LncRNA DANCR調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的研究進展

劉凱 張聿軻 冬梅 王建忠

1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010030 2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特010020

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種中老年人易患的以骨密度下降、骨質(zhì)量降低、骨微結(jié)構(gòu)退化為特征的全身骨代謝障礙性疾病[1]。2018年全國性流行病學調(diào)查結(jié)果顯示我國 50歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為19.2%[2]。OP發(fā)生主要是成骨細胞(osteoblast，OB)骨形成和破骨細胞(osteoclast，OC)骨吸收失衡，使骨量減少和(或)骨微結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致骨脆性增加、骨強度下降、皮質(zhì)骨變薄，進而發(fā)生病理性骨折[3]。目前，OP治療以藥物為主，通過減少骨吸收或增加骨形成治療OP[4]。然而效果并不理想，亟需新的治療干預(yù)措施。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)具有自我更新和分化為成骨細胞、脂肪細胞或軟骨細胞等的能力，被廣泛應(yīng)用于再生骨科[5]。通過促進BMSC成骨分化維持骨代謝平衡可改善骨密度，為OP治療提供了新策略[6]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一種長度超過200 nt無蛋白質(zhì)編碼能力的核糖核酸，與骨代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)，通過調(diào)控骨細胞增殖、分化、凋亡等細胞代謝途徑參與OP進程[7]。其中l(wèi)ncRNA分化拮抗非蛋白編碼RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)是維持表皮干細胞或成骨細胞未分化狀態(tài)所必需的分子，也是促進組織再生的潛在靶點[8]，可能作為潛在的生物靶點和臨床干預(yù)手段為OP的診斷與治療提供新視角。而DANCR調(diào)控BMSC成骨分化影響OP進程的機制尚未完全闡明。本文就DANCR在BMSC成骨分化中的作用及相關(guān)機制進行綜述，為探索DANCR作為診斷與治療OP的新分子靶點提供理論依據(jù)。

1 DANCR與BMSC成骨分化概述

DANCR編碼基因位于人類染色體4q12上，全長915 bp，在表皮祖細胞群體和分化細胞的研究中，其表達量在角質(zhì)形成細胞的終末分化過程中會顯著下調(diào)[9]。DANCR可在骨肉瘤等多種腫瘤中調(diào)節(jié)細胞增殖凋亡、遷移侵襲等細胞功能，是一種區(qū)分癌癥患者和健康人群診斷和預(yù)后的生物標志物[10]。同時，DANCR可能通過激活細胞自噬抑制血管平滑肌細胞的成骨分化來減輕動脈鈣化[11]。此外，DANCR也是牙齒組織來源的干細胞分化的調(diào)節(jié)因子，參與牙周韌帶干細胞 (periodontal ligament stem cells，PDLSC)等干細胞的成骨分化，對于牙齒組織再生修復(fù)具有重要的意義[12]。BMSC是一種存在于骨髓中的間充質(zhì)干細胞，因易從成體組織中分離且具有廣泛的增殖和分化成各種細胞譜系的能力作為主要研究對象，在維持正常骨穩(wěn)定方面起著重要作用。BMSC成骨分化受到抑制可導(dǎo)致骨形成減少，是OP重要發(fā)病因素之一。BMSC成骨分化的過程中受到眾多因素的影響，其中DANCR可以通過競爭內(nèi)源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)、作為轉(zhuǎn)錄輔助因子等機制調(diào)控BMSC成骨分化來參與OP的發(fā)生與發(fā)展，是OP診斷和治療的潛在手段[8]。

