小麥幼苗活性LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子篩選及其對非生物脅迫的響應(yīng)

周賓寒 楊 竹 王書平 方正武 胡贊民 徐兆師 張迎新,*

小麥幼苗活性LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子篩選及其對非生物脅迫的響應(yīng)

周賓寒1楊 竹1王書平1方正武1胡贊民2徐兆師3張迎新1,*

1長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院 / 主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖北荊州 434025;2中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所, 北京 100101;3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 農(nóng)作物基因資源與基因改良國家重大科學(xué)工程 / 農(nóng)業(yè)部麥類生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 北京 100081

LTR (長末端重復(fù), long terminal repeat)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子占小麥基因組的60%以上, 篩選小麥基因組中具有轉(zhuǎn)座活性的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子, 并分析其在非生物脅迫下的響應(yīng), 對研究反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在小麥抗逆境脅迫中的作用具有重要意義。本研究通過生物信息學(xué)分析, 從轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫(TREP database)中篩選出4個具有完整結(jié)構(gòu)的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Fatima、Wis、Angela和Babara; 同時利用實時熒光定量PCR (qRT-PCR)、甲基化特異PCR (methylmion specific PCR, MSP)和轉(zhuǎn)座子展示(transposon display, TD)技術(shù)分別分析了它們在鹽、ABA、H2O2和干旱等處理的小麥幼苗期(二葉一心)葉和根中的表達(dá)水平、甲基化水平和轉(zhuǎn)座活性變化。結(jié)果表明, 這4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在正常條件下均存在基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄, 并且能夠響應(yīng)上述4種脅迫而發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化, 且在相同脅迫條件下表達(dá)水平變化趨勢一致。Fatima、Angela和Babara在非生物脅迫處理下表達(dá)水平的提高與其甲基化水平的降低有關(guān), Wis則相反。反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LTR序列含有脅迫響應(yīng)順式作用元件, 但在非生物脅迫條件下順式作用元件對這4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的調(diào)控作用不顯著。與葉相比, 這4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在根中對脅迫的響應(yīng)程度更高, 且在鹽和ABA處理下轉(zhuǎn)座活性更強(qiáng)。本研究將有助于進(jìn)一步揭示LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對非生物脅迫的響應(yīng)規(guī)律, 為進(jìn)一步研究利用反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行小麥抗逆育種的遺傳改良積累資料。

小麥; 非生物脅迫; LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子; 相對表達(dá)水平; 轉(zhuǎn)座

轉(zhuǎn)座子元件(transposable elements, TEs)是真核生物基因組中數(shù)量最多、分布最廣泛的一類DNA元件, 對推動植物基因組進(jìn)化和提高植物抵抗環(huán)境脅迫能力具有重要的作用[1-5]。小麥(L.)是世界上最重要的糧食作物之一, 轉(zhuǎn)座子元件占其基因組80%以上[5]。發(fā)掘小麥基因組中的活性轉(zhuǎn)座子元件, 并研究其對環(huán)境脅迫的響應(yīng), 有助于進(jìn)一步解析活性轉(zhuǎn)座子元件在小麥基因組中的重要調(diào)控作用, 為利用轉(zhuǎn)座子元件提高小麥抵抗環(huán)境脅迫的能力提供理論基礎(chǔ)。

長末端重復(fù)(long terminal repeat, LTR)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是小麥基因組中數(shù)量最多的一類轉(zhuǎn)座子元件[6], 其序列由編碼序列及編碼序列兩側(cè)高度相似的LTR序列組成。兩側(cè)的LTR序列長度在100到幾百萬個堿基對之間, 不編碼任何蛋白質(zhì), 但含有反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座所需的啟動和終止序列, 對LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座的起始具有重要的作用; 編碼序列主要包含群特異性抗原(group specific antigen, GAG)和多聚酶(polyprotein, POL),基因編碼衣殼樣蛋白, 參與LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的成熟和包裝, 使其插入整合到基因組中,基因編碼反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座所必需的酶和蛋白, 主要包括反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase, RT)、核糖核酸酶H (RNaseH)和整合酶INT (Integrase)[7]。根據(jù)轉(zhuǎn)座機(jī)制和序列結(jié)構(gòu)特點, LTR類轉(zhuǎn)座子又可分為5個亞類: Ty1/copia、Ty3/gypsy、Bel-Pao、Retrovirales和ERV elements。其中Ty1/ copia和Ty3/gypsy是在生物界分布最廣, 數(shù)量最多的2個超家族, 兩者的區(qū)別在于INT的位置不同[8], Ty1/copia中POL蛋白的排列順序為5′-INT-RT- RH-3′, 而Ty3/gypsy為5′-RT-RH-INT-3′[7]。

