基于BSA-seq技術對豌豆花色基因的精細定位

嚴 昕 項 超 劉 榮 李 冠 李孟偉 李正麗 宗緒曉,* 楊 濤,*

基于BSA-seq技術對豌豆花色基因的精細定位

嚴 昕1,**項 超2,**劉 榮1李 冠1李孟偉1李正麗3宗緒曉1,*楊 濤1,*

1中國農業(yè)科學院作物科學研究所, 北京 100081;2四川省農業(yè)科學院作物科學所, 四川成都 610066;3貴州省農業(yè)科學院園藝研究所, 貴州貴陽 550006

BSA-seq技術在挖掘農藝性狀相關的新基因中已被廣泛應用, 隨著豌豆首個參考基因組問世, 將BSA-seq技術結合豌豆基因組的基因定位策略勢在必行。本研究利用紫花親本G0004562、白花親本G0002930以及F2群體, 通過BSA-seq技術對豌豆花色基因進行初步定位, 獲得31.42 Mb定位區(qū)間, 再通過設計InDel分子標記分析進一步縮小定位區(qū)間, 最終將目標基因定位在包含19個基因的0.99 Mb區(qū)間內, 通過基因注釋信息推測出為豌豆花色候選基因。本研究結果驗證了BSA-seq技術快速高效定位豌豆花色基因的可行性, 為利用該技術挖掘豌豆其他重要農藝性狀相關基因奠定了基礎。

豌豆; BSA-seq; InDel; 基因定位

豌豆(L., 2=2=14)是我國第一大食用豆類作物[1], 在我國的主要產區(qū)是西南地區(qū)、長三角地區(qū)和兩湖地區(qū)。由于其蛋白質含量高、可獲得性好、生產成本低, 豌豆已經成為食品熱門領域植物基蛋白開發(fā)中最受歡迎的原料之一。據FAO最新統(tǒng)計, 全球鮮豌豆的栽培面積、總產量分別占全球的55.32%和56.63%[2]。同時豌豆具有生物固氮作用, 是我國調整種植業(yè)結構的重要經濟作物[3]。

目前豌豆中大部分基因定位都是通過同源克隆或基于構建遺傳圖譜的QTL定位獲得。同源克隆利用基因在進化過程中的保守性實現基因的精細定位,未完成測序或缺少轉錄信息的物種可以利用基因的保守區(qū)域通過基因信息較多的物種研究或克隆該基因, 如豌豆的抗白粉病的基因[4]控制開花信號的基因[5], 調控開花和花序發(fā)育的基因[6]。利用模式植物蒺藜苜蓿的參考基因組, 可以為豌豆后續(xù)精細作圖、功能分析以及基因克隆等提供參考信息, 但是進行基因圖位克隆會存在一定的風險性和不準確性, 并且豌豆基因組中大約有54%的序列在蒺藜苜?；蚪M內無法找到同源的片段。QTL定位是通過分子標記與數量性狀表型值之間的關系, 檢測數量性狀位點的存在, 并利用多種作圖方法繪制遺傳連鎖圖譜[7-9], 確定某一數量性狀的數目、位置、遺傳效應等, 如Wu等[10]利用13.2 K SNP陣列和SSR標記通過QTL作圖確定了8個與豌豆根腐病抗性相關的主效QTL, Aznar-Fernández等[11]整合出平均標記密度為0.38 cM遺傳連鎖圖譜, 確定了與豌豆象抗性相關的3個QTL。QTL定位優(yōu)點是不需要完成物種參考基因組測序也能將基因定位在連鎖群上, 通常構建一個群體可以同時實現多個主效或微效數量性狀基因的定位。但是QTL定位的準確性容易受環(huán)境以及開發(fā)的標記是否具有多態(tài)性等影響, 同時RIL群體和NIL群體作為QTL定位的首選材料, 其構建群體又需要的時間相對較長, 整個過程費時費力, 是一項勞動密集且成本較高的工作。另外, 對于QTL的精細定位, 須開發(fā)另一個數千系的大型群體, 在目標區(qū)域產生足夠的重組體, 以進行進一步的精細定位。

