天然產(chǎn)物法卡林二醇與人類GABAA受體相互作用的機制

沈 琦， 陳海瑤， 高登輝， 趙 熹， 那日松， 劉 佳， 黃旭日

（1. 吉林大學(xué)理論化學(xué)研究所, 長春 130061； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 鄭州 450046）

神經(jīng)退行性疾病是大腦和脊髓的細(xì)胞神經(jīng)退行性變形、 丟失而導(dǎo)致的疾病. 如帕金森、 阿爾茲海默癥、 癲癇和亨廷頓舞蹈癥等均為神經(jīng)退行性疾病， 主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能和運動功能的下降. 神經(jīng)退行性疾病的致病因素有很多（如氧化應(yīng)激、 蛋白質(zhì)異常聚集、 炎性機制、 線粒體功能障礙和遺傳等）且致病機制尚不明確， 病程不可逆轉(zhuǎn). 目前， 全球約有4000多萬人受到神經(jīng)退行性疾病的影響， 隨著全球老齡化人口的增多， 這一數(shù)字還會繼續(xù)增加. 所以， 開發(fā)出安全有效的治療神經(jīng)退行性疾病的藥物是目前亟需解決的問題. 相關(guān)研究表明， 多種神經(jīng)退行性疾病均與神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛表達(dá)的γ-氨基丁酸A型（Gamma-aminobutyricacid， GABAA）受體的功能紊亂有關(guān)， GABAA受體是許多神經(jīng)類藥物作用的靶點［1～5］. GABAA受體是五聚體配體門控氯離子通道半脫氨酸（Cys）超家族的一員， 屬于神經(jīng)遞質(zhì)受體.廣泛存在于神經(jīng)元突觸、 突觸外緣或神經(jīng)元膜的突觸外部分， 其內(nèi)源性配體為GABA分子， 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)［6，7］. GABA分子與GABAA受體結(jié)合后將激活受體， 使其通道開放， Cl-從細(xì)胞外流向細(xì)胞內(nèi)， 引起神經(jīng)元的超極化從而抑制神經(jīng)元興奮. 因此， GABAA受體是許多治療神經(jīng)性系統(tǒng)疾病藥物（如鎮(zhèn)靜劑、 助眠劑、 麻醉劑和抗驚厥藥物等）的作用靶點， 在平衡興奮性信號中起著基礎(chǔ)性的作用［8，9］. GABAA受體一般包含19個不同的亞基， 共計8類（α1-6，β1-3，γ1-3，δ1，ε1，φ1，π1和ρ1-3）. 人腦中存在較為豐富的GABAA受體亞基為α，β和γ組成的五聚體， 通常以2個α1， 2個β2和1個γ2為組合形成α1β2γ2［10］. GABAA受體鑲嵌于磷脂膜中， 整個受體可分為胞外結(jié)構(gòu)域（Extracellulardomain， ECD）和跨膜結(jié)構(gòu)域（Transmembranedomain， TMD）， 每個亞基的胞外結(jié)構(gòu)域包含一個N端α螺旋、 10個β鏈和多個“Loop區(qū)”， 其中Loop A， B， C在亞基上定義為“+”， Loop D， E， F定義為“-”［11，12］.跨膜結(jié)構(gòu)域由4個α螺旋（M1～M4）和一個可變長度的細(xì)胞質(zhì)環(huán)構(gòu)成. 五聚體的5個M2螺旋構(gòu)成受體離子通道， 9'位置的亮氨酸及-2'位置的丙氨酸和脯氨酸為通道的門控， 在藥物結(jié)合后會選擇性地打開或關(guān)閉［13，14］. 研究發(fā)現(xiàn)， 聚乙炔醇化合物都可以作用于GABAA受體［15］. 聚乙炔分布廣泛且種類多， 主要存在于食用植物、 真菌和海藻等. 聚乙炔化合物的研究從20世紀(jì)60年代中期開始受到重視， 大量研究者對人參中的聚乙炔醇化合物進(jìn)行了深入研究. 隨著對聚乙炔醇化合物的深入研究， 來自不同種植物的聚乙炔醇化合物也相繼被報道［16］， 它們都可以對GABAA受體［17～21］產(chǎn)生作用. Uwai等［22］曾研究過多種聚乙炔醇化合物與GABAA受體的作用， 如菊苣毒素（Cicutoxin）、 大菊毒素（Isocicutoxin）、 維羅爾A， B和C（Virol A， B和C）、 人參炔醇（Falcarinol）和法卡林二醇（Falcarindiol）等. 綜合目前已有的實驗研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)聚乙炔醇化合物在結(jié)構(gòu)上較為相似， 以17個碳骨架為主， 具有π鍵共軛體系、 烯丙基和羥基官能團， 這些結(jié)構(gòu)特點對聚乙炔醇化合物的活性具有直接的影響［23～25］. 法卡林二醇分子FAD［Falcarindiol（3R8S）］是一種天然的聚乙炔醇化合物， 存在于人參、 傘形科和芹菜科的許多藥用和食用植物中， 法卡林二醇已被證明有抗炎、 抗癌特性［26，27］.