轉(zhuǎn)座子元件在植物基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)座容易引起基因組重排、基因表達(dá)和結(jié)構(gòu)變化等變異, 進(jìn)而影響基因組的穩(wěn)定性和基因的正常功能[9], 為減弱轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座給基因組造成的危害, 植物基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)座子元件通常受甲基化等表觀遺傳調(diào)控的影響而處于沉默或失活狀態(tài)[10-11], 盡管如此, 具有潛在轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子元件在生物脅迫或非生物脅迫條件下仍可被激活, 并對提高宿主植物的抗性具有重要作用[4,9,12]。如: 燕麥中OARE-1被冠銹菌不親和小種侵染后高度激活, 在紫外線、茉莉酸和水楊酸等處理下其表達(dá)量會受到強(qiáng)烈誘導(dǎo), 使植物產(chǎn)生防御反應(yīng)[13]; 硬質(zhì)小麥中的Ttdla反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在鹽脅迫下通過結(jié)合啟動子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄增加其周圍基因的表達(dá)來響應(yīng)環(huán)境脅迫[14]; 擬南芥中的ONSEN反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子會在高溫脅迫下被激活[15]; 水稻在干旱脅迫下, INDITTO2轉(zhuǎn)座子能將生長素轉(zhuǎn)錄調(diào)控給鄰近的基因, 通過插入到啟動子區(qū)來緩解干旱壓力[16]。近期研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)座子元件在小麥A、B和D亞基因組中分別占序列的86%、85%和83%, 并以Gypsy和Copia超家族數(shù)量最多, 約占小麥基因組的67.5%[17-18], 其中Gypsy超家族中較為豐富的家族包括Sabrina、Fatima、Sumana/Sunmaya和WHAM, Copia超家族中較為豐富的家族為Angela[5]。從這些轉(zhuǎn)座子元件中篩選出具有轉(zhuǎn)座活性的轉(zhuǎn)座子元件, 并分析其在非生物脅迫下的轉(zhuǎn)座規(guī)律, 對進(jìn)一步解析轉(zhuǎn)座子元件在小麥基因組中的調(diào)控作用具有重要的指導(dǎo)意義。目前, 有關(guān)小麥轉(zhuǎn)座子元件的研究仍集中在轉(zhuǎn)座子元件序列的鑒定和篩選方面, 而其在非生物脅迫方面的研究較少。

因此, 本研究采用生物信息學(xué)方法, 從轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫TREP中篩選出了4個具有完整結(jié)構(gòu)的小麥LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子, 并采用熒光定量PCR、甲基化特異性PCR和轉(zhuǎn)座子展示技術(shù)分別對LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在不同非生物脅迫處理下小麥材料中的表達(dá)水平、甲基化水平和轉(zhuǎn)座活性進(jìn)行了分析, 為利用活性轉(zhuǎn)座子元件進(jìn)行小麥品種的抗逆遺傳改良積累資料。

1 材料與方法

1.1 轉(zhuǎn)座子元件的篩選

從轉(zhuǎn)座子數(shù)據(jù)庫TREP (http://botserv2.uzh. ch/kelldata/trep-db/index.html)中下載小麥轉(zhuǎn)座子元件全部序列, 經(jīng)DNAMAN軟件比對分析轉(zhuǎn)座子元件LTR序列, 利用在線軟件Softberry (http://www. softberry.com/)對具有完整LTR序列的轉(zhuǎn)座子元件進(jìn)行編碼序列分析, 再通過NCBI數(shù)據(jù)庫對其編碼序列進(jìn)行BLASTP分析, 參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置。選取具有完整編碼序列, 且5′LTR和3′LTR序列一致的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子進(jìn)行后續(xù)分析。