近年來隨著越來越多的物種完成了全基因組測序, 以及高通量測序技術的迭代與發(fā)展, 推進了BSA-seq技術的應用, 先后衍生出了Mutmap、QTL- seq、RAD-seq和SLAF-seq技術。BSA-seq的應用從模式物種拓展到了非模式物種, 此外, BSA與RNA結合的BSR-seq技術也能應用于一些未獲得參考基因組的物種進行基因定位。BSA-seq技術在挖掘重要農藝性狀基因的研究中越來越廣泛, 在許多作物中得到廣泛的應用, 如水稻定位耐冷候選基因[12]、大豆定位株高和主莖節(jié)數候選基因[13]和黃瓜定位抗靜脈黃化病毒候選基因[14]。目前, BSA-seq技術在豌豆中的報道較少, 2018年, Zheng等[15]利用SLAF測序, QTL定位與BSA相結合, 在未獲得參考基因組的情況下, 利用水稻的參考基因組與獲得的reads進行比對, 檢測到2個與葉形性狀相關的QTL。

豌豆的基因組較大(約為4.45 Gb), 國內外研究團隊較少, 導致豌豆基因組研究有所滯后。2019年, 豌豆首個參考基因組的發(fā)布[16], 使得克隆重要農藝性狀基因進行基因功能研究變得具有可操作性。本研究以豌豆G0002930、G0004562及其雜交后代, 利用BSA-seq技術與豌豆參考基因組對比并設計InDel分子標記, 驗證BSA-seq技術在快速高效定位豌豆花色基因中的可行性, 期望能為豌豆其他基因的精細定位提供思路與參考, 加速豌豆其他重要農藝性狀如抗病、抗蟲等基因的挖掘, 促進豌豆育種發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料來源

試驗材料由國家作物種質庫提供: 母本G0002930, 白花, 來源于美國; 父本G0004562, 紫花, 來源于中國西藏。

1.2 研究群體的構建

1.2.1 雜交后代群體的構建與基因組DNA的提取

以G0002930為母本、G0004562為父本雜交, 獲得F1代籽粒, 2019年春季在河北省張家口市沽源縣播種F1代, 夏季收獲F2種子, 2019—2020年冬季在北京昌平溫室種植F2代, 并在開花期觀察記錄各代群體花色的表型。利用卡方檢驗對豌豆花色性狀的遺傳分析進行適合性檢驗, 公式為

式中,為實際值,為理論值。取植株頂端幼嫩葉片, 與硅膠混合后帶回實驗室, 采用CTAB法[17]提取豌豆的基因組DNA并檢測濃度。

1.2.2 混池的構建 親本混池構建: 10株白花親本G0002930與10株紫花親本G0004562, 命名為R125、R127; 子代混池構建: 表型為白色花和紫色花的F2群體各30株, 命名為R135、R138。DNA等量混合構成2個親本混池和2個子代混池送與北京百邁客生物科技有限公司完成測序分析, 利用DNA超聲波粉碎成插入長度為350 bp的片段, 雙端處理文庫質檢合格后利用Illunima HiSeq進行測序, 親本深度為10′, 子代測序深度為30′。

1.3 測序數據處理

原始測序序列Raw Reads需篩選過濾, 利用bwa[18]軟件將獲取高質量的Clean Reads與參考基因組version 1a上[15]比對定位, 利用Picard[19]軟件檢測插入片段的大小分布, GATK[20]軟件實現SNP的變異檢測, SnpEff[21]軟件注釋Small InDel位點。檢測到的SNP以及InDel位點過濾掉低質量可信位點。最后利用歐氏距離(euclidean distance, ED)算法[22]、SNP-index (InDel-index)算法[23], 進行關聯分析。

1.4 豌豆花色基因的精細定位

利用候選區(qū)域的InDel位點設計引物, 在Pisum-URGI網站(https://urgi.versailles.inra.fr/)截取豌豆參考基因組序列變異位點上下游400 bp的序列,利用NCBI的Primer-BLAST工具設計引物, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。親本PCR反應體系是20 μL, 群體PCR反應體系是10 μL。反應程序如下: 預變性95℃ 5 min; 變性94℃ 30 s, 退火50～60℃ 30 s, 延伸72℃ 45 s, 35個循環(huán); 延伸72℃ 10 min。利用8%的PAGE凝膠電泳對擴增產物進行檢測, 統(tǒng)計條帶, 計算交換率。

