骨癆愈康丸通過(guò)JAK3/STAT3信號(hào)通路對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠炎癥反應(yīng)的影響

李金益 宋敏,2* 田杰祥,2 王凱 范凱

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，甘肅 蘭州 730000

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是好發(fā)于手、足等小關(guān)節(jié)以關(guān)節(jié)滑膜炎性改變、血管翳生成、軟骨與骨破壞為主要病理表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全揭示[1]。RA病情纏綿難愈，治療周期長(zhǎng)，發(fā)病率高，如不能及時(shí)治療，會(huì)引起關(guān)節(jié)畸形、功能喪失，最終導(dǎo)致殘疾。RA的治療尚無(wú)特效藥物能有效治愈，因此尋求高效、安全、經(jīng)濟(jì)的治療手段是風(fēng)濕病學(xué)界研究的重要方向。中醫(yī)藥在RA的防治中療效確切、安全性高，具有良好的應(yīng)用前景。骨癆愈康丸是甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院研制的院內(nèi)制劑，以補(bǔ)腎通絡(luò)法為治則研制，具有補(bǔ)腎活血、通絡(luò)止痛的功效，已在臨床使用數(shù)十年，在緩解RA癥狀、改善患者的生活質(zhì)量方面療效確切。前期研究[2-3]表明，骨癆愈康丸能夠降低相關(guān)細(xì)胞因子水平來(lái)抑制全身炎癥反應(yīng)，保護(hù)關(guān)節(jié)，增加骨密度，有效改善患者病情，但具體作用機(jī)制尚未闡釋清楚。因此，本研究通過(guò)建立CIA大鼠模型，觀察骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)腫脹度和踝關(guān)節(jié)軟骨及滑膜組織中JAK3/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從JAK3/STAT3信號(hào)通路角度探討骨癆愈康丸對(duì)RA的干預(yù)機(jī)制，以期為骨癆愈康丸防治RA的進(jìn)一步研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物：選取SPF級(jí)Wistar大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量(220±20)g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(甘)2020-0001，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)于溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(50±10)%環(huán)境，每日光照時(shí)間12 h，自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，文件批號(hào)：2021-002。骨癆愈康丸(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，60 g/480丸，甘藥制備字：Z20190001000)。

1.1.2試劑及儀器設(shè)備：酪氨酸激酶抑制劑AG490(MCE 批號(hào)：65923)；牛Ⅱ型膠原蛋白(Bovine Type Ⅱ Collagen 批號(hào)：190078)；完全弗氏佐劑(Freund’s Adjuvant Complete，Sigma，批號(hào)：LB29884)；ELISA試劑盒；HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120)；BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司，批號(hào)：PC0020)；SP-9001兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(廠家：中杉金橋)；TRIeasyTMTotal RNA Extraction Reagent(YESEN，貨號(hào)：10606ES60，批號(hào)：HB170809)；HifairⅢ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus)(YESEN，貨號(hào)：11123ES60，批號(hào)：H11255080)；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix(High Rox)(YESEN，貨號(hào)：11203ES08，批號(hào)：H4104640)。高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf，型號(hào)：5424R)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Rad公司，型號(hào)：iMark)；恒溫培養(yǎng)箱(上海精宏設(shè)備公司，型號(hào)：DNP-9022)；包埋機(jī)(上海精宏設(shè)備公司，型號(hào)：101-1AB)；切片機(jī)(德國(guó)，型號(hào)：LEICA2016)；臺(tái)式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：101-1AB)；顯微鏡(Leica DM2500)；NanoDrop核酸濃度測(cè)量?jī)x(美國(guó)Thermo，型號(hào)：ND-ONE-W)；實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Thermo，型號(hào)：StepOne Plus)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組:將60只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和造模制備組(50只)。除正常對(duì)照組外，將其他各組大鼠制備成CIA模型[4]。將牛Ⅱ型膠原蛋白和完全弗氏佐劑按1∶1比例在冰浴環(huán)境下充分混合，使用勻漿器充分搖勻，產(chǎn)生最終濃度為1 mg/mL的混合乳劑。對(duì)每只大鼠背部脊柱兩側(cè)、尾根部多點(diǎn)行皮下注射，每只大鼠注射混合乳劑0.3 mL，促使背部和尾根部發(fā)生致敏反應(yīng)。初次免疫1～2周后，再對(duì)每只大鼠尾根部及雙后足足墊分別注射0.1 mL混合乳劑加強(qiáng)免疫，2周后模型制備完成。采用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI)評(píng)分評(píng)估模型大鼠炎性反應(yīng)情況[5]，觀察大鼠雙后足，按0～4級(jí)進(jìn)行評(píng)分，AI≥2提示造模成功。將模型制備成功大鼠隨機(jī)分為4組：CIA組、GL組、GL+AG490組、AG490組。