研究表明， 法卡林二醇分子對GABAA受體具有一定的調(diào)節(jié)作用［22］， 但其作用機制尚不明確. 本文采用分子動力學(xué)模擬和相應(yīng)的分析方法， 研究了法卡林二醇和GABAA受體的作用位點及作用機制， 為開發(fā)天然藥物、 研究聚乙炔醇化合物與GABAA受體的作用機制提供了理論依據(jù).

1 實驗部分

1.1 常規(guī)動力學(xué)模擬

GABAA受體的亞基有多種組合， 選擇了人體內(nèi)含量最豐富的GABAA受體亞型α1β2γ2， 從PDB（ProteinDataBank）庫下載編號為6X40的晶體結(jié)構(gòu). 結(jié)構(gòu)文件由5條亞基組成， 每個亞基大約含有340個殘基， 總殘基數(shù)共17812個原子， 刪除不需要的結(jié)晶水分子和其它輔助結(jié)晶的雜分子. 法卡林二醇分子的幾何參數(shù)和三維（3D）構(gòu)型通過Gaussian 09程序［28］在6-31+G（d）基組和B3LYP方法下進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化， 法卡林二醇分子是電中性的， 通過能量最小化獲得穩(wěn)定的構(gòu)象.

采用FTMap服務(wù)器［29］來確定GABAA受體的潛在結(jié)合位點， 對整個蛋白界面進(jìn)行全局搜索尋找有利于特定探針結(jié)合的區(qū)域， 不同探針分子（乙醇、 異丙醇、 異丁醇、 丙酮、 乙醛、 二甲醚、 環(huán)己烷、 乙烷、 乙腈、 尿素、 甲胺、 苯酚、 苯甲醛、 苯、 乙酰胺和N，N-二甲基甲酰胺共16種分子）的重疊域被定義為共同位點， 最大的共同位點被預(yù)測為蛋白結(jié)合界面最重要的位點. 這種方法相比于目前流行預(yù)測方法（GRID， CAVITY和MCSS等）可以避免許多假陽性的結(jié)合位置.

通過AutoDockVina1.1.2［30］進(jìn)行位點對接， 中心網(wǎng)格框的坐標(biāo)由預(yù)測的結(jié)合位點確定. 網(wǎng)格間距為0.1 nm， 尺寸為24×24×24的盒子， 使用評分函數(shù)的隨機全局優(yōu)化來將配體對接到可能的結(jié)合位點進(jìn)行初步識別. 在每個預(yù)測位點生成了10個配體模型， 根據(jù)給出的結(jié)合自由能和分子構(gòu)象選出最優(yōu)的對接情況.

