框架核酸高通量檢測芯片

宋 璐， 張舒陽， 王麗華， 左小磊， 李 敏

（1. 中國科學院上海應用物理研究所物理生物學實驗室, 中國科學院界面物理與技術(shù)重點實驗室,上海 201800； 2. 中國科學院大學, 北京 100049；3. 上海交通大學醫(yī)學院分子醫(yī)學研究院, 上海市核酸化學與納米醫(yī)學重點實驗室, 上海200127）

核酸檢測是一種預防和診斷傳染病的重要手段， 如廣泛使用核酸檢測來監(jiān)測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的流行病學分布情況［1～3］. 此外， 基因過度表達、 表達不足以及基因突變與多種疾病相關［4～6］. SARS-CoV-2感染的臨床急性時期， 在唾液和鼻咽拭子等臨床樣本中可檢測到病毒RNA. 由于在感染SARS-CoV-2病毒的第4天左右病毒載量達到峰值， 在感染后的前5天內(nèi)完成病毒RNA的檢測是實現(xiàn)病毒檢測的關鍵， 因此實現(xiàn)對大規(guī)模人群的及時檢測需要高通量、 操作簡單的檢測技術(shù). 目前，臨床檢驗中的核酸檢測大多數(shù)基于實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR）技術(shù)， 然而傳統(tǒng)實時熒光定量PCR需要嚴格控制樣品制備的溫度， 且存在技術(shù)復雜、 檢測時間緩慢、 設備維護昂貴、 需要專業(yè)人員和檢測通量較低等局限， 遠不能滿足高通量核酸檢測的需求， 限制了分子生物學臨床轉(zhuǎn)化的發(fā)展［7～13］.

2019年新冠疫情爆發(fā)以來， 核酸檢測的需求量與日俱增［14］. 隨著“15 min核酸采樣圈”等常態(tài)化核酸檢測措施的發(fā)布， 亟需建立完善、 高效運轉(zhuǎn)的核酸檢測系統(tǒng). 為了提高檢測效率， 核酸檢測通常采用混采樣本進行檢測， 一個大型中心實驗室的核酸檢測日產(chǎn)能為10～15萬管， 而對于千萬級以上人口城市來說， 仍然不能滿足核酸檢測常態(tài)化的需求. 近年來， 高通量測序等技術(shù)的快速發(fā)展為高通量核酸檢測提供了多種重要的技術(shù)平臺［15～19］. 高通量測序一次可以實現(xiàn)對幾十萬條DNA分子的序列測定，憑借其高通量和測序快的優(yōu)勢可以提供豐富的核酸序列信息， 而且顯著縮短了檢測時間［20，21］. 目前，高通量測序已經(jīng)成為組學研究的主要技術(shù)， 廣泛用于基因組分析和轉(zhuǎn)錄組分析［22，23］. Koren課題組［24］從數(shù)千個單細胞的全基因組測序結(jié)果中分析DNA復制現(xiàn)象， 揭示了DNA復制起始時間的可變性； Wrana課題組［25］從臨床樣本中提取RNA， 并進行高通量測序， 證實了高通量測序用于大規(guī)模監(jiān)測SARS-CoV-2的可行性. 然而， 高通量測序用于核酸檢測仍有很多問題需要解決： 測序數(shù)據(jù)量龐大導致儲存和分析困難以及操作過程繁瑣使其難以應用于臨床診斷.

具有大規(guī)模、 高通量分析能力的生物檢測微陣列芯片， 極大地促進了生物分析領域的發(fā)展. 制備高性能生物檢測芯片的關鍵在于識別探針在生物芯片上的固定. 目前， 研究人員發(fā)展了表面修飾和生物分子固定化的策略， 用于制備高性能的生物檢測微陣列芯片［26，27］. 然而， 這些研究仍然無法解決空間位阻、 靜電相互作用和探針的空間排布等問題. DNA納米技術(shù)能夠自下而上地構(gòu)建可控性好、 精密度高的DNA納米結(jié)構(gòu)， 已廣泛應用于結(jié)構(gòu)制造和傳感領域［28］. 其中， 三維的、 具有正四面體結(jié)構(gòu)的框架核酸由于具有較好的剛性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性， 被廣泛應用于界面上固定生物分子［29］. 該框架核酸結(jié)構(gòu)可以將連接的探針以特定的方向固定在傳感界面上， 從而以特定的方向捕獲生物分子， 實現(xiàn)探針捕獲效率的最大化.