1.5 候選區(qū)域功能注釋與候選基因篩選

利用SNP和InDel關聯分析整合得到的候選區(qū)域, 運用BLAST軟件與NR數據庫[24]、Swissprot數據庫、GO數據庫[25]、KEGG[25]和COG[27]數據庫進行比對, 通過對基因編碼區(qū)的注釋篩選出候選基因。

2 結果與分析

2.1 花色性狀的遺傳分析

用表型為白花的G0002930作為母本, 與表型為紫花的G0004562雜交, 獲得F1代, F1表現為紫花, 表明紫花性狀為顯性, 將收獲的F2種子種于北京昌平溫室, 共收獲F2群體1262株, 其中紫花群體941株, 白花群體321株。經卡方檢驗發(fā)現(表1), χ2= 0.13 < χ2(0.05,1)= 3.84, 故應接受該花色性狀分離符合孟德爾3∶1的分離定律。通過遺傳性分析可知, 白花性狀受1對隱性核基因控制。

2.2 花色基因初定位區(qū)間的篩選

原始測序序列Raw Reads經篩選過濾, 獲得Clean Data共435.06 Gbp, 質量值大于30的堿基數占80%以上, 平均每個樣品的測序深度為27.89×?；蚪M平均覆蓋度為84.60%, 樣品與參考基因組平均比對效率在99%以上(表2), 樣品的平均比對效率均在80%以上, 說明樣品測序正常, 可用于后續(xù)相關研究。

利用測序結果通過關聯分析篩選花色基因的候選區(qū)間。其中, 基于SNP位點分析(圖1), 利用ED算法根據關聯閾值判定, 共獲得24個與候選基因相關的定位區(qū)間(長度總計142.78 Mb), 區(qū)間內共有1652個基因, 非同義突變的基因占24.76%; 為了充分利用數據, 降低SNP-index算法中的關聯閾值以期獲得比較可能的定位區(qū)域, 本研究將關聯閾值調至0.42, 獲得了10個與候選基因相關聯的區(qū)域(長度總計為32.25 Mb), 區(qū)間內包含462個基因, 非同義突變的基因占26.19%。

表1 F2群體中不同花色的植株數目

表2 不同樣品測序比對結果

圖1 關聯值在染色體上的分布(SNP)

A: ED關聯分析結果。橫坐標為染色體的分布, 每個點代表SNP位點的ED值。B: SNP-index關聯分析結果。橫坐標為染色體的分布, 每個點代表的ΔSNP-index值。

A: ED correlation analysis. The horizontal coordinate is the distribution of chromosomes, and each point represents the ED value of SNP. B: SNP-index association analysis. The horizontal coordinate is the distribution of chromosomes, and each dot represents the ΔSNP-index value.

基于InDel位點分析(圖2), ED算法共得到53個區(qū)域(總長度為140.20 Mb), 區(qū)域內共包含1523個基因, 包括64個移碼突變的基因; InDel-index算法共得到10個區(qū)域(總長度為32.27 Mb), 區(qū)域內共包含458個基因, 包括16個移碼突變的基因。

綜上, 取SNP和InDel位點關聯分析結果的重復區(qū)域作為花色基因初定位的候選區(qū)域, 共得到的5個關聯區(qū)域, 總長度為31.42 Mb, 共包含基因449個(表3)。

2.3 花色基因的精細定位

根據BSA-seq的測序數據, 在初定位31.42 Mb的區(qū)間內共設計了279對引物, 利用親本混合樣、2個親本以及隨機選取若干F2群體篩選出條帶清晰且有多態(tài)性的高質量引物31對, 多態(tài)性引物見表4。

