用18S rRNA 高通量測序分析比較萬峰湖豐水期和枯水期生物多樣性

秦燕，范波，陳應(yīng)美，盧彪

（興義民族師范學(xué)院生物與化學(xué)學(xué)院，貴州 興義 562400）

萬峰湖位于黔、滇、桂三省交界處，因建設(shè)天生橋電站攔截南盤江而成的淡水湖泊，積水后水位深度約170 m，最大庫容可達(dá)108 億m3[1]。萬峰湖是珠三角地區(qū)重要的水源供給地，因而水質(zhì)的好壞直接影響周圍地區(qū)的用水安全。目前有關(guān)萬峰湖的研究大多集中在水質(zhì)污染方面，特別是工業(yè)廢水排放導(dǎo)致的汞污染。對于萬峰湖浮游生物資源調(diào)查的研究較少，并且研究手段也僅限于傳統(tǒng)鏡檢的分析方式[1-3]。目前國內(nèi)對于萬峰湖所有真核生物資源的研究幾乎處于空白階段。本研究對萬峰湖真核生物多樣性進(jìn)行分析研究，了解其資源分布，將對今后萬峰湖真核生物多樣性研究提供參考。

本研究于2020 年10 月（豐水期）和2021 年5月（枯水期）分別對萬峰湖上游、中游和下游湖中進(jìn)行采樣調(diào)查，利用高通量測序技術(shù)，分析并比較萬峰湖真核生物的群落結(jié)構(gòu)組成，通過多樣性指數(shù)和均勻度分析、PCA 和物種豐度熱圖分析萬峰湖真核生物群落結(jié)構(gòu)多樣性，為萬峰湖水質(zhì)的評價和后續(xù)富營養(yǎng)化的防治提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣點的選擇

萬峰湖是河流型湖泊，充分考慮到水流的方向和水位的特點，于2020 年10 月（豐水期）和2021年5 月（枯水期）分別對萬峰湖上游、中游和下游湖中的A-L 共12 個采樣點淺水區(qū)采樣進(jìn)行鏡檢鑒定，而后對DB（大壩）、MJW（梅家灣）、PM（坡母）、SL（石林）、ZYF（榨油坊）、BJ（巴結(jié)）、YYT（野鴨灘）、GB（革布）分別標(biāo)記為1～8 的八個位置不同深度的水體進(jìn)行采樣，HC 的取樣位置在SL 附近，采樣位置分布見圖1。表層水體的位置為0～2 m 水深處，中層水體的位置為5～10 m 水深處，底層水體的位置為15 m 水深左右，同一位置不同水深的水采樣后混合。

圖1 萬峰湖采樣點分布圖Fig.1 The map of sampling sites distribution in Wanfeng Lake

1.2 樣本采集與預(yù)處理

1.2.1 樣本采集

用5 L 帶蓋的不銹鋼采樣器采集不同水深位置的水樣，分別裝于5 L 的干凈礦泉水桶中。溶解氧（DO）和水溫（WT）用溶氧儀（HQ30 型，美國哈希）現(xiàn)場檢測；pH 用pH 試紙檢測。

1.2.2 樣本預(yù)處理

從萬峰湖8 個采樣點，分別采集水樣2 000 mL。水樣用真空泵抽濾，濾膜直徑為0.45 μm，將載有樣本的濾膜立即放在-80℃冰箱保存。

1.3 高通量測序

取適量濾膜上的樣品，液氮冷凍后，組織破碎儀中進(jìn)行破碎。取適量洗過之后的液體12 000 r/min離心2 min，留取沉淀進(jìn)行提取。以O(shè)MEGA 試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit 提取試劑盒（M5635-02）提取DNA 后質(zhì)檢。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA 精確定量,以確定PCR反應(yīng)DNA 模板的量。PCR 所用的引物如下：擴(kuò)增區(qū)域為18SV4；測序平臺Miseq 2x300 bp，18SV4 引物序 列 18SV4F：GGCAAGTCTGGTGCCAG；18SV4R：ACGGTATCTRATCRTCTTCG。

