檢測結(jié)果一致，與預(yù)期相符。在101個臨床樣品中，Mhp、PCV2和PCV3陽性病例較多，陽性率高達20.8%、36.6%和33.7%，Mhp和PCV2、PCV3的混合感染率分別為13.9%和4.9%，PCV2和PCV3的混合感染率為7.9%，樣品中共有3份樣品三者均呈陽性。說明疫苗的大規(guī)模推廣使用依然不能徹底控制這3種疫病的發(fā)生，三者之間相互都存在混合感染，意味著豬群感染Mhp、PCV2和PCV3的問題不應(yīng)該被忽視，在豬群中同時檢測和區(qū)分這3種病原是非常有必要的。本方法的建立為鑒別和監(jiān)測Mhp、PCV2和PCV3在豬群的感染情況提供了重要的技術(shù)手段。

本研究成功地建立了一種能同時檢測和鑒別Mhp、PCV2和PCV3的多重TaqMan熒光定量PCR方法，反應(yīng)時間約45min，可進行大批量樣品的快速檢測，大大縮短了檢測時間，提高了檢測效率。因為該方法在臨床樣品檢測中具有敏感、特異和準確等特點，適合于Mhp、PCV2和PCV3單獨或混合感染的早期診斷、疫病篩查及流行病學(xué)調(diào)查，以便及時采取防控措施，為控制Mhp、PCV2和PCV3感染提供了有效的技術(shù)支持。