利用F2子代群體內321株表型為白花的全部隱性單株和31對多態(tài)性的引物進行連鎖標記篩選。如圖3所示, 在候選區(qū)域內共檢測到2種交換株, 其中標記WDBH141-1和WDBH187-1共檢測到14株交換株和2株交換株, 標記WDBH044-1和WDBH141-1共檢測到17株交換株和1株交換株, 標記WDBH209-1和WDBH029-1檢測到的交換單株株數為0, 其他標記檢測到的交換株詳見附表1。故精細定位將最初的31.42 Mb逐步縮小至標記WDBH187-1和WDBH220-1之間, 標記的位置為6,757,954,183和68,566,772, 區(qū)間大小0.99 Mb, 共包含19個基因。

圖2 關聯值在染色體上的分布(InDel)

A: ED關聯分析結果。橫坐標為染色體的分布, 每個點代表InDel位點的ED值。B: SNP-index關聯分析結果。橫坐標為染色體的分布, 每個點代表的ΔInDel-index值。

A: ED correlation analysis. The horizontal coordinate is the distribution of chromosomes, and each point represents the ED value of InDel site. B: SNP-index association analysis. The horizontal coordinate is the distribution of chromosomes, and each dot represents the ΔInDel-index value.

表3 不同關聯分析方法獲得的關聯區(qū)域

表4 精細定位所用多態(tài)性分子標記

(續(xù)表4)

圖3 精細定位豌豆花色基因的目標區(qū)域

2.4 候選基因及功能預測

由表5可知, 在0.99 Mb的區(qū)間內共包含候選基因19個, 其中基因、、在Swissprot_annotation基因注釋文庫里的功能未知, 基因、、、在所有的基因注釋文庫里未找到相應的注釋, 推測可能是豌豆特有的新基因或者是假基因。其中基因控制Basic helix-loop-helix protein A的合成, 為bHLH轉錄調控因子, 調控黃酮生物合成過程, 推測可能為豌豆花色的候選基因。

3 討論

與同源克隆和基于構建遺傳圖譜QTL定位相比, BSA-seq技術只需少量極端個體構建混池, 混池間除了目標性狀相關位點存在差異, 其他位點均趨向于一致, 具有簡單、高效、快速定位基因且無需構建遺傳圖譜等優(yōu)勢[28]。檢測結果還提供了區(qū)間內突變位點的信息, 在精細定位過程中, 能為分子標記的設計提供了參考和便利。Zheng等[15]通過BSA-seq技術對豌豆進行混池測序, 共獲得了67.85 Mb reads,利用水稻參考基因組序列比對得到了0.97 Mb的reads, 與本研究獲得的數據相比較數據量較少。本研究利用BSA-seq技術對控制豌豆花色基因進行初步定位, 獲得定位區(qū)間大小為31.42 Mb, 區(qū)間內包含449個基因, 區(qū)間長度較大, 可能的原因推測為豌豆的基因組較大(4.45 Gb), 是豆科模式植物蒺藜苜蓿[29](0.5 Gb)的9倍, 但是基因的數量卻略少于蒺藜苜蓿, 這也解釋了31.42 Mb的范圍內僅含有449個基因的原因。在利用ED算法進行關聯分析時, 關聯閾值計算的0.42, 并未超過理論關聯閾值0.667, 可能的原因是構建群體所用的親本為豌豆種質資源,背景復雜, 噪點較多, 但并不影響候選基因定位的準確性。這種現象在東鄉(xiāng)野生稻種子耐貯性相關位點的鑒定[30]和蘿卜基因的突變使花瓣顏色從紫色變?yōu)榘咨玔31]等相關研究上均有出現。