對處理好的晶體結(jié)構(gòu)采用PROPKA3.1程序［31］進(jìn)行質(zhì)子化處理， 在pH=7.0時確定了蛋白質(zhì)氨基酸殘基的狀態(tài). 采用InflateGRO2程序［32］將其嵌入由512個POPC脂質(zhì)（1-棕櫚酰-2-油酰基磷脂酰膽堿）分子構(gòu)成的雙層膜中. 脂質(zhì)分子位于xy平面. 蛋白質(zhì)分子垂直于脂質(zhì)雙分子平面， 能量最小化后最終移除了63個脂質(zhì)分子達(dá)到平衡狀態(tài). 模擬基于GROMOS54a7力場［33］使用SPC顯性溶劑模型， 由27個氯離子平衡系統(tǒng)電荷. 體系首先經(jīng)過1000步能量最小化消除原子間的不合理接觸， 然后進(jìn)行100 ps正則系綜（NVT）模擬， 系統(tǒng)溫度升至300 K. 后續(xù)進(jìn)行1 ns恒溫恒壓（NPT）模擬， 保持在300 K和1×105Pa大氣壓， 整個過程施加周期邊界條件， 所有鍵使用LINCS（LinearConstraintSolver）算法［34］. 范德華相互作用截斷半徑為1.2 nm， 長程靜電相互作用使用PME（ParticleMeshEwald）方法［35］， 在NPT系綜下進(jìn)行200 ns的分子動力學(xué)模擬. 所有模擬均在GROMACS2018.8軟件包［36］中進(jìn)行， 采用VMD［37］和PyMOL［38］軟件包對模擬軌跡和結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化處理. 法卡林二醇分子的拓?fù)湮募葾TB服務(wù)器［39］得到.

1.2 傘形采樣模擬

采用傘形采樣模擬來探究不同位點對氯離子進(jìn)入通道能量值的變化. 使用拉伸分子動力學(xué)和加權(quán)直方分析法（WHAM）. 選取200 ns常規(guī)動力學(xué)的最后一幀蛋白結(jié)構(gòu)， 將氯離子置于蛋白通道質(zhì)心， 選擇“Umbrella”拉伸方式， 拉伸方向為“Direction”， 沿z軸方向進(jìn)行牽引. 對于拉伸速率和牽引力常數(shù)的選擇進(jìn)行多組實驗. 最終選擇拉伸速率為0.01 nm/ps， 牽引力常數(shù)為1000 kJ·mol-1·nm-2的情況. 在整個跨膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)拉伸距離為4 nm， 每隔0.05 nm選取一個窗口， 共選取了80個窗口. 進(jìn)行7組實驗（GABAA蛋白晶體、 只加入GABA分子、 加入FAD-2～FAD-6復(fù)合物）， 對取樣的每個窗口先進(jìn)行500 ps的NPT預(yù)平衡， 最終1 ns的傘形模擬， 共計進(jìn)行了720 ns的傘形模擬， 且在重疊情況不好的區(qū)域進(jìn)行了補點. 拉伸速率設(shè)置為0， 對氯離子施加較大的限制力， 以保證每個窗口受體和離子的相對位置.

2 結(jié)果與討論

2.1 GABAA 受體與法卡林二醇分子的對接情況

根據(jù)位點預(yù)測和分子對接得到的結(jié)果如圖1（A）和（B）所示， 法卡林二醇的分子結(jié)構(gòu)如圖2所示，將法卡林二醇在GABAA受體上的7種狀態(tài)分別標(biāo)記為FAD-1～FAD-7. FAD-1位于胞外亞基γ2+/β2-之間， FAD-2在胞外亞基α1+/γ2-之間， 是經(jīng)典苯二氮卓類藥物的位點［40］， FAD-3位于胞外亞基α+/β-之間， 是乙醇［41］和吡唑并喹啉藥物的位點. FAD-4則是在GABA分子結(jié)合的正構(gòu)位點1（β2+/α1-）偏下方區(qū)域. 在跨膜結(jié)構(gòu)域提供了3個位點， FAD-5和FAD-6分別在β2+/α1-亞基之間， 這兩個位點是依托咪酯［42］和丙泊酚等［43］藥物結(jié)合的位置； FAD-7則在通道孔徑處， 是非競爭性拮抗劑苦毒素［44］的結(jié)合位點， 起到阻塞通道的作用.

Fig.1 Seven sites of falcarindiol binding to GABAA receptors

Fig.2 Molecular structure of falcarindiol

2.2 傘形采樣模擬法卡林二醇對氯離子通過通道的影響

對于GABAA受體蛋白， 這里對跨膜區(qū)螺旋的氨基酸進(jìn)行了序列對比（圖3）， 發(fā)現(xiàn)3個亞基上的氨基酸大多都是保守的， 其中M2螺旋上的-2'和9'位置是通道的門控， 負(fù)責(zé)通道的打開和關(guān)閉. 本文將重點關(guān)注-2'到9'位置螺旋的變化.