巢式PCR 進(jìn)行兩輪PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系30 μL：2×HieffRobust PCR Master Mix 15 μL，引物F 和引物R 各1 μL，模板20～30 ng，加水9～12 μL 至總體積30 μL。PCR 程序如下，第一輪PCR 反應(yīng)條件為：94℃，3 min；然后94℃30 sec、45℃20 sec、65℃30 sec 5 個循環(huán)，然后94℃20 sec、55℃20 sec、72℃30 sec 20 個循環(huán)，72℃延伸5 min，10℃保存。第二輪PCR 反應(yīng)條件：95℃3 min，然后94℃20 sec、55℃20 sec、72℃30 sec 5 個循環(huán)，72℃延伸5 min，10℃保存。

Illumina MiseqTM測序：PCR 產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收，用Qubit3.0 熒光定量儀進(jìn)行文庫濃度測定，而后送往上海生工進(jìn)行高通量測序，測序平臺為Illumina MiseqTM。

1.4 高通量測序數(shù)據(jù)分析和處理

1.4.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

下機(jī)測序得到的是雙端序列數(shù)據(jù)含有barcode序列以及測序時加入的引物和接頭序列，首先需要使用Cutadapt（v1.18）去除引物接頭序列[4]，再根據(jù)PE reads 之間的overlap 關(guān)系，使用PEAR（v 0.9.8）將成對的reads 拼接（merge）成一條序列[5]，然后按照barcode 標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后使用PRINSEQ（v 0.20.4）對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾[6]，得到各樣本有效數(shù)據(jù)。

1.4.2 OTU 聚類

OTU（Operational Taxonomic Units）是在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)或群體遺傳學(xué)研究中，人為給某一個分類單元（品系、屬、種、分組等）設(shè)置的統(tǒng)一標(biāo)志。通過Usearch（v 11.0.667）軟件聚類分析物種的種類和數(shù)目。將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組，一個小組就是一個OTU。對所有序列進(jìn)行OTU 劃分，通常對97%相似水平的OTU 進(jìn)行生物信息統(tǒng)計分析[7,8]。

1.4.3 OTU 物種注釋和統(tǒng)計

為了得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息，利用blastn 將序列與對應(yīng)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，篩選出序列的最佳比對結(jié)果，并對比對結(jié)果進(jìn)行過濾，默認(rèn)滿足相似度＞90%且覆蓋率＞90%的序列被用來后續(xù)分類。18S 使用Blast 比對NCBI 18S 數(shù)據(jù)庫（http://ncbi.nlm.nih.gov/）。最終分別在各個分類水平：domain（域）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）上統(tǒng)計各樣本的群落組成。

1.4.4 OTU 的分析

基于OTU 豐度，每個取樣點的OTU 數(shù)目的Venn圖由R 的VennDiagram 軟件R（V1.6.20）繪制[9]；為了展示不同取樣點OTU 組成的不同，進(jìn)行了主成分的分析（principal component analysis，PCA）。此步驟運用的軟件是R 中的“ade4”包（v 1.7-13）[10]；OTU等級豐度曲線能可視化的得到物種的豐富程度和均勻度。物種的豐富度可以從X 軸上不同物種的數(shù)目得到。圖中X 軸表示不同OTU 的等級，Y 軸表示OTU 的相對豐度，等級曲線繪制來自軟件R 中的gplots 包（v3.0.1.1）；物種的注釋中每個分類階元（域、門、綱、目、科、屬、種）上的OTU 的數(shù)目或者不同樣本中OTU 的數(shù)目都是基于NCBI 數(shù)據(jù)庫，RDP分類2.2[11]，貝葉斯算法得出的。通過比較每個OTU中的代表序列和數(shù)據(jù)庫中的序列，進(jìn)行相似性比對和物種注釋，從而在不同的分類階元的水平上計算每個樣本中的群落組成；多樣性指數(shù)分析可以估計環(huán)境群落的物種豐度和多樣性[12]。本研究中計算群落分布豐度（Community richness）的指數(shù)有：Sobs—觀察到的豐度（http://www.mothur.org/wiki/Sobs），Chao1估算（http://www.mothur.org/wiki/Chao），ACE估算（http://www.mothur.org/wiki/Ace）。計算群落分布多樣性（Community diversity）的指數(shù)有：Shannon 指數(shù)（http://www.mothur.org/wiki/Shannon），Simpson 指數(shù)（http://www.mothur.org/wiki/Simpson）和覆蓋率（http://www.mothur.org/wiki/Coverage）。計算群落分布均勻度（Community evenness）的指數(shù)有：Shannoneven—基于Shannon 指數(shù)的均勻度測量（Pielou 均勻度指數(shù)J）；稀釋性曲線中數(shù)據(jù)計算使用軟件Mothur（v1.43.0）完成[12]，稀釋性曲線的繪制通過軟件R 中的vegan（v 2.5-6）包完成；β 多樣性分析主要用來評估樣本間物種多樣性的不同。β 多樣性分析是通過軟件phyloseq（v.1.30.0）完成的[13]，使用R 的gplots package 進(jìn)行距離熱圖繪制；主坐標(biāo)分析中所用軟件為phyloseq；共線性關(guān)系圖由軟件R 的circlize 包繪制[14]。

