Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶1在動脈粥樣硬化血管壁中的表達(dá)及其與基質(zhì)金屬蛋白酶2及轉(zhuǎn)化生長因子1的相關(guān)性

楊雅雯，夏敏，吳芬，宋夢星，陸文燁，馬占龍

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，南京 210029)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)相關(guān)心血管事件如急性冠脈綜合征、心肌梗死、腦卒中等在發(fā)達(dá)國家和發(fā)展中國家均有較高的致死率，預(yù)防AS患者急性心血管事件的發(fā)生對于提高患者生存率具有重要意義。Rho相關(guān)卷曲螺旋激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)是三磷酸烏苷(guanosine triphosphate, GTP)結(jié)合蛋白家族分子RhoA的主要下游調(diào)節(jié)蛋白。研究報道，RhoA/ROCK通路的激活與心血管疾病如冠狀動脈痙攣、高血壓、動脈粥樣硬化、動脈瘤等的發(fā)病、進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)。ROCK分為ROCK1和ROCK2，其中ROCK1被認(rèn)為與心血管病理性纖維化、高血壓、糖尿病等密切相關(guān)[1，2]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是一類能降解細(xì)胞外基質(zhì)的酶，其上調(diào)導(dǎo)致膠原蛋白缺失發(fā)生AS斑塊破裂、主動脈瘤、主動脈夾層等急性事件[3]，其中2型MMP在血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)中表達(dá)較為豐富。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，在心肌纖維化和血管硬化方面有重要作用。

既往研究證明，冠狀動脈痙攣患者外周白細(xì)胞中的Rho激酶活性增加[4]，急性心肌梗死患者的MMP水平顯著高于穩(wěn)定型心絞痛患者[5]，TGF-β1可導(dǎo)致動脈粥樣硬化血管壁纖維化增厚及管腔狹窄，三者均參與到心血管不良事件。但ROCK1在動脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展過程中血管壁的表達(dá)及其與MMP2及TGF-β1的相關(guān)性尚未見詳細(xì)研究報道。本次實驗通過建立動脈粥樣硬化動物模型，研究ROCK1在動脈粥樣硬化血管壁中的表達(dá)特點及其與MMP2、TGF-β1的相關(guān)性，為急性心血管事件的預(yù)防提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性ApoE基因敲除小鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自北京維通利華研究動物技術(shù)有限公司。野生型C57BL/6小鼠，6周齡，體質(zhì)量18～20 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)動物研究中心。高脂飼料(含1.25%膽固醇)由南京協(xié)同醫(yī)藥生物工程公司提供。ROCK1抗體、MMP2抗體、TGF-β1抗體由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供，使用全自動生化分析儀(Chemray 240,深圳雷杜生命科技)測量血脂，使用光學(xué)顯微鏡及成像系統(tǒng)(eclipse Ci-e，日本尼康)觀察病理標(biāo)本。本實驗得到實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 建立動脈粥樣硬化動物模型

實驗組為30只ApoE基因敲除小鼠，高脂飼料喂養(yǎng)；對照組為30只C57BL/6小鼠，普通飼料喂養(yǎng)。2組分別于喂養(yǎng)的第10、16、22、28及34周測量血脂并取主動脈標(biāo)本觀察血管斑塊形成情況。

1.3 實驗方法

在監(jiān)測時間點，實驗組和對照組各隨機(jī)選取5只小鼠，腹腔注射10%水合氯醛(5 ml/kg),麻醉生效后取眼球血測量血脂水平，之后過量麻醉處死小鼠，從主動脈弓至主動脈降部取1～1.5 cm主動脈作為標(biāo)本，用生理鹽水及磷酸鹽(phosphate buffered saline，PBS)緩沖液反復(fù)沖洗標(biāo)本，至表面無明顯雜質(zhì)殘留之后，置于4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋切片，片厚約4 μm。每個標(biāo)本取3張切片做蘇木精-尹紅(hematoxylin-eosin，HE)染色，普通光鏡下觀察血管壁情況，若顯示有斑塊形成，則另取相應(yīng)標(biāo)本的切片做ROCK1、MMP2、TGF-β1單抗免疫組化染色(各3張)，光學(xué)顯微鏡觀察蛋白表達(dá)分布情況。

1.4 HE染色和免疫組化染色及相關(guān)指標(biāo)定量

HE染色：石蠟切片脫蠟至水，入蘇木素染色3～5 min，水洗反藍(lán)，伊紅液染色5 min，無水乙醇脫水，封片晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)為紅色。使用Image Pro Plus 6.0軟件測量血管壁厚度、斑塊面積、血管腔面積及斑塊面積/血管腔面積。