Fig.3 Comparison of amino acid sequences of helices in the transmembrane region

為了進(jìn)一步確定結(jié)合在不同位點的法卡林二醇對受體的作用， 將氯離子置于蛋白通道的中心， 整個螺旋通道長度約為4 nm， 隨后進(jìn)行拉伸分子動力學(xué)和傘形采樣模擬計算氯離子通過通道的平均力勢（PMF），再結(jié)合WHAM分析. 其中， FAD-7處于通道內(nèi)起阻塞作用， 已確定為拮抗劑， 未進(jìn)行實驗. 所以7組實驗包括不同位點FAD-2～FAD-6的復(fù)合物、 只含GABA分子的復(fù)合物及單獨GABAA蛋白晶體.

由圖4（A）可見， 加入GABA分子的受體在2 nm后氯離子通過的能量值相對于單獨GABAA蛋白的情況明顯降低， 說明GABA分子的加入有利于氯離子通過， GABA分子對GABAA受體可以產(chǎn)生激活作用， 但通常需要激動劑來影響受體， 進(jìn)而促進(jìn)GABA分子和受體結(jié)合， 單獨使用GABA只會產(chǎn)生較弱的作用［45］. FAD-2～FAD-4的PMF值均高于單獨GABAA蛋白， 說明這3個位點的法卡林二醇不利于氯離子通過通道， 且從門控9'位置（1 nm）開始能量明顯升高. 圖4（B）中FAD-5和FAD-6氯離子通過通道的能量值均高于單獨GABAA蛋白， 且FAD-5有一些突出的峰值， 說明法卡林二醇的存在對螺旋的運動產(chǎn)生影響， 使氯離子進(jìn)入通道的某些位置能量值更高一些. 而FAD-6整體數(shù)值相對較平緩. 通過PMF圖像數(shù)據(jù)趨勢， 發(fā)現(xiàn)幾個位點都是不利于氯離子通過， 說明法卡林二醇對GABAA受體起到拮抗作用.

Fig.4 Calculated PMF of chloride ions through GABAA receptor helical channels of FAD-2—FAD-4 GABAA protein and GABA-only molecular complexes(A) and FAD-5—FAD-6 GABAA protein and GABA-only molecular complexes(B)

進(jìn)一步驗證了法卡林二醇對受體的拮抗作用. 若是激活劑則利于GABA分子與受體結(jié)合， 且β2亞基上的Loop C會包裹住GABA分子， 整個亞基逆時針運動. 若是拮抗劑則不利于GABA分子與受體結(jié)合， 且Loop C傾向于打開的狀態(tài)， 未對GABA分子進(jìn)行束縛. 在模擬只有GABA分子存在的復(fù)合物時，發(fā)現(xiàn)位點2的GABA分子在200 ns內(nèi)一直與受體保持結(jié)合狀態(tài)， 而位點1的GABA分子在30 ns后脫離了受體， 這與相關(guān)研究［13］中關(guān)于位點2的親和力大于位點1的結(jié)果一致. GABA分子分別與β2亞基上的Glu155， Thr202和α1亞基上Arg67形成氫鍵作用， 周圍的疏水氨基酸主要為Phe200和Phe65［圖5（A）］.

Fig.5 Interaction of GABA and surrounding amino acids at site 2

分析了法卡林二醇在位點FAD-2～FAD-7的復(fù)合物受體200 ns軌跡里結(jié)合GABA分子的情況， 主要分析了GABA正構(gòu)位點2的情況， 因為其親和力較位點1強， 更具說服力. 結(jié)果列于表1， 可見， 這幾個復(fù)合物中GABA分子在位點2停留的時間都比位點1長， 且GABA分子沒有一直停留在某個位點. 其中， FAD-4和FAD-6在位點2的GABA分子停留時間相對于其它幾個復(fù)合物要長， 但最終都離開了受體， 說明法卡林二醇在這幾個位點不利于GABA分子與受體的結(jié)合， 沒有起到激活作用.