2 BMSC參與OP治療

在OP發(fā)展過程中，常伴有BMSC成骨成脂分化失衡，導(dǎo)致骨骼中OB的數(shù)量減少和質(zhì)量降低，骨髓脂肪增加，使得骨形成減少和骨微架構(gòu)受損，增加骨折和骨折愈合困難的風險[13]。抑制BMSC中Zust同源增強子2(EZH2)的活性或降低EZH2基因表達都可以導(dǎo)致脂肪生成減少和成骨增加，而抑制DANCR表達可作用于EZH2促進BMSC成骨分化[14]。表明靶向抑制DANCR表達在一定程度上可以恢復(fù)機體BMSC成骨成脂分化平衡，進而延緩OP的發(fā)生發(fā)展。BMSC移植在原發(fā)性與繼發(fā)性O(shè)P的治療中都具有明顯的效果。目前已有多項臨床前研究探討自體和異體BMSC移植在各種動物模型中的作用。在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的OP小鼠模型中注射同種異體的BMSC，基于供體BMSC在受體骨髓中定植和發(fā)揮作用可以促進OB的形成[15]。將自體 BMSC移植到卵巢切除術(shù)(Ovariectomy，OVX)兔模型中后，治療組骨連接增多，骨剛度增強，小梁厚度增加并且有新形成的類骨質(zhì)的顯微結(jié)構(gòu)[16]；在山羊絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)模型中也獲得了類似的效果[17]。動物模型研究表明，自體和異體BMSC移植在OP的治療方面有廣闊的前景。在臨床試驗中也有移植自體BMSC治療OP的研究。在西班牙圣母瑪利亞醫(yī)院以自體BMSC為干預(yù)的臨床試驗(注冊號：NCT 02566655，靜脈輸注巖藻糖基化骨髓間充質(zhì)細胞治療骨質(zhì)疏松癥)中，操作者在移植前30 d左右從患者體內(nèi)收集自體BMSC，培養(yǎng)擴增并進行巖藻糖化后靜脈注射到OP患者體內(nèi)。10例患者接受不同劑量注射，24個月后，用生化指標測量骨吸收等相關(guān)指標，測量骨密度并用組織形態(tài)學評估骨結(jié)構(gòu)[18]。然而，由于BMSC總數(shù)隨年齡增長而下降，使用自體BMSC治療老年患者OP存在一些不確定性，目前該臨床試驗尚未報告具體結(jié)果[19]。由此可見，增加正常BMSC含量或在分子水平靶向調(diào)控BMSC分化方向，刺激其向OB分化并合成新骨可能是治療OP的一種潛在方法。

3 DANCR調(diào)控BMSC成骨分化

OB和OC是骨組織細胞的主要成分，支撐著骨的主要代謝活動，二者代謝平衡對于OP有重要的影響。DANCR可以通過多途徑調(diào)控BMSC及OP相關(guān)細胞成骨分化影響OP的進程(表1、圖1)。同時，DANCR在其他多種間充質(zhì)干細胞成骨分化中也起到關(guān)鍵作用。

表1 DANCR調(diào)控OP相關(guān)細胞成骨分化的研究總結(jié)Table 1 Summary of studies on DANCR regulating osteogenic differentiation of OP related cells

圖1 DNACR調(diào)控成骨分化示意圖Fig.1 Schematic chart of osteogenic differentiation regulated by DANCR注：①～⑤代表DANCR通過多途徑影響細胞成骨分化，⑥代表DNACR影響破骨細胞生成。

3.1 調(diào)控miR-320a/CTNNB1/Wnt通路影響成骨分化

Wnt/β-catenin信號通路通過刺激OB生成和減少OC分化在骨穩(wěn)態(tài)中起重要作用，抑制Wnt/β-catenin信號通路可以減少成骨分化[20]。在成骨過程中，當Wnt信號被激活時，β-catenin的磷酸化被抑制，使β-catenin聚集并轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，進一步促進MSC中成骨細胞鈣化早期轉(zhuǎn)錄因子鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Osterix，Osx)及矮小相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2基因(Runt-related transcription factor 2，RUNX2)的表達，促進OB的早期分化[21]。編碼β-catenin蛋白的基因CTNNB1的異常表達是Wnt信號通路改變的常見原因，該分子與OP密切相關(guān)[22]。miR-320a在多種疾病中抑制CTNNB1的表達并調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路[23]。PMOP患者的BMSC中DANCR和miR-320a表達上調(diào)，CTNNB1表達下調(diào)。加入miR-320a抑制劑后可以激活Wnt/β-Catenin信號通路，增加BMSC中Runx2、Osx等的表達，加速成骨礦化。而在BMSC中過表達DANCR后，抵消了miR-320a抑制劑對成骨分化和β-catenin通路的激活作用。雖然DANCR和miR-320a的表達水平?jīng)]有相互影響，但過表達DANCR或miR-320a都降低了CTNNB1熒光素酶活性和β-catenin的表達，并且二者對于CTNNB1的影響存在協(xié)同效應(yīng)[24]。此外，通過敲除MC3T3-E1小鼠成骨細胞系中的DANCR基因可以激活經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路，增加Osx和Runx2等促分化相關(guān)標志物表達水平，促進成骨分化[25]。