免疫組化染色：石蠟切片脫蠟至水，入檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液中進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗滌，入3%雙氧水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS洗滌，每張切片加一抗覆蓋組織(一抗稀釋度均為1∶200)，PBS洗滌，洗后加二抗，PBS洗后再加二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色溶液，控制顯色，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，水洗返藍(lán)，脫水封片晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞核為藍(lán)色，DAB顯出的陽性表達(dá)為棕黃色。使用Image Pro Plus 6.0軟件計算免疫組化切片中陽性表達(dá)區(qū)的面積和相對灰度值(單位面積中的平均光密度值，作為免疫組化結(jié)果定量依據(jù))。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 2組小鼠血脂水平變化

在各個監(jiān)測點上，與對照組相比，實驗組的膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與對照組相比，實驗組的甘油三酯(triglyceride, TG)水平逐漸升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在第28與34周，實驗組的高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol , HDL-C)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05；表1)。

表1 不同時期各組小鼠血脂水平

2.2 2組小鼠腹主動脈血管壁組織形態(tài)變化

對照組小鼠腹主動脈血管內(nèi)均無斑塊形成，血管壁結(jié)構(gòu)正常。實驗組小鼠在第10周見血管內(nèi)膜局部隆起，內(nèi)皮下脂質(zhì)沉積，第16～34周均見主動脈管壁局部增厚，血管內(nèi)均有斑塊形成，在第34周最明顯(圖1)。隨著飼養(yǎng)時間延長，血管壁厚度逐漸增加，斑塊面積逐漸增大，斑塊面積/管腔面積逐漸增大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；喂養(yǎng)過程中，小鼠血管腔面積未見明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05；表2)。

圖1 2組小鼠腹主動脈血管壁形態(tài)學(xué)變化

表2 實驗組小鼠主動脈血管壁厚度及斑塊情況

2.3 2組小鼠ROCK1的免疫組化結(jié)果

2組小鼠ROCK1免疫組化結(jié)果比較，對照組血管壁ROCK1的表達(dá)較少，主要集中在細(xì)胞核；實驗組血管壁局部及斑塊內(nèi)均有較多的ROCK1表達(dá)，主要集中在斑塊肩部及斑塊側(cè)的血管壁(圖2，圖3)。

圖2 2組小鼠ROCK1免疫組化結(jié)果

2.4 實驗組不同時期ROCK1、MMP2及TGF-β1的表達(dá)和分布

不同時期血管壁斑塊內(nèi)均有ROCK1、MMP2及TGF-β1的表達(dá)，隨著飼養(yǎng)時間延長，斑塊內(nèi)ROCK1、MMP2、TGF-β1表達(dá)均呈上升趨勢，ROCK1的表達(dá)水平稍高于MMP2、TGF-β1的表達(dá)(圖3)。

圖3 實驗組ROCK1、MMP2及TGF-β1免疫組化結(jié)果

2.5 實驗組不同時期ROCK1、MMP2及TGF-β1表達(dá)與斑塊面積的相關(guān)性

使用Image Pro Plus 6.0軟件計算不同時期ROCK1、MMP2及TGF-β的表達(dá)量，采用線性相關(guān)分析三者與斑塊面積的相關(guān)性。結(jié)果顯示，建模過程中，ROCK1、MMP2、TGF-β1的表達(dá)與斑塊面積呈正相關(guān)(r=0.979，0.801，0.720；P<0.01；圖4)。Pearson相關(guān)與線性回歸分析結(jié)果顯示：ROCK1與MMP2、TGF-β1呈顯著正相關(guān)(r=0.801，0.906，P<0.05；R=0.582，0.790，P<0.05)。

圖4 實驗組不同時期ROCK1、MMP2及TGF-β1表達(dá)與斑塊面積的相關(guān)性

3 討 論

動脈粥樣硬化相關(guān)的心血管事件在全世界范圍有著較高的發(fā)病率和死亡率[6]，識別高風(fēng)險AS患者對提高其生存率具有重要意義。本實驗通過建立動脈粥樣硬化模型研究ROCK1在動脈粥樣硬化血管壁中的表達(dá)及其與MMP2、TGF-β1的相關(guān)性。