1.2.2干預(yù)方法：參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[6]，根據(jù)人和大鼠計(jì)量折算系數(shù)確定給藥量。AG490組與GL+AG490組給予足背靜脈注射配制好的酪氨酸激酶抑制劑AG490(劑量為1 mL/只)，GL組和GL+AG490組給予骨癆愈康丸506 mg/(kg·d)灌胃。Control、CIA、AG490組給予同體積0.9 %生理鹽水灌胃。灌胃4周后取材。

1.2.3指標(biāo)檢測(cè)

1.2.3.1關(guān)節(jié)組織病理學(xué)觀察：取大鼠左側(cè)踝關(guān)節(jié)，用乙醇棉球消毒關(guān)節(jié)區(qū)域，逐層分離皮膚、肌肉組織，暴露踝關(guān)節(jié)，解剖關(guān)節(jié)軟骨和滑膜，用4 %多聚甲醛固定。運(yùn)用蘇木精-伊紅染色法將滑膜組織進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、染色，光鏡下觀察軟骨和滑膜病理變化。

1.2.3.2血清生化指標(biāo)檢測(cè)：于末次灌胃后，各組大鼠禁食不禁水24 h，通過(guò)腹腔注射1 %戊巴比妥鈉麻醉大鼠，行“三線定位法”心臟采血[7]。取血后，在4 ℃下以3 000 r/min離心20 min，按照ELISA試劑盒規(guī)范檢測(cè)各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量水平。

1.2.3.3免疫組化法檢測(cè)JAK3、STAT3的蛋白表達(dá)：取大鼠踝關(guān)節(jié)，消毒，取出所需軟骨和滑膜組織，固定，石蠟包埋切片，貼片。免疫組化染色，石蠟切片脫蠟和水化，自來(lái)水沖洗2次，PBS洗5 min ×3次；修復(fù)，3%的過(guò)氧化氫孵育15 min；加一抗，37 ℃復(fù)蘇35 min，PBS洗5 min ×3次；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min ×3次；加三抗，37 ℃孵育30 min；PBS洗5 min ×3次；DAB顯色8 min，鏡下觀察，蘇木素復(fù)染，室溫，60 s，自來(lái)水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

1.2.3.4RT-PCR法檢測(cè)JAK3、STAT3mRNA的表達(dá)：取大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)，消毒，逐層分離皮膚、肌肉、剝離出軟骨和滑膜組織，-80 ℃保存。分別研磨軟骨和滑膜組織提取總RNA，運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)，其引物序列如表1。結(jié)果采用2-△△CT法分析數(shù)據(jù)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠足趾厚度的影響

造模完成后，大鼠雙后足足趾及踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫等炎癥反應(yīng)。與Control組相比，CIA、GL、GL+AG490、AG490組大鼠右足足趾厚度顯著增厚(P<0.05)；經(jīng)過(guò)4周灌胃治療之后，GL、GL+AG490、AG490組大鼠右足足趾厚度逐漸降低(P<0.05)；其中，GL+AG490組改善最為明顯。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠右足足趾厚度的比較

2.2 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量的影響

與Control組相比，CIA、GL、GL+AG490、AG490組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量顯著升高(P<0.05)；與CIA組相比，GL、GL+AG490、AG490組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量明顯降低(P<0.05)。其中，GL+AG490組最為明顯(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-17含量的比較