豌豆的花瓣呈現紫色是由于花瓣中花青素的積累導致的, 花青素是類黃酮途徑特定分支的最終產物, 其合成途徑在玉米[32]、矮牽牛[33]、葡萄[34]等高等植物中是保守的。在擬南芥中, 花青素的合成需要MYB-bHLH-WD40轉錄因子的三元復合物(MBW)的調節(jié), 即R2R3-MYB結構域、bHLH (Basic helix- loop-helix protein, 堿性螺旋-環(huán)-螺旋)結構域和保守的WD40重復序列的蛋白質家族成員[35]。bHLH轉錄因子在多種植物中被證實參與了調控花青素合成基因的表達[36], 通過直接調節(jié)結構基因(、、)的表達水平, 在花青素途徑中起正或負調節(jié)作用。在蒺藜苜蓿中, bHLH轉錄因子被表征為控制花青素和原花青素生物合成的三元復合物的核心成分,突變體導致花青素和原花青素損失,基因對擬南芥突變體的互補能恢復花青素和原花青素的積累[37], 在豌豆中, Hellans等[38]利用模型豆科植物蒺藜苜蓿的參考基因組序列以及它們與豌豆基因組的已知共線性、等位基因多樣性、轉錄量化和瞬時表達互補研究來鑒定豌豆中的基因, 證實了基因不直接參與花青素的合成, 而是編碼一個轉錄因子bHLH參與調控類黃酮化合物合成,基因突變后導致mRNA的剪切錯誤導致翻譯提前終止。本研究利用BSA-seq方法以及設計InDel分子標記進行精細定位, 最后將花色基因定位在0.99 Mb的區(qū)間內, 包含19個基因, 其中Swissprot注釋庫里基因控制Basic helix-loop- helix protein A的合成, 為bHLH轉錄調控因子。在GO注釋庫里, 該基因的生物過程包括含花青素的化合物生物合成過程(GO: 0009718)和黃酮生物合成過程的調控(GO: 0009962), 這與Hellans等[38]的研究結果一致, 使得將BSA-seq技術應用到豌豆控制花色基因的定位上得到驗證, 為豌豆有關產量、抗蟲、抗病等其他重要基因的挖掘奠定了基礎, 也為后續(xù)基因的功能驗證奠定基礎。

表5 定位區(qū)間內的基因及功能預測

4 結論

本研究利用BSA-seq技術、設計InDel分子標記將花色基因定位到0.99 Mb的區(qū)間內, 其中包含19個基因, 通過基因注釋文庫信息推測為花色候選基因, 為快速高效定位豌豆其他重要性狀相關基因奠定了基礎。

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Fine mapping of flower colour gene in pea (L.) based on BSA-seq technique

YAN Xin1,**, XIANG Chao2,**, LIU Rong1, LI Guan1, LI Meng-Wei1, LI Zheng-Li3, ZONG Xu-Xiao1,*, and YANG Tao1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;2Institute of Crop Sciences, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, Sichuan, China;3Institute of Horticulture, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, Guizhou, China

In recent years, BSA-seq technology has been widely used in the mining of new genes related to agronomic traits. With the development of the first reference genome of pea, it is imperative to combine BSA-seq method with genome-wide sequencing for gene mapping. In this study, we used purple flower parent G0004562, white flower parent G0002930, and F2populations for preliminarily locate the target genes controlling flower color by BSA-seq technology, and a mapping region of 31.42 Mb was obtained. Then, the InDel molecular markers were designed to further narrow the mapping interval, and finally the target gene was located in the range of 0.99 Mb with 19 genes. Based on gene annotation,was considered as the candidate gene that controled the flower color. The results of this study verified the feasibility of gene mapping by BSA-seq technology in pea.

pea; BSA-seq; InDel; gene mapping

10.3724/SP.J.1006.2023.24055

本研究由國家作物種質資源庫-食用豆資源整合與共享項目(NCGRC-2021-07), 普查收集食用豆資源鑒定評價與繁殖編目入庫項目(19210867)和財政部和農業(yè)農村部國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-08-G11)資助。

This study was supported by the National Infrastructure for Crop Germplasm Resources Project from the Ministry of Science and Technology of China (NCGRC-2021-07), the Project of Identification, Evaluation, Replication, and Preservation of Food Legumes Collected by the Survey and Collection Action on Crop Germplasm Resources (19210867), and the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-08-G11).

楊濤, E-mail: yangtao02@caas.cn; 宗緒曉, E-mail: zongxuxiao@caas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

嚴昕, E-mail: yanxin5290@163.com; 項超, E-mail: xc2011cib@163.com

2022-03-10;

2022-07-21;

2022-08-22.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220819.1436.008.html

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