1.2 材料與處理

以弱春性、綜合抗性較好的小麥品種鄭麥9023為試驗材料, 將其種子經(jīng)15%次氯酸鈉消毒處理5 min, 蒸餾水沖洗3次, 置于無菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng), 待發(fā)芽后移入水培盒中, 并置于溫度(25±1)℃, 濕度(70±5)%, 12 h光照和黑暗交替的人工氣候箱中培養(yǎng)。待植株處于二葉一心時, 分別用0.1 mol L–1NaCl、0.2 mmol L–1ABA、0.1 mmol L–1H2O2及15% PEG進(jìn)行脅迫處理[19-20]。脅迫處理設(shè)置4個持續(xù)時間, 分別為6、12、24和48 h, 以相同時間點正常生長條件下的植株為對照, 設(shè)置3個重復(fù)。4℃分別收集葉和根經(jīng)液氮速凍后, –80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 總RNA提取、cDNA合成和實時熒光定量PCR

采用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)分別提取小麥葉和根的總RNA, 采用PrimeScript IV 1st strand cDNA Synthesis Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)獲得cDNA。

利用軟件Primer 3和Primer Premier 6設(shè)計熒光定量引物, 具體引物序列見表1, 其中為內(nèi)參基因[21]。在CFX Connect PCR系統(tǒng)(Bio-Rad)上進(jìn)行qPCR。20 μL PCR反應(yīng)體系為: 2× Green qPCR MasterMix10 μL, cDNA 2 μL, 10 μmol L–1引物1 μL和ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序為: 95℃預(yù)變性2 min; 95℃變性15 s, 55℃退火30 s, 循環(huán)40次。每個處理3個生物學(xué)重復(fù), 采用2–ΔΔCT方法[22]計算基因的相對表達(dá)量, 并用Prism軟件進(jìn)行作圖分析。

1.4 順式作用元件分析

通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)對4個轉(zhuǎn)座子LTR區(qū)進(jìn)行順式作用元件分析, 篩選出與脅迫相關(guān)的順式作用元件。

1.5 甲基化特異性PCR (Methylation-specific PCR, MSP)

利用MethPrimer (https://www.urogene.org/cgi- bin/methprimer/methprimer.cgi)設(shè)計MSP引物(表2), 以重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化不同處理基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。20 μL PCR反應(yīng)體系: 2× FastPremix 10 μL, DNA 1 μL, 10 μmol引物1 μL和ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循環(huán)35次; 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。經(jīng)ImagJ軟件對電泳條帶面積進(jìn)行灰度值轉(zhuǎn)換, 并利用TBtools軟件生成熱圖分析。

表1 熒光定量引物序列

表2 甲基化分析引物序列

1.6 基因組DNA提取以及轉(zhuǎn)座子展示技術(shù)(Transposon Display, TD)

采用改良后的CTAB法[23]提取基因組DNA, 分別將小麥幼苗的葉和根研磨成粉后加入65℃預(yù)熱的CTAB提取緩沖液, 置于65℃水浴中每隔15 min顛倒混勻重復(fù)2次, 待冷卻后加入氯仿異戊醇混合液(24∶1)并離心, 上清液加入異丙醇混勻后于–20℃冰箱靜置20 min, 沉淀經(jīng)75%乙醇漂洗2次, 室溫干燥后加入適量TE緩沖液溶解DNA, 于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

利用轉(zhuǎn)座子展示技術(shù)[24]分析轉(zhuǎn)座子元件在非生物脅迫處理條件下的活性, 基因組DNA經(jīng)I酶切及接頭復(fù)性后, 通過T4連接酶與酶切產(chǎn)物相連接, 連接產(chǎn)物稀釋10倍, 再進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增。25 μL預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系: 10×buffer 5 μL, dNTP 4 μL, DNA 1 μL, 10 μmol L–1M-0和TE-1引物各1 μL, ddH2O 13 μL。擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循環(huán)30次; 最后72℃延伸10 min。根據(jù)檢測結(jié)果, 將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋后進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。20 μL選擇性擴(kuò)增反應(yīng)體系: 2× FastPremix 10 μL, DNA 1 μL, 10 μmol L–1M-1和TE-2引物各0.5 μL和ddH2O 8 μL。擴(kuò)增程序為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循環(huán)35次; 最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離檢測。接頭序列為MAdapter-top: 5′-GACGATGAGTCCTGAG- 3′, MAdapter-bottom: 5′-TACTCAGGACTCAT-3′, 引物序列見表3。

1.7 統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 利用GraphPad Prism 6.02進(jìn)行差異性顯著分析, 并用Adobe Illustrator 2020作圖。統(tǒng)計結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