2.3 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織病理學(xué)的影響

各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜病理切片HE染色顯示，Control組軟骨層發(fā)育正常，厚度均勻，軟骨細(xì)胞形狀呈圓形，排列規(guī)則，滑膜表面光滑無(wú)增生，無(wú)炎性浸潤(rùn)，染色均一，組織結(jié)構(gòu)完整；CIA組軟骨層變薄，部分軟骨細(xì)胞核染色較輕，出現(xiàn)組織缺損，軟骨細(xì)胞減少，滑膜增厚，細(xì)胞體積增大且炎性浸潤(rùn)明顯，組織排列紊亂；GL組軟骨層大部分缺損，但細(xì)胞排列疏松，分布散亂，染色較深，滑膜表面光滑，增生較少，細(xì)胞排列整齊；GL+AG490組軟骨層厚度均勻，軟骨細(xì)胞較多，排列較均勻緊密，滑膜變薄，滑膜細(xì)胞減少，排列趨向整齊，染色趨向均一；AG490組組織損傷，細(xì)胞較疏松，軟骨層稍厚，滑膜層細(xì)胞較少，排列均勻，結(jié)構(gòu)完整，無(wú)增生，表面光滑。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化(HE染色，×200)Fig.1 Histopathological changes in the joints of rats in each group (HE staining, ×200)

2.4 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織JAK3、STAT3蛋白表達(dá)的影響

免疫組化法檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組相比，CIA組軟骨和滑膜中JAK3、STAT3蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；經(jīng)治療后，GL、GL+AG490、AG490組軟骨和滑膜中JAK3、STAT3蛋白表達(dá)由不同程度的降低(P<0.05)。其中，GL+AG490組效果最為明顯。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中JAK3、STAT3蛋白表達(dá)比較

免疫組化結(jié)果顯示，Control組軟骨和滑膜中陽(yáng)性細(xì)胞較少，著色較淺；CIA、GL、GL+AG490、AG490組軟骨和滑膜中陽(yáng)性細(xì)胞由不同程度的增多。與Control組相比，CIA組軟骨和滑膜中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,著色較深；經(jīng)治療，GL、GL+AG490、AG490組軟骨和滑膜中陽(yáng)性細(xì)胞減少,著色較淡。其中，GL+AG490組軟骨滑膜中陽(yáng)性細(xì)胞減少最為明顯。見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)JAK3蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.2 The effect of Gulao Yukang Pills on the expression of JAK3 protein in the joints of model rats (×400 )

圖3 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)STAT3蛋白表達(dá)的影響(×400)Fig.3 The effect of Gulao Yukang Pills on the expression of STAT3 protein in the joints of model rats (×400)

2.5 骨癆愈康丸對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中JAK3、STAT3mRNA表達(dá)的影響

與Control組相比，CIA組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中JAK3、STAT3mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與CIA組相比，GL、GL+AG490、AG490組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中JAK3、STAT3mRNA表達(dá)顯著降低，其中GL+AG490組降低最為明顯(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨和滑膜組織中JAK3、STAT3mRNA表達(dá)比較

3 討論

RA是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，屬于中醫(yī)“痹證”范疇，《素問(wèn)·痹論》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也。”其中寒、濕二邪在RA發(fā)病過(guò)程中尤為重要。寒性收引凝滯，阻滯經(jīng)脈，氣血痹阻，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)冷痛、僵硬；濕性重濁黏滯，阻礙氣血，運(yùn)行不暢，表現(xiàn)為肢體疼痛重著。寒濕夾雜，而致RA病情反復(fù)，纏綿難愈?！稘?jì)生方·痹》曰：“皆因體虛，腠理空虛，受風(fēng)寒濕氣而成痹也?！敝赋稣龤馓撊鯙镽A發(fā)生的根本原因；《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問(wèn)·直解》曰：“痹，閉也，血?dú)饽凉恍幸?。”說(shuō)明瘀為RA對(duì)關(guān)節(jié)破壞的關(guān)鍵因素[8]。祖國(guó)醫(yī)學(xué)[9]認(rèn)為多虛多瘀是RA特點(diǎn)，腎虛為本、血瘀為標(biāo)，以補(bǔ)腎通絡(luò)法為更本治療法則。基于此治則研制骨癆愈康丸，本方由鹿角霜、全蝎、肉桂、蜈蚣、龜板、黃芪、雞血藤、三七、阿膠、炮姜、清風(fēng)藤、甘草、大棗組成，具有補(bǔ)腎活血、通絡(luò)止痛之功效。骨癆愈康丸在減輕RA患者臨床癥狀、改善骨質(zhì)破壞、延緩病情發(fā)展等方面有獨(dú)特的療效[10]。