3.2 調(diào)控p38/MAPK通路影響成骨分化

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)家族在細胞生理調(diào)節(jié)中起到重要作用，其激活是成骨分化的重要觸發(fā)因素，主要包含氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)和p38等MAPK分支通路[26]。MAPK家族可調(diào)控BMSC的分化、礦化和增殖[27]。激活MAPK通路可有效提高OB的活性并促進骨基質(zhì)的分泌與鈣化，利于機體骨形成[28]。在肝癌細胞中，DANCR可以通過海綿吸附作用調(diào)節(jié)miR-125b-5p并激活MAPK通路，從而促進肝癌細胞的增殖[29]。而沉默DANCR通過激活p38/MAPK信號通路抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[30]。比較未分化和成骨分化的BMSC中DANCR的差異表達譜發(fā)現(xiàn)，在成骨分化過程中，BMSC中DANCR的表達水平顯著降低[31]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在成骨補充培養(yǎng)液培養(yǎng)基中培養(yǎng)BMSC能增強ERK1/2、JNK和p38的磷酸化，但真核表達載體轉(zhuǎn)染細胞時，只有磷酸化p38的表達水平明顯降低，用p38特異性抑制劑處理真核表達載體轉(zhuǎn)染的BMSC后發(fā)現(xiàn)ALP活性與礦化基質(zhì)沉積被抑制，表明敲降DANCR可以通過p38/MAPK而非JNK/MAPK、ERK1/2/MAPK通路促進BMSC的成骨分化[31]。

3.3 調(diào)控miR-1301-3p/PROX1軸影響成骨分化

miR-1301-3p與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，在前列腺癌細胞和組織中顯著上調(diào)，促進前列腺癌干細胞的擴增[32]。最新研究發(fā)現(xiàn)，miR-1301-3p在細胞成骨分化的過程中也起到至關(guān)重要的作用。Circ8500可通過海綿吸附miR-1301-3p上調(diào)肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4，PADI4)的表達，促進成骨細胞基質(zhì)礦化[33]。此外，miR-1301-3p可以通過促進礦化來加速大鼠BMSC向OB的分化[34]。Prospero相關(guān)同源異形盒蛋白1 (prospero homeobox 1，PROX1)是一種轉(zhuǎn)錄因子，過表達后可誘導(dǎo)人類脂肪干細胞分化為淋巴管內(nèi)皮樣細胞[35]。多數(shù)據(jù)庫聯(lián)合生信分析后發(fā)現(xiàn)DANCR可調(diào)節(jié)多個與BMSC相關(guān)的 miRNA，其中miR-1301-3p在BMSC成骨分化的過程中逐漸上調(diào)。此外，PROX1蛋白表達水平在BMSC成骨分化的過程中逐漸降低，實驗表明DANCR在BMSC中起到了海綿吸附miR-1301-3p的作用。生信分析發(fā)現(xiàn)PROX1 mRNA可能是miR-1301-3p的靶標。DANCR過表達后增加了BMSC中PROX1蛋白表達水平，降低了ALP、Runx2和Osx等成骨標志物的水平，抑制了BMSC的成骨分化，但過表達miR-1301-3p可以逆轉(zhuǎn)這種效果，表明上調(diào)DANCR可以通過miR-1301-3p/PROX1軸抑制BMSC的成骨分化[36]。

3.4 調(diào)控EZH2和FOXO1影響成骨分化

EZH2和Fork box轉(zhuǎn)錄因子1(FOXO1)是DANCR的直接結(jié)合靶點。EZH2是參與轉(zhuǎn)錄抑制的轉(zhuǎn)錄因子，為影響B(tài)MSC成骨分化的關(guān)鍵因素[37]。在小鼠模型中，EZH2可通過作用于周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(cyclin-dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A)控制成骨過程中的骨形成和細胞周期[38]。FOXO1可通過減少氧化應(yīng)激和凋亡來恢復(fù)OB的分化和功能[39]。DANCR在PMOP小鼠體內(nèi)的表達升高，沉默DANCR后EZH2下調(diào)，而Runx2上調(diào)，同時增加了ALP活性和鈣沉積。DANCR能夠作為轉(zhuǎn)錄輔助因子將EZH2招募到Runx2基因啟動子上，通過抑制Runx2基因的表達進而抑制OB分化。此外，沉默DANCR可以促進PMOP的OB增殖分化以及骨樣細胞的形成[40]；在人胎兒成骨細胞系hFOB1.19中，下調(diào)DANCR后同樣發(fā)現(xiàn)Runx2基因的表達增加并促進了成骨分化[41]。FOXO1同樣可與Runx2啟動子相互作用以促進成骨分化[42]。FOXO1水平在BMSC成骨分化過程中逐漸上升，用RNA結(jié)合蛋白免疫實驗檢測DANCR與FOXO1的關(guān)聯(lián)性表明DANCR可與FOXO1直接結(jié)合。泛素化檢測結(jié)果表明，降低DANCR 基因表達可抑制S期激酶關(guān)聯(lián)蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，skp2)介導(dǎo)的FOXO1泛素化，導(dǎo)致Runx2表達水平下降從而抑制BMSC成骨分化[43]。