1.5 傳統(tǒng)鏡檢驗證

選取萬峰湖上游、中游和下游A-L 共12 個采樣點淺水區(qū)采樣進(jìn)顯微鏡鏡檢，對各采樣點的藻類組成和數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序分析結(jié)果

2.1.1 OTU 的分析

OTU 的聚類分析主要是選出與代表序列相似性在97%以上的序列。在豐水期的樣本中共得到363 個OTUs，OTU 的韋恩圖顯示七個取樣點的樣本共同有的OTUs 有238 個，另外YYT 還有2 個特有的OTUs，PM 和SL 各有1 個OTU（圖2-A1）。在枯水期的樣本中252 個OTUs，韋恩圖中顯示三個樣本中共有的有131 個OTUs，另外BJ 和HC 共有的有36 個，BJ 和ZYF 共有的有28 個，ZYF 和HC 共有的有15 個，而BJ、HC 和ZYF 特有的分別有9個、6 個和27 個（圖2-A2）。

稀釋性曲線主要用來評估測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量是否能足以覆蓋種群中所有物種。當(dāng)曲線趨于平緩時，說明測序的數(shù)據(jù)量比較合理，Alpha 多樣性指數(shù)的稀釋曲線（圖2-B1、B2）均表明稀釋曲線漸漸趨于平緩，說明樣本的測序數(shù)據(jù)量足夠充分，測序深度基本全覆蓋，也可以說明在我們測序的樣本中基本沒有物種檢測不到，這保證了我們研究數(shù)據(jù)的可靠性。

基于物種相對豐度的主成分分析表明，在我們?nèi)拥牟煌瑯颖局蟹N群的組成有一定的差別，如豐水期中主成分PC1 和PC2 的值為50.31%和22.66%，而在枯水期中主成分PC1 和PC2 的值分別為66.29%和33.71%（圖2-C1、C2）。

圖2 豐水期（A1-D1）和枯水期（A2-D2）樣本中OTU 分析Fig.2 OTU analysis of samples in wet season（A1-D1）and dry season（A2-D2）

OTU 等級圖表主要從兩個方面展示物種的多樣性：物種的豐度和物種的均勻度。在水平方向上，曲線的寬度反映物種的豐度，曲線跨越的水平軸越寬，物種的豐度越高。曲線的走向越平緩，說明物種的分布差別越小，曲線傾斜度越大，物種分布的多樣性越大。從豐水期和枯水期的曲線比較，可以得出：豐水期曲線的跨度寬，則其物種的豐富度高，枯水期曲線的傾斜度大，則其物種的多樣性大，均勻度低。

2.1.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性主要是對樣本中物種多樣性進(jìn)行分析，利用OTU 物種和豐度計算出Ace、Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)和Shannoneven。Chao 和Ace是豐度指數(shù)，也即OTU 的數(shù)目；Shannon、Simpson 和Coverage 主要用來描述群落分布多樣性特征，因此Shannon 指數(shù)越大，Simpson 指數(shù)越小，則樣本中物種多樣性越高；、Shannoneven 是群落分布均勻度指數(shù)。