Janus激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路(janus kinase-signal transducer and activator of transcription，JAK/STAT)作為應(yīng)激的炎癥信號(hào)通路在RA炎癥反應(yīng)中有著重要的調(diào)節(jié)作用，與關(guān)節(jié)軟骨和滑膜聯(lián)系尤為密切，在RA的發(fā)病過(guò)程中有著重要影響，是近年來(lái)對(duì)于介導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面研究較多的信號(hào)通路[11-12]。Janus激酶(JAK)是一類細(xì)胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶，通過(guò)與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)的相互作用，在細(xì)胞因子受體信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用。JAK3/STAT3信號(hào)通路與多種免疫性炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，廣泛參與RA關(guān)節(jié)滑膜組織增生、血管翳形成、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程[13]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)[14]認(rèn)為RA的發(fā)病機(jī)制與免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、B細(xì)胞等)和細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α等)密切相關(guān)，細(xì)胞因子刺激關(guān)節(jié)滑膜組織，誘發(fā)炎癥反應(yīng)。TNF-α、IL-6、IL-17等促炎細(xì)胞因子在RA的發(fā)病機(jī)制中有著至關(guān)重要的作用。TNF-α通過(guò)激活靶細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)并且與IL-6協(xié)同刺激B細(xì)胞和T細(xì)胞，促使分泌細(xì)胞免疫球蛋白，促使RA的發(fā)生；IL-17在RA的發(fā)展過(guò)程中一直處于較高水平，推動(dòng)RA病情的發(fā)展[15-16]。JAK3作為JAK/STAT信號(hào)通路的重要組成部分，在免疫性疾病的發(fā)展過(guò)程中一直扮演著重要的角色，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和抗炎作用，JAK3功能紊亂或缺失會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞免疫功能的喪失[17]。STAT3作為RA發(fā)病的起關(guān)鍵致病因子，具有抑制成纖維細(xì)胞的凋亡、促進(jìn)血管生成的作用。STAT3功能紊亂會(huì)促進(jìn)RA滑膜細(xì)胞增殖、血管翳生成、炎癥反應(yīng)加劇，進(jìn)一步損害關(guān)節(jié)軟骨[18]。

本研究結(jié)果顯示，與CIA組相比，GL、GL+AG490組通過(guò)4周骨癆愈康丸灌胃治療，模型大鼠關(guān)節(jié)畸形程度減輕，活動(dòng)度增加，能夠明顯降低模型大鼠足趾腫脹度，有效緩解RA的癥狀；同時(shí)能夠顯著降低模型大鼠血清中促炎因子水平，減輕RA對(duì)關(guān)節(jié)的炎性刺激。通過(guò)病理切片顯示，經(jīng)過(guò)骨癆愈康丸的治療，模型大鼠關(guān)節(jié)軟骨侵蝕減輕、滑膜細(xì)胞減少、滑膜層變薄，有效減輕了RA對(duì)關(guān)節(jié)滑膜和軟骨侵蝕與破壞，具有保護(hù)關(guān)節(jié)的作用。經(jīng)免疫組化與RT-PCR實(shí)驗(yàn)分析得出骨癆愈康丸能夠有效下調(diào)JAK3、STAT3蛋白及mRNA的表達(dá)，抑制JAK3/STAT3信號(hào)通路的激活，與JAK受體酪氨酸激酶抑制劑AG490具有相同的作用。

綜上所述，骨癆愈康丸可能通過(guò)抑制TNF-α、IL-6、IL-17的表達(dá)來(lái)降低誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，抑制激活JAK3蛋白，進(jìn)而阻斷與STAT3的激活與磷酸化，降低STAT3蛋白活性，抑制RA的進(jìn)一步發(fā)展。骨癆愈康丸可能通過(guò)下調(diào)JAK3、STAT3蛋白及mRNA表達(dá)，參與JAK/STAT信號(hào)通路的調(diào)控，從而減輕RA對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的侵蝕、抑制滑膜增生、減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。這可能是骨癆愈康丸防治RA的機(jī)制之一，但具體分子生物學(xué)機(jī)理仍需更深入的研究。