表3 轉(zhuǎn)座子展示分析引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子篩選

具有完整結(jié)構(gòu)和一致的LTR序列是LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能夠進(jìn)行轉(zhuǎn)座的前提[25]。本研究通過生物信息學(xué)分析, 共篩選得到4個符合條件的小麥LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子序列: Fatima、Wis、Angela和Babara (圖1)。其中Fatima屬于Ty3/gypsy類, Wis、Angela和Babara均屬于Ty1/copia類。這4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的5′LTR和3′LTR均具有極高的同源性, 其中Fatima的LTR序列的長度為475 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性為95.58%; Wis的LTR序列的長度為1608 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性為96.84%; Angela的LTR序列的長度為1732 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性為97.75%; Babara的LTR序列的長度為1672 bp, 5′LTR和3′LTR的同源性為98.68%。進(jìn)一步對編碼序列進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)Fatima能夠編碼其轉(zhuǎn)錄所需的蛋白和酶, 但其缺少編碼衣殼蛋白所需的GAG序列, 而Wis、Angela和Babara均能編碼其轉(zhuǎn)座所需的包括GAG在內(nèi)的蛋白和酶(圖1)。

圖1 小麥中4個LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)分析

GAG: 群特異性抗原; AP: 天冬氨酸酶; INT: 整合酶; RT: 反轉(zhuǎn)錄酶; RH:核糖核酸酶H。

GAG: group specific antigen; AP:aspartic proteases; INT: integrase; RT: the reverse transcriptase; RH: RNaseH.

2.2 不同脅迫處理下小麥葉和根中轉(zhuǎn)座子元件的表達(dá)水平分析

采用qRT-PCR分析了4個轉(zhuǎn)座子在不同非生物脅迫處理下的表達(dá)模式。由圖2可知, 不同轉(zhuǎn)座子元件在相同組織和非生物脅迫處理條件下均有不同程度的表達(dá), 相同轉(zhuǎn)座子元件在不同組織和非生物脅迫處理條件下表達(dá)程度也均有不同。

經(jīng)差異顯著性分析發(fā)現(xiàn), Fatima分別在12 h的H2O2脅迫處理和干旱脅迫處理的葉中極顯著上調(diào)表達(dá), 在24 h的H2O2脅迫處理和48 h的鹽脅迫處理的葉中顯著上調(diào)表達(dá), 以及在48 h的H2O2脅迫處理下葉和根中極顯著上調(diào)表達(dá), 分別是對照組的93.70倍(12 h, H2O2脅迫, 葉)、185.85倍(12 h, 干旱脅迫, 葉)、22.22倍(24 h, H2O2脅迫, 葉)、27.32倍(48 h, 鹽脅迫, 葉)、364.13倍(48 h, H2O2脅迫, 葉)和173,793.80倍(48 h, H2O2脅迫, 根); 但在ABA脅迫處理的葉和根均與對照組無顯著差異(圖2-A)。而Wis僅在24 h的鹽脅迫處理的葉和48 h的H2O2脅迫處理的根中均極顯著上調(diào)表達(dá), 分別是對照組的9824.77倍和1,074,992.00倍; 在ABA脅迫和干旱脅迫處理的葉和根均與對照組無顯著差異(圖2-B)。同時, Angela在H2O2脅迫處理12 h、24 h、48 h的葉和48 h的根中以及在干旱脅迫處理12 h的葉中均呈現(xiàn)極顯著上調(diào)表達(dá), 分別是對照組的414.13倍(12 h, H2O2脅迫, 葉)、82.23倍(24 h, H2O2脅迫, 葉)、882.48倍(48 h, H2O2脅迫, 葉)、131,046.20倍(48 h, H2O2脅迫, 根)和113.92倍(12 h, 干旱脅迫, 葉); 而在鹽脅迫處理和ABA脅迫處理的葉和根均與對照組無顯著差異(圖2-C)。此外, Babara僅在H2O2脅迫處理12 h和48 h的葉以及24 h和48 h的根中呈現(xiàn)顯著或極顯著上調(diào)表達(dá), 其表達(dá)量分別是對照組的179.44倍(12 h, 葉, 極顯著)、2274.01 (48 h, 葉, 極顯著)、85,246.49倍(24 h, 根, 顯著)、487,726.95倍(48 h, 根, 極顯著); 而在鹽脅迫處理、ABA脅迫處理和干旱脅迫處理的葉和根均與對照組無顯著差異(圖2-D)。

(圖2)

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; Mock: 對照。采用Tukey法進(jìn)行檢驗, *表示在0.05概率水平差異顯著; **表示在0.01概率水平差異顯著; ***表示在0.001概率水平差異顯著。

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; Mock: control. Tukey method is used to test, *, **, and *** indicate significantly different at< 0.05,< 0.01, and< 0.001, respectively.