本文構(gòu)建了基于框架核酸（FNA）的探針， 發(fā)展了一種集成了超微量移液自動化平臺和高通量基因芯片掃描儀的高通量生物微陣列檢測芯片. 利用框架核酸在界面上對探針的調(diào)控能力， 預先將檢測探針固定在框架核酸基底上， 利用超微量移液自動化平臺對生物微陣列芯片進行編程， 從而驅(qū)動框架核酸探針在生物芯片上的高通量自動分配. 探針捕獲核酸靶標后， 利用集成基因芯片掃描儀對該芯片進行成像， 每個包含不同濃度核酸靶標的生物芯片微陣列的熒光強度與靶標濃度具有較好的線性相關性， 而基于單鏈探針的生物芯片微陣列的熒光強度遠低于框架核酸生物芯片微陣列. 因此構(gòu)建的框架核酸高通量生物檢測芯片能夠簡單、 準確和快速地實現(xiàn)對核酸靶標的高通量檢測， 從而推動分子生物學臨床轉(zhuǎn)化的發(fā)展［30，31］.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

基因芯片點樣液， 北京博奧生物有限公司； 實驗所用其它試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司. 框架核酸探針自組裝溶液為 TM buffer［20 mmol/L Tris+50 mmol/L MgCl2， pH=8.0， 用Millipore系統(tǒng)的Milli-Q超純水（18 MΩ·cm電阻）配制］； 聚丙烯凝膠電泳緩沖液為1×TBE［購于生工生物工程（上海）股份有限公司， pH=7.4］； 洗滌液為1×PBS［購于生工生物工程（上海）股份有限公司， pH=7.4］和PBST（1×PBS+體積分數(shù)0.5%的Tween20， pH=7.4）； 封閉液為1×PBS與體積分數(shù)25%乙醇混合液配制的2.5 mg/mL NaBH4溶液， pH=7.4.

DNA鏈由生工生物工程（上海）股份有限公司合成， 序列如表1所示.

Table 1 Sequences of DNA

晶芯光學級醛基基片購于北京博奧生物有限公司； Agilent Cary 100型紫外分光光度計（美國Agilent Technologies公司）； 聚丙烯酰胺凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司， 041BR167315）； Amersham Imager 680型化學發(fā)光儀（美國CTL公司）； GE AKTA Pure型蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)（美國通用電氣醫(yī)療公司）； Nano-Plotter NP2.1型超微量移液自動化平臺［儀智科技（上海）有限公司］； GenePix 4100A型微陣列基因芯片掃描儀（美國Molecular Devices公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 框架核酸探針的設計、 合成及表征 參照文獻［32］方法合成以框架核酸為基底的探針. 先用Q-H2O溶解粉末狀DNA單鏈， 測定DNA單鏈在260 nm處的紫外吸收值； 利用Lambert-Beer定律， 將單鏈DNA濃度定量為100 μmol/L并置于4 ℃儲存?zhèn)溆? 將合成框架核酸探針所需的4條DNA單鏈等比例混合， 用TM buffer配成終濃度為10 μmol/L的DNA單鏈混合溶液. 將混合溶液置于95 ℃ 10 min后， 迅速置于4 ℃降溫20 min， 即可得到框架核酸探針納米結(jié)構(gòu). 利用AKTA純化系統(tǒng)， 對得到的納米結(jié)構(gòu)進行純化得到框架核酸探針.

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）驗證結(jié)構(gòu)的形成： 將制備的框架核酸納米結(jié)構(gòu)和單鏈、 兩條鏈、三條鏈的雜交產(chǎn)物對照結(jié)構(gòu)在8% PAGE中進行跑膠， 條件為85 V和1.5 h， 然后將凝膠在Gel-red水溶液中染色15 min， 最后用成像儀成像.

1.2.2 高通量生物檢測芯片的制備 用超微量移液平臺將框架核酸探針打印在生物芯片上進行成像.首先， 將15 μmol/L框架核酸探針用點樣液稀釋至10 μmol/L， 將混合液加在超微量移液平臺的樣品臺上. 然后， 對超微量移液平臺進行初始化處理， 并設定打印命令， 經(jīng)過37 min的準備后， 超微量移液平臺即可用于高通量打印框架核酸探針.