比較豐水期和枯水期的數(shù)據(jù)，豐水期的Chao，Ace 指數(shù)明顯高于枯水期，說明豐水期物種的豐度要比枯水期豐富的多。豐水期的Shannon 指數(shù)低于枯水期的Shannon 指數(shù)，而豐水期的Simpson 指數(shù)高于豐水期的Simpson 指數(shù)，且差異顯著，說明豐水期群落分布多樣性低于枯水期（見表1）。而豐水期物種的均勻度指數(shù)低于枯水期，則群體的多樣性低于枯水期。

表1 豐水期和枯水期樣品Alpha 多樣性指數(shù)比較表Tab.1 Comparison of alpha diversity index of samples in wet season and dry season

2.1.3 Beta 多樣性分析

為了進(jìn)一步展示樣本中物種多樣性的不同，用主坐標(biāo)分析來展示不同樣本見的不同（圖3）。如果兩個樣本距離很近，則說明兩個樣本的物種組成很相似。圖3 中不同形狀的點代表不同的樣本，PCoA1指引起的樣本的最大的不同的主要的坐標(biāo)成分，解釋度值分別為豐水期40.83%和枯水期75%。PCoA2是其次，解釋度值分別為24.17%和25%。由圖3 可知，豐水期樣本中，樣本DB、MJW 與BJ 距離較近，SL 和PM 距離較近，而樣本GB 與YYT 距離較近，說明DB、MJW 與BJ 樣本中的物種組成相似，SL 和PM 樣本、樣本GB 和YYT 中的物種組成相似，枯水期的三個樣本之間距離均較遠(yuǎn)，說明它們之間的群落組成均差別較大。

圖3 豐水期和枯水期主坐標(biāo)分析比較Fig.3 Comparison of principal co-ordinates analysis in wet season and dry season

2.1.4 在門水平上比較豐水期和枯水期真核浮游生物的組成

在門的水平上比較，豐水期樣本中含有22 種真核浮游生物，前五種分別為節(jié)肢動物門，綠藻門，壺菌門，硅藻門和子囊菌門。枯水期樣本中含有15種真核浮游生物，前五種分別為綠藻門，節(jié)肢動物門，輪蟲動物門，壺菌門，硅藻門和纖毛亞門。兩組樣本中真核浮游生物的種類和相對豐度見圖4，優(yōu)勢物種豐度熱圖見圖5。

圖4 豐水期（A）和枯水期（B）真核浮游生物的種類和相對豐度比較（在門的水平上）Fig.4 Comparison of species and relative abundance of eukaryotic plankton in wet season（A）and dry season (B）(at the phylum level）

圖5 豐水期（A）和枯水期（B）真核浮游生物優(yōu)勢物種豐度熱圖（在門的水平上）Fig.5 The heatmap of dominant species abundance of eukaryotic plankton in wet season (A）and dry season (B）(at the phylum level）

在門的水平上，比較同一取樣點樣本在枯水期和豐水期的物種種類和比例，顯示出明顯的差異。以BJ 為例，節(jié)肢動物門在豐水期的比例為45.46%而枯水期的比例為39.54%；綠藻門從豐水期的2.05%上升到枯水期的11.12%；硅藻門在豐水期沒有檢測到，而在枯水期比例為2.44%（圖6）。

圖6 以BJ 為例，比較豐水期（A）和枯水期（B）真核浮游生物的種類及百分比（在門的水平上）Fig.6 Comparison of the species and percentage of eukaryotic plankton in wet season (A）and dry season(B）(at the phylum level）,taking BJ as example

2.1.5 在種的水平上比較豐水期和枯水期真核浮游生物的組成

在種的水平上比較，豐水期的七個樣本中共得到147 種真核浮游生物，其中145 種是所有樣本共有的核心物種，PM 和SL 各有1 個樣本特有的物種；在枯水期的三個樣本中，共得到187 種真核浮游生物，其中108 種是三個樣本共有的核心物種，有21 種是BJ 和HC 所共有，19 種是BJ 和ZYF 共有，10 種是HC 和ZYF 共有，另外BJ、HC 和ZYF 特有的物種分別有6 種、5 種和17 種（圖7）。

圖7 豐水期（A）和枯水期（B）真核浮游生物物種分布Venn圖（在種的水平上）Fig.7 Venn diagram of eukaryotic plankton species distribution in wet season (A）and dry season (B）(at the species level）