2.3 轉(zhuǎn)座子順式作用元件分析

為了進(jìn)一步解析這4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子對上述脅迫的差異性響應(yīng)是否受其LTR區(qū)攜帶的順式作用元件影響, 本研究對其LTR序列分別進(jìn)行了順式作用元件分析(表4)。含有厭氧反應(yīng)相關(guān)順式作用元件ARE和光響應(yīng)相關(guān)元件Box4;含有ABA響應(yīng)相關(guān)順式作用元件ABRE、干旱脅迫響應(yīng)元件MYC、光響應(yīng)元件ACE、G-Box和G-box以及厭氧反應(yīng)相關(guān)順式作用元件ARE;含有ABA響應(yīng)相關(guān)順式作用元件DRE1和LTRE、干旱響應(yīng)相關(guān)順式作用元件MYC和LTRE、光響應(yīng)相關(guān)順式作用元件G-box、厭氧反應(yīng)相關(guān)順式作用元件GC-motif以及低溫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件LTR;含有ABA響應(yīng)相關(guān)順式作用元件ABRE和DRE1、干旱響應(yīng)相關(guān)順式作用元件MYC、光響應(yīng)相關(guān)順式作用元件G-Box、厭氧反應(yīng)相關(guān)順式作用元件ARE、低溫響應(yīng)相關(guān)順式作用元件LTR以及赤霉素反應(yīng)相關(guān)順式作用元件TATC-box。

表4 小麥反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中脅迫應(yīng)答相關(guān)順式作用元件分析

2.4 不同脅迫處理下轉(zhuǎn)座子元件的甲基化水平分析

LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的5'LTR序列含有啟動反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄的序列, 該區(qū)域甲基化水平的變化決定了該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子能否正常轉(zhuǎn)錄。為檢測脅迫處理條件下反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化水平是否受到影響, 本研究通過MSP技術(shù)分別對Fatima、Wis、Angela和Babara在LTR序列區(qū)的甲基化水平進(jìn)行了分析(圖3)。發(fā)現(xiàn)不同轉(zhuǎn)座子元件甲基化水平在相同組織和非生物脅迫處理條件下均有不同程度變化, 同一轉(zhuǎn)座子元件在不同組織和非生物脅迫處理條件下甲基化水平也不同。

Fatima甲基化水平在鹽脅迫和干旱脅迫處理6 h的葉中均顯著降低, 分別較對照組降低了24.47% (鹽脅迫)和34.14% (干旱脅迫); 在H2O2脅迫處理12 h的葉和干旱脅迫處理24 h的根中均顯著升高, 分別較對照組增加了24.97% (12 h, H2O2脅迫, 葉)和235.59% (24 h, 干旱脅迫, 根)。

Wis甲基化水平在鹽脅迫處理12 h和48 h的根中、ABA脅迫處理48 h的葉和24 h的根中以及干旱脅迫處理48 h的根中均顯著升高, 分別是對照組的1.72倍(12 h, 鹽脅迫, 根)、3.00倍(48 h, 鹽脅迫, 根)、1.30倍(48 h, ABA脅迫, 葉)、2.63倍(24 h, ABA脅迫, 根)和2.28倍(48 h, 干旱脅迫, 根); 而在鹽脅迫處理和干旱脅迫處理的葉中及在H2O2脅迫處理的葉和根中均與對照組無顯著差異(圖3-B)。

Angela甲基化水平在48 h鹽脅迫處理和ABA脅迫處理的葉及H2O2脅迫處理的根中均顯著降低, 分別較對照組降低了42.99% (鹽脅迫, 葉)、38.15% (ABA脅迫, 葉)、36.93% (H2O2脅迫, 根); 在H2O2脅迫處理48 h的葉中和4種脅迫處理24 h的根中則顯著升高, 較對照組分別增加了23.45% (48 h, H2O2脅迫, 葉)、110.89% (24 h, 鹽脅迫, 根)、160.72% (24 h, ABA脅迫, 根)、181.34% (24 h, H2O2脅迫, 根)和79.31% (24 h, 干旱脅迫, 根); 而在干旱脅迫處理的葉中與對照組無顯著差異(圖3-C)。

圖3 不同非生物脅迫下小麥幼苗葉和根中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化程度比較分析

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; m: marker; M: 甲基化條帶; U: 去甲基化條帶。

A: Fatima; B: Wis; C: Angela; D: Babara; m: marker; M: methylation band; U: demethylation band.