Table 1 GABA and FAD-2—FAD-6 GABA molecular residence time

分析了受體上GABA分子位點2的β2亞基Loop C區(qū)域關(guān)閉、 打開狀態(tài)， 通過測量β2亞基上的Ser201殘基的Ca原子和α1亞基上殘基Leu128的Ca原子之間的距離變化來判斷［圖5（B）］， 其中， 灰色為只含GABA分子的亞基， 藍(lán)色和綠色分別為含有法卡林二醇分子的β亞基和α亞基， 黑色箭頭表示Loop C有打開的趨勢.

位點2原子間距離隨時間變化的結(jié)果如圖6所示， 發(fā)現(xiàn)只有GABA分子存在時原子間的距離基本保持在1 nm附近， 模擬軌跡里觀察到位點2的GABA分子也一直存在， 原子間距離變近說明Loop C有關(guān)閉的趨勢. FAD-2～FAD-7受體位點2的原子間距離相對于單獨GABA分子存在情況都有變大的趨勢， 且原子間距離變化和位點2 GABA分子停留時間基本保持一致.

Fig.6 Distance between the CA atom of residue Ser201 on the β2 subunit Loop C and the CA atom of residue Leu128 on the α1 subunit at site 2 of the GABA molecule over time

通過以上分析， FAD-2～FAD-7位點受體上GABA分子停留時間較短和兩亞基上殘基CA原子之間距離變大， 說明Loop C傾向于打開， 便于GABA分子離開GABAA受體. 再次說明法卡林二醇在這幾個位點不利于受體結(jié)合GABA分子， 模擬過程中GABA分子相繼脫離受體， 未激活受體而是起到拮抗作用.

2.3 不同結(jié)合位點的復(fù)合物整體穩(wěn)定性分析

上述分析確定胞外區(qū)和跨膜區(qū)的位點對GABAA受體均起到拮抗作用， 對GABAA蛋白晶體、 只含GABA分子復(fù)合物以及法卡林二醇在上述7個位點與GABAA受體的復(fù)合物（GABA分子均存在的條件下）進(jìn)行模擬， 共9組結(jié)構(gòu)， 每組進(jìn)行200 ns， 共計1.8 μs的分子動力學(xué)模擬. 得到蛋白質(zhì)的均方根偏差（RMSD）和均方根漲落（RMSF）， 結(jié)果見圖S1（見本文支持信息）. 圖S1（A）， （C）和（E）為9組實驗蛋白體系Cα原子的RMSD在200 ns內(nèi)的變化范圍， 可以看出基本穩(wěn)定在0.3 nm左右. 由圖S1（A）明顯看出， 加入GABA分子整體趨于更穩(wěn)定的狀態(tài). 圖S1（C）中FAD-1～FAD-4前100 ns的RMSD值還處于上升狀態(tài)， 其中FAD-3相對于其它3個位點有著更穩(wěn)定的RMSD. 圖S1（E）中FAD-5～FAD-7在約20 ns以后基本都保持平穩(wěn)的RMSD， 說明在模擬過程中法卡林二醇在跨膜區(qū)相比于胞外區(qū)可以使蛋白整體趨于更平穩(wěn)的狀態(tài).

圖S1（B）， （D）和（F）給出了9組實驗蛋白體系Cα原子的RMSF變化. 由圖S1（B）可見， 加入GABA分子后受體的Loop 區(qū)氨基酸殘基波動減弱， 說明GABA分子的加入穩(wěn)定了GABAA受體. 圖S1（D）中在100號殘基附近和350號殘基附近波動較大， 這些殘基恰好在FAD-4所在位置旁的兩個亞基上. 其它位點氨基酸沒有明顯變化. 圖S1（F）中3個位點殘基整體沒有太大波動， FAD-5的1～700號氨基酸整體波動明顯， 這些氨基酸是位于此位點旁的β2亞基和α1亞基上. FAD-6顯示在1200號殘基附近有波動，此位置的殘基位于FAD-6旁的α1亞基的胞外區(qū). 說明此處法卡林二醇可能會對胞外區(qū)的氨基酸運動產(chǎn)生影響. 在FAD-7中350號附近、 400號和1000號附近的氨基酸殘基位于胞外區(qū)且有較大的波動， 說明法卡林二醇結(jié)合GABAA受體后影響了胞外區(qū)氨基酸運動. 通過幾組復(fù)合物RMSD和RMSF圖分析，發(fā)現(xiàn)法卡林二醇在不同的位點均能與GABAA受體較好地結(jié)合， 且位于跨膜結(jié)構(gòu)域的FAD-5～FAD-7的位點復(fù)合物整體穩(wěn)定性較好.