比較豐水期和枯水期物種，兩組數(shù)據(jù)都含有的物種有馬索隱藻、擬蛋白核隱藻和光滑魚鱗藻三種。豐水期的優(yōu)勢物種為右突新鏢水蚤、甲藻、馬索隱藻、海洋尾蚴和中劍水蚤，所占的比例分別為41.8%、10.3%、8.3%、6.92%和3.28%?？菟诘膬?yōu)勢物種為真鏢水蚤、馬索隱藻、擬二叉角甲藻、輻球藻和蛋白核隱藻，所占的比例分別為35.67%、23.68%、4.97%、4.47%和2.83%（圖8）。

圖8 以BJ 為例，豐水期（A）和枯水期（B）真核浮游生物物種的種類和百分比（在種的水平上）Fig.8 Species and percentage of eukaryotic plankton in wet season (A）and dry season (B）(at the species level）,taking BJ as example

2.1.6 共線性關(guān)系

在門的水平上分析比較豐水期和枯水期，不同樣本中優(yōu)勢物種的共線性關(guān)系。圖9 僅顯示豐度最高的前10 個物種分類，共線性分析的結(jié)果表明，豐水期7 個取樣點已知的真核浮游生物中，節(jié)肢動物門的豐度最高，7 個取樣點的比例相當(dāng)，其次是綠藻門和壺菌門；而在枯水期的樣本中，綠藻門的豐度最高，取樣點HC 中的數(shù)量最多，其次是節(jié)肢動物門，取樣點BJ 中的數(shù)量最多，再次是輪蟲動物門，取樣點ZZF 中的數(shù)量最多。

圖9 豐水期（A）和枯水期（B）真核浮游生物的共線性關(guān)系比較圖Fig.9 Comparison of collinearity between eukaryotic plankton in wet season（A）and dry season（B）

2.2 鏡檢驗證豐水期和枯水期綠藻的種類和豐度

比較枯水期和豐水期優(yōu)勢物種，發(fā)現(xiàn)綠藻門是共有優(yōu)勢物種，并且真核浮游生物中綠藻指數(shù)還是檢測水質(zhì)營養(yǎng)型的重要指標(biāo)[2]。通過顯微鏡鏡檢，從圖1 中A-L 共12 個采樣點淺水區(qū)采樣進(jìn)行定性定量分析，共檢測到9 種綠藻，并對其豐度進(jìn)行統(tǒng)計，網(wǎng)狀水網(wǎng)藻、水綿屬、集團(tuán)剛毛藻、衣藻為萬峰湖優(yōu)勢種（表2）。而后分別在豐水期和枯水期取樣比較其分布情況，網(wǎng)狀水網(wǎng)藻、水綿和衣藻在較多取樣點有分布。擬新月藻原變種和獨球藻在枯水期分布多，豐水期只有一個取樣點檢測到；而隆起葡萄藻原變種只在枯水期的4 個位點有分布，豐水期未檢測到（表3）。

表2 萬峰湖12 個取樣點綠藻的組成Table 2 The species of green algae in 12 sampling sites of Wanfeng Lake

表3 萬峰湖枯水期和豐水期9 種綠藻分布比較Fig.3 The distribution of nine species of green algae in Wanfeng Lake in dry season and wet season

3 討論

本研究的創(chuàng)新點在于首次利用高通量測序技術(shù)對萬峰湖豐水期和枯水期真核浮游生物多樣性調(diào)查，對OTUs 的分析如Alpha 多樣性指數(shù)稀釋曲線充分說明了測序深度足夠，數(shù)據(jù)合理。通過比較萬峰湖枯水期和豐水期群落分布多樣性和群落分布均勻度發(fā)現(xiàn)，不同時間的樣本存在顯著的差異，說明湖體季節(jié)的變化會影響浮游生物的數(shù)量和種類。沈韞芬[15]在《微型生物檢測新技術(shù)》書中曾指出生物多樣性指數(shù)越大，水質(zhì)越好。Shannon 指數(shù)2.0～3.0 代表水質(zhì)輕度污染，1.0～2.0 代表水質(zhì)中度污染，我們的數(shù)據(jù)顯示萬峰湖枯水期和豐水期的Shannon 值分別為3.03 和2.62，屬于輕度污染或無污染狀態(tài)。