Babara甲基化水平在鹽脅迫處理24 h的葉和根中以及干旱脅迫處理的12 h葉和24 h根中均顯著升高, 分別是對照組的1.80倍(24 h, 鹽脅迫, 葉)、1.64倍(24 h, 鹽脅迫, 根)、1.37倍(12 h, 干旱脅迫, 葉)和1.26倍(24 h, 干旱脅迫, 根); 在4種脅迫處理48 h的根中均顯著降低, 分別是對照組的0.68倍(鹽脅迫)、0.49倍(ABA脅迫)、0.47倍(H2O2脅迫)和0.68倍(干旱脅迫)。而在ABA脅迫處理和H2O2脅迫處理的葉中與對照組無顯著差異(圖3-D)。

2.5 不同脅迫處理下轉(zhuǎn)座子元件的轉(zhuǎn)座活性分析

為了進(jìn)一步驗證在脅迫處理條件下轉(zhuǎn)座子元件是否發(fā)生了轉(zhuǎn)座, 本研究以處理48 h的小麥幼苗葉和根為供試材料, 采用轉(zhuǎn)座子展示技術(shù)對這4個反轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)座插入位點進(jìn)行了檢測, 發(fā)現(xiàn)不同反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在相同處理條件下轉(zhuǎn)座活性不同, 同一反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在不同脅迫處理條件下轉(zhuǎn)座活性也有差別。

Fatima在H2O2脅迫處理的葉中存在2個新的轉(zhuǎn)座位點, 在ABA脅迫處理和干旱脅迫處理的根中分別存在3個和1個新的轉(zhuǎn)座位點(圖4)。Wis在H2O2脅迫處理的葉中存在3個新的轉(zhuǎn)座位點, 在ABA脅迫處理、鹽脅迫處理和干旱脅迫處理的根中分別存在3個、1個和1個新的轉(zhuǎn)座位點(圖4)。Angela在H2O2脅迫處理和干旱脅迫處理條件下各有1個新的轉(zhuǎn)座位點, 而在H2O2脅迫處理的根中存在3個新的轉(zhuǎn)座位點(圖5)。此外, Babara在ABA脅迫處理和H2O2脅迫處理的葉中分別存在2個和3個新的轉(zhuǎn)座位點, 在鹽脅迫處理、ABA脅迫處理、H2O2脅迫處理和干旱脅迫處理的根中分別存在58個、41個、5個、13個新的轉(zhuǎn)座位點(圖5)。

3 討論

LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子是植物基因組中分布最為廣泛的一類轉(zhuǎn)座子, 本研究通過生物信息學(xué)分析篩選出的4個具有潛在轉(zhuǎn)座活性的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件(Fatima、Wis、Angela和Babara), 且其均具有高度同源的5′LTR和3′LTR序列, 由此說明這4個轉(zhuǎn)座子在小麥基因組進(jìn)化過程中變異性較小, 插入基因組中的時間較晚, 保留轉(zhuǎn)座活性的可能性大。此外, Wicker等[5]通過全基因分析, 發(fā)現(xiàn)Fatima含有5個亞家族, 均無完整的結(jié)構(gòu)。本研究所鑒定的Fatima反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子缺少編碼衣殼蛋白的GAG序列, 但其仍具有轉(zhuǎn)座活性, 說明該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子雖然不具備自主插入到基因組中的能力, 但能夠借助同家族其他成員編碼的GAG蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)座。