2.4 結(jié)合自由能

采用gmx_MMPBSA方法［46］對法卡林二醇在受體上的7個位點進(jìn)行了結(jié)合自由能（ΔGbind）計算. 結(jié)果列于表2， FAD-1在胞外區(qū)的γ2+/β2-亞基之間， 多數(shù)藥物均未結(jié)合在此位點， 而且相比于其它位點結(jié)合自由能特別小， 說明其與受體結(jié)合穩(wěn)定性較差， 所以， 暫未考慮此位點. 胞外區(qū)FAD-2～FAD-4的結(jié)合自由能相對于跨膜區(qū)略小， 尤其是FAD-2結(jié)合自由能比胞外區(qū)的另外兩個位點大， 所占據(jù)的是苯二氮卓類藥物的位點， 這類藥物通常具有激活、 變構(gòu)調(diào)節(jié)GABAA受體的作用， 溫度和熵變的乘積(TΔS)， 跨膜區(qū)3個位點FAD-5～FAD-7與胞外區(qū)FAD-2～FAD-4的位點變化不大［47］. 跨膜區(qū)的FAD-5～FAD-7具有更大的結(jié)合自由能， 其中非極性相互作用（ΔGnonpolar）是主要的能量貢獻(xiàn)， 為范德華作用(ΔEvdw)與非極性去溶劑化自由能(ΔGSA)之和, 且ΔEvdw占主導(dǎo)地位. 跨膜區(qū)3個位點FAD-5～FAD-7相比于胞外區(qū)FAD-2～FAD-4的靜電相互作用(ΔEele)變小， 極性溶劑化自由能（ΔGPB）也變小.

Table 2 Free energy of falcarindiol binding at FAD-1—FAD-7 sites on the GABAA receptor*

2.5 結(jié)合位點的氫鍵和疏水作用

為了進(jìn)一步分析法卡林二醇分子在不同位點的結(jié)合能力， 對結(jié)合位點的氫鍵作用和疏水作用進(jìn)行了分析， 采用VMD分析100～200 ns內(nèi)氫鍵占有率（見本文支持信息圖S2）. 由圖S2（A）可見， FAD-2主要與γ2亞基上Asp75， Arg144， Asn60和α1亞基上His102殘基形成了氫鍵相互作用， 且與Asp75結(jié)合的氫鍵占有率達(dá)到了98.02%. FAD-3主要與α1亞基上His102， Lys156和β2亞基上Glu182， Ser46殘基形成氫鍵作用. FAD-4主要與α1亞基上Asp184， Arg187， Asp63和β2亞基上Glu153， Lys102殘基形成氫鍵作用. 這3個位點都在胞外區(qū)， 氫鍵占有率普遍高于跨膜區(qū)的3個位點， 這也證實了FAD-2～FAD-4的結(jié)合自由能分解項里ΔEele項占主導(dǎo)地位.

圖S2（B）中跨膜區(qū)的3個位點中FAD-5的氫鍵占有率較大， 主要與β2亞基上Asn265， Thr262，Met261和α1亞基上Thr265殘基形成氫鍵相互作用， 且結(jié)合自由能分解項中FAD-5的靜電相互作用也是大于跨膜區(qū)的另外兩個位點. FAD-6主要與β2亞基上Asn265， Arg269和α1亞基上Thr265殘基形成氫鍵作用. FAD-7主要與γ2亞基上Ser267， Ala264和β2亞基上Thr256， Ala252殘基形成氫鍵作用. 通過氫鍵占有率分析發(fā)現(xiàn)， 這幾個位點的法卡林二醇能與周圍氨基酸形成較好的氫鍵相互作用. 除了分子本身存在兩個羥基官能團， 也說明了法卡林二醇在這幾個位點能和GABAA受體穩(wěn)定結(jié)合.