鏢水蚤隸屬于節(jié)肢動物門橈足類，在萬峰湖豐水期和枯水期均為優(yōu)勢物種，是魚類的餌料，多分布于營養(yǎng)型水體中。甲藻和隱藻是鞭毛藻類，含量也比較豐富，大多分布在富有有機(jī)質(zhì)的水體中，枯水期取樣時間在5 月，隨著光照增多，湖水中浮游植物（如隱藻）快速大量繁殖，也推動了浮游動物如鏢水蚤的增長。

萬峰湖的藻類主要是綠藻，綠藻門從豐水期的2.05%上升到枯水期的11.12%，說明枯水期的湖水條件更利于藻類的繁殖。綠藻指數(shù)還是檢測水質(zhì)營養(yǎng)型的重要指標(biāo)，我們還通過鏡檢比較豐水期和枯水期不同地點的綠藻組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枯水期的綠藻種類和數(shù)量均明顯高于豐水期。傳統(tǒng)鏡檢分析時，為了保證樣本的全面性，在不同季節(jié)的多個取樣點取樣，然而鏡檢僅鑒定出9 種綠藻，顯著低于高通量測序鑒定的數(shù)量，這說明通過鏡檢的形態(tài)鑒定的方法鑒定出的生物的種類較少[1-3]，隨機(jī)性大，存在人為誤差，容易漏檢一些數(shù)量少的物種，不能宏觀和全面的鑒定生物的種類和數(shù)量。而高通量測序檢測生物多樣性的研究較為廣泛的利用[16-20]，該技術(shù)靈敏度高，能檢測出豐度低于萬分之一的痕量物種。測序技術(shù)已經(jīng)被比喻為“新時代顯微鏡”，通過測序和序列比對，可快速準(zhǔn)確處理海量數(shù)據(jù)，減少人為誤差。

很多生物多樣性的研究都會結(jié)合多種影響因子對群落多樣性進(jìn)行研究。如陳美軍[19]對太湖中處于不同營養(yǎng)水平湖區(qū)的真核浮游生物多樣性進(jìn)行研究；張莉[20]用ITS 高通量測序技術(shù)研究黃海中微型真核浮游生物多樣性，發(fā)現(xiàn)溫度和經(jīng)緯度都會真核浮游生物多樣性；李磊[21]研究了環(huán)境因子對萬峰湖浮游生物時空分布的影響。本研究未能結(jié)合這些影響因子進(jìn)行分析，后續(xù)的工作將會結(jié)合這些因子進(jìn)行深入分析。

萬峰湖的浮游生物的調(diào)查已有很多研究報道，之前的研究大多以浮游植物為指標(biāo)評價萬峰湖的水質(zhì)和污染情況。本研究利用高通量測序技術(shù)，用18S rRNA 第一次全面調(diào)查了萬峰湖真核浮游生物的組成，并比較了豐水期和枯水期真核浮游生物的組成，并對水質(zhì)有指示作用的綠藻鏡檢鑒定，全面的調(diào)查了萬峰湖真核浮游生物的組成，雖然未能結(jié)合一些影響因子分析，但為保護(hù)萬峰湖提供科學(xué)依據(jù)，并對近幾年對萬峰湖的治污效果做初步的評價。

結(jié)論

（1）通過兩次調(diào)查分別得到豐水期真核浮游生物16 個門，147 種，枯水期23 門，187 種。豐水期的優(yōu)勢物種為浮游節(jié)肢動物，主要包括右突新鏢水蚤、甲藻和馬索隱藻；枯水期優(yōu)勢物種為浮游節(jié)肢動物和綠藻，主要包括真鏢水蚤、馬索隱藻和擬二叉角甲藻。而鏢水蚤在豐水期和枯水期均屬于優(yōu)勢物種。

（2）比較豐水期和枯水期的Ace、Chao、Shannon、Simpson 指數(shù)和Shannoneven 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)豐水期物種的豐度要比枯水期豐富，而豐水期群落分布多樣性低于枯水期，且豐水期物種的均勻度指數(shù)低于枯水期。

（3）萬峰湖枯水期和豐水期的Shannon 值分別為3.03 和2.62，屬于無污染和輕度污染狀態(tài)，說明近幾年萬峰湖的治污效果明顯。