1.2.3 核酸靶標的高通量檢測 檢測芯片的處理流程如下： 將打印了探針微陣列的生物芯片在室溫下置于70%濕盒中固定10 h， 用PBST洗滌液沖洗2次、 PBS洗滌液沖洗1次； 然后用封閉液在室溫下封閉20 min， 使用PBST洗滌液沖洗2次、 PBS洗滌液沖洗1次. 將修飾有Cy3熒光團的不同濃度核酸靶標在室溫下與探針孵育2 h， 再用PBST洗滌液沖洗2次、 PBS洗滌液沖洗1次后自然晾干， 在微陣列基因芯片掃描儀中進行成像. 使用微陣列基因芯片掃描儀和Image J軟件對成像結(jié)果進行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 框架核酸探針的表征

為了實現(xiàn)核酸靶標的高通量檢測， 利用氨基和醛基的縮合反應在生物檢測微陣列芯片上打印了框架核酸探針（圖1）. 將組成框架核酸探針的4條鏈按物質(zhì)的量之比為1∶1混合、 退火， 形成了框架核酸探針. 首先， 采用聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證框架核酸結(jié)構(gòu)的形成. 如圖2所示， 框架核酸結(jié)構(gòu)與其它幾種未全部加入4條鏈的結(jié)構(gòu)相比遷移速率較慢， 證明框架核酸探針已合成［33］.

Fig.1 Schematic illustration of high-throughput microarray detection platform

Fig.2 Formation of FNA probes

2.2 框架核酸探針在生物芯片上的高通量組裝

所設計的框架核酸探針能夠通過堿基互補配對作用精準捕獲靶標， 而探針的距離可以利用框架核酸結(jié)構(gòu)在納米尺度上精確調(diào)控［34］. 為了驗證框架核酸探針在生物芯片上的高通量組裝， 基于氨基與醛基基片的共價結(jié)合作用， 將框架核酸的3個頂點修飾氨基用于探針在芯片界面的固定， 另外1個頂點延伸的探針上修飾了Cy3熒光分子用于熒光測定. 如圖3（A）所示， 超微量移液自動化平臺將修飾了Cy3的框架核酸探針均勻打印在生物芯片上， 在一張75 mm×25 mm的芯片上打印了4800個點， 每個點的直徑為270 μm. 因此可以實現(xiàn)4800種核酸靶標的同時檢測， 遠高于目前發(fā)展的基于鏈置換的ELISA高通量檢測技術(shù)（96種核酸靶標）［35］和基于無機聚合物的液滴微陣列檢測芯片（196種核酸靶標）［36］等技術(shù).經(jīng)統(tǒng)計， 打印100個點所用時間僅為55 s， 因此應用超微量移液自動化平臺24 h即可打印157092個點［圖3（B）］. 將此芯片用于核酸檢測， 一臺超微量移液自動化平臺工作24 h檢測通量與一間大型中心實驗室的日檢測通量相當， 而引入幾臺超微量移液自動化平臺即可應對核酸檢測更高通量的需求. 相比中心實驗室的大型儀器， 超微量移液自動化平臺進入工作狀態(tài)前的流程也相對簡單， 只需要37 min的準備時間［圖3（C）］.

Fig.3 Assembly of probes onto microarray platform

2.3 高通量微陣列檢測平臺的性能評估

為了進一步規(guī)范化現(xiàn)行核酸檢測工作， 國家衛(wèi)生健康委員會對核酸檢測的標本管理、 實驗室檢測等工作提出了新要求， 以保證檢測質(zhì)量、 提高檢測效率. 其中， 要求檢測臨床樣本前需對擴增試劑、 擴增儀等檢測系統(tǒng)進行必要的性能驗證， 包括精密度、 重現(xiàn)性及最低檢測限等參數(shù). 同樣地， 為了將高通量核酸檢測方法推廣至臨床應用， 對框架核酸探針、 超微量移液系統(tǒng)及高通量成像系統(tǒng)進行了性能驗證. 在超微量移液系統(tǒng)中執(zhí)行打印10×10點陣的命令， 將帶有Cy3熒光團的框架核酸探針均勻打印在生物芯片上. 首先， 分析了該10×10點陣中每個點的平均熒光強度值， 如圖4（A）所示， 這100個點的平均熒光強度值均約為300 a.u.， 用式（1）計算出100個點平均熒光強度值的變異系數(shù)（CV， %）為3.30%， 遠低于微陣列生物芯片點樣儀技術(shù)要求的國家標準（CV≤10%）.