3.5 調(diào)控其他間充質(zhì)干細胞成骨分化

DANCR調(diào)控成骨分化的領(lǐng)域十分廣泛，除了BMSC，還可以調(diào)控多種干細胞成骨分化。如通過海綿吸附miR-1275調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13，MMP-13)的表達，參與滑液來源的間充質(zhì)干細胞的軟骨分化[44]。此外，DANCR是(SRY-related HMG-box 4，Sox4)的靶分子，Sox4可直接與編碼DANCR基因的啟動子結(jié)合并增加其表達，促進 SMSC軟骨分化，增加軟骨生成[45]。黃韌帶來源的間充質(zhì)干細胞(ligamentum flavum derived mesenchymal stem cells，LF-MSC)參與了黃韌帶鈣化的發(fā)生，可以增加黃韌帶中軟骨細胞含量和鈣沉積。DANCR表達水平下調(diào)可導(dǎo)致黃韌帶細胞增殖減少，但增強了LF-MSC的軟骨分化和鈣化[46]。下調(diào)DANCR可通過激活經(jīng)典的Wnt信號通路促進PDLSC成骨分化[47]。上調(diào)DANCR可通過海綿吸附miRNA-758靶向抑制Notch2-Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制PDLSC的成骨分化[12]。一項旨在評價PDLSC中DANCR水平表達的研究表明，降低DANCR可減少壓縮力通過OC形成和牙根吸收[48]。另一項研究指出創(chuàng)傷性壓應(yīng)力可以抑制MC3T3-E1成骨細胞系上DANCR的表達，從而激活NF-κB信號通路，最終導(dǎo)致成骨分化的抑制，與之前的結(jié)論存在分歧，該研究者推測這種差異可能與DANCR在不同物種中的不同生物學功能有關(guān)[49]。

4 DANCR是OP潛在的診斷及治療靶點

DANCR可以調(diào)控成骨分化的證據(jù)不僅存在于分子實驗，在臨床論證中也有相關(guān)性數(shù)據(jù)，表明其可能具有作為臨床診斷指標和治療新靶點的潛在價值。一項研究取30例PMOP婦女和20例非PMOP婦女的骨髓標本，發(fā)現(xiàn)PMOP組BMSC中DANCR水平高表達[24]。另一項研究取了44例骨折患者和24名健康體檢者的血清標本，發(fā)現(xiàn)骨折患者血清中DANCR高表達[25]。此外，DANCR在循環(huán)單核細胞中表達上調(diào)，在OP患者中增加其骨吸收活性，被確定為PMOP的潛在生物標志物[50]。隨著醫(yī)學檢驗技術(shù)不斷進步，或可通過檢測血液、骨髓等標本中DANCR水平診斷OP。

芝麻素是一種從花椒植物中分離而來的木脂素，是芝麻油中的一種常見成分(約含0.25%)。天然芝麻素為右旋體，芝麻素也可通過人工合成，有作為藥物量產(chǎn)的潛力，具有較高的醫(yī)用價值[51]。芝麻素既可通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路影響細胞凋亡，也可通過調(diào)節(jié)MAPK、Wnt/βcatenin等信號通路促進 BMSC成骨分化，同時可通過抑制NF-κB通路抑制OC生成，在OP、OA及激素性股骨頭壞死等骨科疾病中起到重要的作用[52-54]。OVX小鼠血清中DANCR水平升高，芝麻素治療后OVX小鼠股骨遠端松質(zhì)骨顯微結(jié)構(gòu)明顯改善，且OVX引起升高的血清DANCR水平也被降低。DANCR是芝麻素介導(dǎo)的骨形成和吸收的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，芝麻素可通過下調(diào)DANCR表達激活Wnt/β-catenin信號通路，進一步促進成骨分化；也可通過抑制IκBα磷酸化和NF-κBp65核易位抑制NF-κB信號通路，從而抑制破骨細胞的形成，表明芝麻素以一種DANCR依賴的方式在OB激活和OC細胞失活中發(fā)揮雙重功能作用，且DNACR可能具有作為OP治療靶點潛力[55]。

5 總結(jié)和展望

OP是一種常見的全身性骨骼疾病，主要特征是骨組織微結(jié)構(gòu)損壞和骨量減少，進而引起骨脆性及骨折風險的增加，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。BMSC移植及靶向治療是OP的熱門研究方向。DNACR既可以通過影響Wnt/β-catenin、MAPK等信號通路以及作用于多種轉(zhuǎn)錄因子促進BMSC成骨分化，又可以通過抑制NF-κB信號通路從而抑制破骨細胞形成，通過維持骨代謝平衡參與OP進程。整體來看，DANCR在BMSC的成骨分化過程中起到負向調(diào)控的作用，從臨床樣本實驗來看，DANCR具有作為OP診斷標志物的潛在能力，同時有望在未來參與靶點藥物治療OP的精準醫(yī)療。然而，由于DANCR在疾病和組織中表達具有廣泛性，在臨床診斷和治療中特異性較低，且有關(guān)DNACR與OP的研究尚處于起步階段，具體調(diào)控通路交互復(fù)雜，尚有諸多問題有待進一步探討。