圖S3（見本文支持信息）給出了6個位點與周圍氨基酸殘基的疏水相互作用， 圖S3（A）～（C）是位于胞外區(qū)的3個位點FAD-2～FAD-4， 從疏水作用圖中可以看到法卡林二醇主要是和亞基上“+”（Loop A，B， C）部分上的殘基形成疏水相互作用， 而亞基上“-”（Loop D， E， F）部分的疏水相互作用較小. 也就說明法卡林二醇主要和亞基胞外區(qū)上的“+”所在部分的氨基酸形成疏水相互作用. 由圖S3（D）～（F）可見， 跨膜區(qū)的3個位點FAD-5～FAD-7與周圍氨基酸形成了較強的疏水作用， 這也證實其自由能中范德華相互作用占主導(dǎo).

位點FAD-5和FAD-6周圍共有的疏水氨基酸有Met286， Phe289， Met236和Pro233， 說明這兩個位點在β2和α1兩個亞基間的位置基本一致， 但是分子構(gòu)象不同導(dǎo)致略有差別. FAD-5位點法卡林二醇更接近于螺旋M3和M4， 且分子本身有朝外的趨勢， FAD-6位點法卡林二醇接近于M1和M2螺旋更朝向蛋白通道內(nèi)部. FAD-7位點與周圍5個亞基上的氨基酸都形成了相互作用， 由于此位點的特殊性屬于通道阻塞劑， 結(jié)合自由能最大， 說明這個位點對受體而言是拮抗劑且結(jié)合狀態(tài)穩(wěn)定.

FAD-5和FAD-6的位置均在β2和α1亞基之間， 這兩個亞基也是胞外區(qū)的GABA分子所在的位點，已有研究表明， 受體上GABA分子的兩個位點并不是對稱的［48］. 主要是由于周圍亞基順序不同， 因此從這方面單獨考慮位點.

2.6 通道孔徑變化及螺旋運動趨勢

為了進(jìn)一步選擇結(jié)合較好的位點， 通過Cluster分析FAD-2～FAD-6復(fù)合物在200 ns里的軌跡， 選取最大聚類的代表性結(jié)構(gòu)， 采用HOLE程序進(jìn)行通道孔徑分析， 主要關(guān)注5個亞基的M2螺旋組成的通道部分（圖7）. 可見， 9'位置亮氨酸Leu與-2'位置丙氨酸Ala和脯氨酸Pro組成通道門控. 由圖7（A）可見， 9'位置和-2'位置通道較窄. 由圖7（B）可見， FAD-5位點處整個通道相比于只含GABA分子的情況變得更窄（顏色顯示了通道的寬度， 綠色表示通道變得更窄）. 由圖7（C）可見， FAD-6處9'和-2'之間通道也是明顯變窄， FAD-5和FAD-6不僅通道變窄， 而且跨膜螺旋也具有較大的變形， 所以導(dǎo)致整個通道有彎曲的趨勢. 其它幾個胞外區(qū)的位點在分析通道和螺旋變化時， 沒有觀察到明顯的變化， 因此將關(guān)注重點放在了跨膜結(jié)構(gòu)域位點及其螺旋的變化上.

Fig.7 Changes in the radius of the M2 helical channel of the GABAA receptor channel

對FAD-5～FAD-7的受體跨膜螺旋變化情況進(jìn)行分析， 觀察了幾個位點的跨膜螺旋變化情況. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， FAD-5～FAD-7相對于單獨使用GABA分子的情況有順時針的扭轉(zhuǎn)趨勢（見本文支持信息圖S4）.如圖S4（A）～（C）所示， 灰色螺旋為單獨使用GABA分子， 彩色部分為FAD-5和FAD-6的螺旋部分， 藍(lán)色箭頭所指為法卡林二醇的位置， 藍(lán)色圓形為通道內(nèi)法卡林二醇的位置. 可見， 跨膜區(qū)的3個位點都使螺旋有順時針轉(zhuǎn)動的趨勢. FAD-5螺旋順時針轉(zhuǎn)動的趨勢較FAD-6和FAD-7更明顯. 而其它幾個在胞外區(qū)的位點沒有觀察到螺旋明顯的變化. 由圖S4（D）可見， 法卡林二醇存在時胞外亞基彩色部分相對于只含GABA分子的灰色部分也有順時針的變化， 并且兩個GABA分子位點的Loop C有明顯的打開. 這種變化趨勢與GABAA受體激活劑的情況相反， 再次說明跨膜區(qū)位點對GABAA受體起到拮抗作用.