式中：n為測定的點數(shù)；i為測定的序號，i=1～n；Xi為每個點的實測值；為1～n次的算術(shù)平均數(shù). 該結(jié)果說明超微量移液系統(tǒng)能夠保證打印框架核酸探針的一致性. 接下來， 隨機選取10個點， 分析其內(nèi)部的熒光強度值［圖4（B）］， 在每個點內(nèi)隨機選取的5個區(qū)域的熒光強度值相近， 最大偏差僅為4.12%，說明尺寸均一的框架核酸能夠調(diào)控探針在打印范圍內(nèi)均勻分布.

Fig.4 Performance of high-throughput nucleic acids detection platform

陣列規(guī)整度是衡量超微量移液系統(tǒng)性能的另一標準. 因此， 測量了相鄰打印點中心位置的間距，圖4（C）和（D）分別統(tǒng)計了100個點與相鄰點的行、 列間距， 發(fā)現(xiàn)點陣內(nèi)行、 列間距平均值為500 μm， 點間距離相對偏差W分別小于4%和10%， 同樣滿足微陣列生物芯片點樣儀技術(shù)要求的國家標準（W≤10%）. 以上結(jié)果說明， 此高通量核酸檢測方法能夠滿足重現(xiàn)性的要求.

2.4 基于高通量微陣列檢測平臺的核酸檢測

在生物芯片上組裝框架核酸探針微陣列后， 評估了該生物芯片捕獲核酸靶標的性能. 首先， 制備了2種微陣列， 使用單鏈探針和框架核酸探針分別與相同濃度的Cy3熒光團標記的核酸靶標進行雜交，熒光成像圖如圖5（A）所示， 發(fā)現(xiàn)基于框架核酸探針的微陣列顯示出比單鏈探針微陣列更強的熒光信號. 定量結(jié)果表明， 其熒光強度值為單鏈探針微陣列的105倍［（7855.6±256.8） a.u.vs. （74.8±3.7） a.u.］.這說明錨定在框架核酸頂點的探針特異性捕獲靶標的數(shù)量是單鏈探針的105倍. 基于上述結(jié)果， 認為框架核酸在生物芯片上的高度有序排列， 使得錨定在其頂點的探針以間距均勻、 方向一致的狀態(tài)排列在芯片微陣列中； 而線性的單鏈探針則以混亂的狀態(tài)排布， 導致與靶標的雜交效率大大降低.

Fig.5 Performance of FNAs-based probe microarrays for targets sensing

隨后， 檢測了一系列不同濃度的靶標（10 pmol/L～1 μmol/L）， 以評估框架核酸探針微陣列對核酸靶標的檢測性能. 由圖5（B）可見， 隨著靶標濃度的增加， 熒光信號逐漸增加. 通過定量分析熒光信號值發(fā)現(xiàn)， 熒光強度值與靶標濃度具有良好的線性關系， 對數(shù)線性擬合方程為y=0.29x+（5.81±0.25），R2為0.982. 圖中虛線表示Blank+3SD=911.66 a.u.， 因此該框架核酸探針微陣列對核酸靶標的檢出限為100 pmol/L. 空白基于框架核酸探針的生物微陣列檢測芯片不僅具有較寬的動態(tài)檢測范圍， 而且可以識別低至100 pmol/L的核酸靶標.

3 結(jié) 論

基于框架核酸探針構(gòu)建了一種具有自動均勻分配探針能力的高通量生物檢測微陣列芯片， 該平臺通過編程指令， 即可實現(xiàn)探針在生物芯片上的高通量自動分配. 這種基于框架核酸的高通量檢測芯片可顯著提高核酸檢測的速度和效率， 芯片上點陣的間距（W≤10%）和熒光強度（CV=3.30%）具有較高穩(wěn)定性， 能夠滿足當前核酸檢測的常態(tài)化需求. 將該高通量檢測芯片用于核酸靶標檢測， 檢出限低至100 pmol/L， 有望推動分子生物學臨床轉(zhuǎn)化的發(fā)展. 然而在實際臨床應用中， 高通量微陣列檢測芯片仍然具有一些局限性. 首先， 臨床中不同個體的基因表達模式具有異質(zhì)性， 這進一步增加了核酸檢測的難度， 因此在應用微陣列檢測芯片時要保證采樣的一致性， 使采樣過程標準化. 其次， 在芯片生產(chǎn)、 探針雜交和圖像量化等過程中容易產(chǎn)生較大的差異性， 進而阻礙微陣列生物檢測芯片臨床轉(zhuǎn)化的發(fā)展，因此需要發(fā)展標準化流程來減少各個流程中的不穩(wěn)定因素.