植物基因組內(nèi), 低活性或沉默的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可響應(yīng)生物或非生物脅迫而發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的變化, 并進(jìn)行轉(zhuǎn)座[32-33]。在本研究中, 通過轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)4個LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在正常條件存在基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄, 短時間的脅迫處理會引起其轉(zhuǎn)錄水平的變化, 但促進(jìn)其上調(diào)表達(dá)作用不顯著(圖2), 說明在一定的脅迫條件下, 特別是短時間的環(huán)境脅迫下, 植物體可通過表觀遺傳調(diào)控體系和其他保護(hù)體系使轉(zhuǎn)座子元件維持在可控制的范圍, 避免因轉(zhuǎn)座子元件大量轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)座而造成基因組損傷和不穩(wěn)定。在本研究中, 與鹽脅迫、ABA脅迫和干旱脅迫相比, H2O2脅迫處理材料中4個LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄水平均幾乎全部高于對照和其他脅迫處理, 研究已表明, H2O2處理可提高細(xì)胞內(nèi)的超氧陰離子自由基的含量, 進(jìn)而破壞細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡, 影響細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性[34]。因此, 本研究進(jìn)一步證明了穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境對抑制轉(zhuǎn)座子元件轉(zhuǎn)座的重要性, 當(dāng)環(huán)境脅迫對植物的影響超過其承受能力, 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性受到影響時, 植物基因組對轉(zhuǎn)座子元件的抑制作用減弱, 轉(zhuǎn)座子元件發(fā)生轉(zhuǎn)座的機(jī)會增加。此外, 在Wis、Angela和Babara的5'LTR中雖然含有ABA和干旱響應(yīng)順式作用元件(表4), 但通過轉(zhuǎn)錄水平分析發(fā)現(xiàn)含有順式作用元件的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子并不能響應(yīng)其相應(yīng)的環(huán)境脅迫而上調(diào)表達(dá)(圖2), 反而在同一脅迫下, 隨著處理時間的延長, 其表達(dá)量變化趨勢基本一致(圖2), 這也進(jìn)一步印證了反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在環(huán)境脅迫下的轉(zhuǎn)座與其LTR序列中順式作用元件關(guān)系不強(qiáng)。LTR序列中的順式作用元件對反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座具體有何作用, 以及不同的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在同一環(huán)境脅迫下的轉(zhuǎn)錄是否具有協(xié)同性仍有待進(jìn)一步驗證。

DNA甲基化是調(diào)控轉(zhuǎn)座子元件轉(zhuǎn)座的主要方式, 甲基化水平的降低可提高轉(zhuǎn)座子元件的轉(zhuǎn)錄水平[35], 在本研究中, Fatima、Angela和Babara在表達(dá)量顯著提高的材料中的甲基化水平均有不同程度的下降(圖3), 由此說明在脅迫處理條件下可降低這3條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的甲基化水平, 進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)座子元件的轉(zhuǎn)錄。此外, 與Angela、Babara和Fatima不同, Wis在表達(dá)量上顯著上調(diào)的材料中的甲基化水平反而升高(圖3), 這可能與其插入到功能基因附近有關(guān)[36-39]。

圖4 小麥幼苗葉和根中Fatima和Wis轉(zhuǎn)座活性分析

M: marker; 1, 5: 鹽脅迫; 2, 6: ABA脅迫; 3, 7: H2O2脅迫; 4, 8: 干旱脅迫。圖中箭頭指示新的轉(zhuǎn)座插入位點, AA、AT、TT、CG、GG、AC、AG、CA、CT、GT、TC、TG、TA、CC、GC和GA分別表示擴(kuò)增引物的最后2個堿基。

M: marker; 1, 5: the salt stress treatment. 2, 6: ABA stress treatment. 3, 7: H2O2stress treatment. 4, 8: the drought stress treatment. The bands labelled by black arrows indicate new transposition sites in wheat genome. AA, AT, TT, CG, GG, AC, AG, CA, CT, GT, TC, TG, TA, CC, GC, and GA represent the last two bases of the amplication primers used in TD, respectively.

圖5 小麥幼苗葉和根中Angela和Babara轉(zhuǎn)座活性分析

M: marker; 1, 5: 鹽脅迫; 2, 6: ABA脅迫; 3, 7: H2O2脅迫; 4, 8: 干旱脅迫。圖中箭頭指示新的轉(zhuǎn)座插入位點, AA、AT、TT、CG、GG、AC、AG、CA、CT、GT、TC、TG、TA、CC、GC和GA分別表示擴(kuò)增引物的最后2個堿基。

M: marker; 1, 5: the salt stress treatment. 2, 6: ABA stress treatment. 3, 7: H2O2stress treatment. 4, 8: the drought stress treatment. The bands labelled by black arrows indicate new transposition sites in wheat genome. AA, AT, TT, CG, GG, AC, AG, CA, CT, GT, TC, TG, TA, CC, GC, and GA represent the last two bases of the amplication primers used in TD, respectively.