通過Bio3D程序包［49］， 對運動軌跡中跨膜螺旋殘基自身運動相關(guān)性進(jìn)行分析， FAD-5～FAD-7和只含GABA分子的受體跨膜螺旋氨基酸殘基運動相關(guān)性如圖S5（見本文支持信息）所示. 紅色表示氨基酸殘基之間呈現(xiàn)正相關(guān)運動， 藍(lán)色表示氨基酸殘基之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)運動. 對角線區(qū)域表示殘基自身運動且相關(guān)性較高. FAD-5中在1～100號氨基酸和500～600號氨基酸正相關(guān)運動較明顯， 1～100號氨基酸對應(yīng)為β2螺旋， 500-600號氨基酸對應(yīng)γ2螺旋. FAD-6中跨膜螺旋氨基酸運動相關(guān)性不是很明顯， 在500～600號氨基酸γ2螺旋上有一些正相關(guān)的運動. FAD-7中在α1螺旋400～500號氨基酸運動相關(guān)性較為明顯，γ2螺旋550～600號氨基酸也存在一些正相關(guān)運動. 只含GABA分子的螺旋自身殘基運動相關(guān)性較高外， 其它氨基酸的運動相比于含法卡林二醇的情況藍(lán)色加深， 更加趨于負(fù)相關(guān)運動. 通過跨膜螺旋殘基運動相關(guān)性對比， 發(fā)現(xiàn)含有法卡林二醇分子和只含GABA分子的氨基酸有著相反的運動趨勢.

為了確定法卡林二醇分子的存在對跨膜區(qū)氨基酸運動的影響， 又對FAD-5～FAD-7和只含GABA分子的受體M2螺旋氨基酸運動軌跡中曲率變化進(jìn)行了分析， 結(jié)果如圖8（A）～（D）所示. 通過對比含有法卡林二醇和只含GABA分子的情況， 發(fā)現(xiàn)FAD-5和FAD-6中β2亞基和γ2亞基上氨基酸殘基運動發(fā)生變化， FAD-7中γ2亞基的運動較為明顯. 氨基酸殘基的曲率變化結(jié)合之前β亞基上Loop C的打開和跨膜結(jié)構(gòu)域螺旋順時針運動， 推斷這是法卡林二醇與跨膜結(jié)構(gòu)域螺旋上氨基酸殘基相互作用使其運動發(fā)生變化， 導(dǎo)致亞基之間相互驅(qū)動使螺旋順時針轉(zhuǎn)動， 進(jìn)而帶動胞外區(qū)的Loop C發(fā)生順時針轉(zhuǎn)動呈打開的趨勢， 便于GABA分子脫離受體.

Fig.8 Changes in curvature of residues on the M2 helix of the GABAA

3 結(jié) 論

對GABAA受體上7個法卡林二醇的位點進(jìn)行了結(jié)合自由能計算， 通過對氫鍵相互作用和周圍疏水性殘基相互作用、 傘形采樣模擬計算氯離子進(jìn)入通道的能量變化以及法卡林二醇對GABA分子結(jié)合受體及受體螺旋構(gòu)象變化的影響等分析， 確定了法卡林二醇在GABAA受體上存在的穩(wěn)定結(jié)合位點， 有效位點是跨膜螺旋上β2亞基和α1亞基的兩個位點及通道內(nèi)的一個位點， 這些位點均對受體起到拮抗作用. 本研究為后續(xù)天然產(chǎn)物中聚乙炔醇類化合物治療相關(guān)神經(jīng)類疾病提供了理論依據(jù).

支持信息見http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20220500.

感謝吉林大學(xué)理論與計算化學(xué)實驗室在計算方面的支持.