ROCK1是小GTP酶蛋白RhoA最重要的下游蛋白，血管壁中ROCK1過度激活會促進(jìn)平滑肌細(xì)胞收縮和血管內(nèi)皮源性舒張因子合成減少，繼而導(dǎo)致血管痙攣[4]。研究顯示，ROCK1導(dǎo)致的血管壁肌球蛋白輕鏈磷酸化的程度與冠狀動脈痙攣的程度呈顯著正相關(guān)[7]，使用Rho激酶抑制劑能有效降低穩(wěn)定型心絞痛患者的發(fā)作頻率和減輕血管痙攣性心絞痛患者的冠狀動脈血管痙攣[8]?？梢?，ROCK1蛋白是一種痙攣性收縮異常蛋白。此外，RhoA/ROCK1通路激活與高血壓、糖尿病、肥胖癥等目前世界公認(rèn)的動脈粥樣硬化高危因素有密切關(guān)系[9-11]。ROCK1激活導(dǎo)致血管內(nèi)膜功能障礙、VSMC增殖遷移和表型轉(zhuǎn)化、血管外膜炎癥反應(yīng)、泡沫細(xì)胞形成等，ROCK1被認(rèn)為是促炎和促動脈粥樣硬化分子。本研究結(jié)果顯示，與正常血管壁相比，AS血管壁ROCK1蛋白表達(dá)水平較高，主要分布在斑塊的肩部及斑塊側(cè)的血管壁中，提示動脈粥樣硬化血管壁可能易于發(fā)生痙攣，隨著斑塊面積不斷增大及血管壁逐漸增厚，ROCK1表達(dá)也增多，兩者呈明顯正相關(guān)，說明ROCK1可能促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展。

ROCK在心臟纖維化和脈管系統(tǒng)的硬化方面發(fā)揮重要作用。ROCK通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)應(yīng)力纖維聚合促進(jìn)纖維化相關(guān)信號途徑如心肌素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(myocardin-related transcription factor，MRTF)/血清應(yīng)答因子(serum response factor，SRF)、Yes相關(guān)蛋白(Yes associated protein，YAP)/轉(zhuǎn)錄共激活因子PDZ結(jié)合基(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif，TAZ)/TEA結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子(TEA domain transcription factor，TEAD)激活[12]。細(xì)胞因子TGF-β1是心血管纖維化過程的重要介質(zhì)，其促纖維化作用包括經(jīng)典及非經(jīng)典通路。經(jīng)典途徑即TGF-β1磷酸化下游轉(zhuǎn)錄激活因子Smad2/3進(jìn)而促進(jìn)纖維化基因表達(dá)，抑制ROCK活性能抑制經(jīng)典途徑。非經(jīng)典途徑即TGF-β1通過激活ROCK1來調(diào)節(jié)F-肌動蛋白的聚合驅(qū)動相關(guān)基因表達(dá)[12]?？梢?，ROCK能獨(dú)立也能與TGF-β1通路相互作用來促進(jìn)心血管纖維化過程[12，13]，ROCK抑制劑表現(xiàn)出抗重塑的作用[14]。

MMP是一組可以降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶類，其中MMP2主要降解膠原蛋白和彈性蛋白，尤其是纖維帽的基質(zhì)成分，導(dǎo)致纖維帽變薄進(jìn)而發(fā)生斑塊破裂、血栓形成、心肌梗死等嚴(yán)重心血管事件[15]。主動脈瘤與血管壁炎癥及高活性MMP有密切關(guān)系[16]，使用Rho激酶抑制劑能顯著抑制VSMC分泌MMP2，減少主動脈瘤形成[5]，可能是ROCK1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中肌動蛋白的形成進(jìn)而激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)/P38絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路，促進(jìn)MMP2的分泌。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與正常血管壁相比，AS血管壁中ROCK1表達(dá)水平更高，且隨血管壁厚度及斑塊面積增大而不斷增高，同時ROCK1的表達(dá)與MMP2、TGF-β1的表達(dá)呈正相關(guān)。實驗證明動脈粥樣硬化小鼠血管壁中存在ROCK1蛋白的異常表達(dá)，ROCK1、MMP2、TGF-β1三者可能共同促進(jìn)AS的進(jìn)展，但具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。鑒于ROCK1蛋白的致血管痙攣作用，本實驗結(jié)果提示動脈粥樣硬化斑塊可能容易發(fā)生痙攣，且在AS晚期痙攣風(fēng)險可能更高。研究AS血管壁中ROCK1的活性對于提高AS患者的生存率具有重要意義。未來研究或許可以將ROCK1活性作為AS患者預(yù)后結(jié)果的生物標(biāo)志物[17]，或者應(yīng)用分子影像學(xué)的知識制備特異性靶向ROCK1探針，根據(jù)血管壁局部磁共振信號的改變推算出ROCK1含量，對AS患者進(jìn)行危險分層與預(yù)后評估，以便更好地預(yù)防急性心血管事件的發(fā)生，但這仍然需要進(jìn)行大量長期的臨床研究。