轉(zhuǎn)座子元件在植物基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)座活性受其結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)座方式的影響[40]。在這4個LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中, Fatima轉(zhuǎn)座活性最低, 這可能與其缺少編碼衣殼蛋白的GAG序列有關(guān)(圖1); 而Wis和Angela兩條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在序列、結(jié)構(gòu)和長度極為相似[41-42], 因此在本研究中轉(zhuǎn)座活性也相近(圖4和圖5); 盡管Babara在小麥基因組中的拷貝數(shù)遠(yuǎn)低于其他3條反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[43], 但其轉(zhuǎn)座活性最高, 這說明反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在非生物脅迫條件下的轉(zhuǎn)座活性不受其在基因組內(nèi)的拷貝數(shù)的影響。此外, 研究表明LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在插入到基因組新的位置之前, 會將其RNA轉(zhuǎn)化為染色體外環(huán)狀DNA (extrachromosomal circular DNA, eccDNA)[44-45], 本研究在4種非生物脅迫中, 這4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在鹽脅迫和ABA脅迫處理條件下的轉(zhuǎn)座活性最高(圖4和圖5), 但表達(dá)水平分析的結(jié)果則表明其對H2O2處理的響應(yīng)程度最高(圖2)。這是否與其在鹽脅迫和ABA脅迫處理條件下形成了大量的eccDNA有關(guān), 將有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究篩選出4個具有轉(zhuǎn)座活性的LTR反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Fatima、Wis、Angela和Babara, 且均具有高度一致的5′LTR和3′LTR序列, 在正常條件下均存在基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄; 而在非生物脅迫條件下4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄水平的變化趨勢一致, LTR序列中的脅迫響應(yīng)順式作用元件對其調(diào)控作用并不顯著, 其中, Fatima、Angela和Babara轉(zhuǎn)錄水平的提高與其甲基化程度降低有關(guān), 而Wis則相反; 同時, 4個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在非生物脅迫條件下均可產(chǎn)生新的轉(zhuǎn)座位點, 且在根中轉(zhuǎn)座位點多于葉中。

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Screening of active LTR retrotransposons in wheat (L.) seedlings and analysis of their responses to abiotic stresses

ZHOU Bin-Han1, YANG Zhu1, WANG Shu-Ping1, FANG Zheng-Wu1, HU Zan-Min2, XU Zhao-Shi3, and ZHANG Ying-Xin1,*

1College of Agriculture, Yangtze University, Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry, Jingzhou 434025, Hubei, China;2Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;3Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Triticeae Crops, Ministry of Agriculture, Beijing 100081, China

LTR (long terminal repeat) retrotransposable elements account for more than 60% of rye genome. It is of great significance to screen active LTR retrotransposons from wheat genome and analyze their transposition, the relative expression levels, and methylation levels under abiotic stress in exploring the role of retrotransposable elements in improving wheat anti-stress abi-lity. Four active LTR retrotransposons (Fatima, Wis, Angela, and Babara) with complete structure were selected from the TREP database by bioinformatics analysis. The relative expression levels, methylation dynamics, and transposition activity of the four LTR retrotransposons were then analyzed at seedling stage (two leaves with one heart) leaves and roots of the stress-treated (NaCl, ABA, H2O2,and PEG) wheat seedlings by qRT-PCR, methylation-specific polymerase chain reaction (MSP), and transposon display method. The results suggested that the four retrotransposons had basic transcription activity under normal conditions, which could be changed under stress conditions, and their variation tendency was similar in the same stress conditions. The up-regulation of Fatima, Angela, and Babara was due to their down-regulated methylation levels, while Wis was opposite. The 3′LTR of LTR retrotransposons contained many stress-responsive-elements, but the regulatory effect of which were not obvious under stress treatments. Compared with that in leaves, the four LTR retrotransposons in roots were more sensitive to stresses and had higher transposition activity. This study will help to further reveal the response regularity of LTR retrotransposons under stress conditions and accumulate data for improving of stress resistance breeding wheat by using transposable elements.

wheat (L.); abiotic stress; LTR retrotransposons; the relative expression level; transposition

10.3724/SP.J.1006.2023.21023

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100800), 國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(2018ZX0800909B), 湖北省重點研發(fā)計劃項目(2022BBA0035)和湖北省科學(xué)技術(shù)重大創(chuàng)新專項(2018ABA085)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Programs of China (2017YFD0100800), the National Major Project for Developing New GM Crops (2018ZX0800909B), the Key Research and Development Program of Hubei Province (2022BBA0035), and the Major Project for Special Technology Innovation of Hubei Province (2018ABA085).

張迎新, E-mail: zhangyingxin1985@126.com

E-mail: z18171732900@126.com

2022-03-29;

2022-07-21;

2022-08-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1727.015.html

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