活性氧簇調(diào)控破骨細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

張家勝 王劍 郁婷婷

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心遺傳分子診斷科，上海 200127

骨骼是人體運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)最重要的組成部分。在人體整個(gè)生命周期中，骨骼通過(guò)嚴(yán)格調(diào)控舊骨吸收和新骨生成的平衡來(lái)維持骨重塑穩(wěn)態(tài)。破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨吸收，是控制骨重塑的關(guān)鍵細(xì)胞，對(duì)維持骨穩(wěn)態(tài)平衡至關(guān)重要[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎第7天左右，紅細(xì)胞髓系祖細(xì)胞出現(xiàn)在卵黃囊造血島，并分化為集落刺激因子1受體(colony stimulating factor 1 receptor, CSF1R)陽(yáng)性卵黃囊巨噬細(xì)胞，可作為破骨細(xì)胞的前體[3]。出生后，這些前體細(xì)胞逐漸被造血干細(xì)胞來(lái)源的單核細(xì)胞前體所取代，并相互融合，部分也與長(zhǎng)期存活的紅細(xì)胞髓系祖細(xì)胞來(lái)源的破骨細(xì)胞合胞體反復(fù)融合，形成多核破骨細(xì)胞[4]。破骨細(xì)胞分化成熟是發(fā)揮骨吸收功能的前提，其分化過(guò)程受多種因子調(diào)控。

研究顯示，活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)是破骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程中關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子[5]，對(duì)破骨細(xì)胞分化具有重要的調(diào)控作用，針對(duì)ROS清除的抗氧化劑可抑制破骨細(xì)胞分化成熟[6-9]。本文就ROS調(diào)控破骨細(xì)胞分化成熟的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為溶骨亢進(jìn)型疾病如骨質(zhì)疏松癥等提供更廣泛的治療思路。

1 破骨細(xì)胞分化過(guò)程中ROS的產(chǎn)生與清除

ROS是氧氣轉(zhuǎn)化為水的過(guò)程中氧化還原反應(yīng)的中間產(chǎn)物，包括氧自由基和非自由基氧化劑。氧自由基包括超氧陰離子(·O2ˉ)和羥基(·OH)等。非自由基氧化劑包括過(guò)氧化氫(H2O2)、臭氧(O3)和高反應(yīng)性脂質(zhì)或碳水化合物衍生的羰基化合物等[10]。

細(xì)胞內(nèi)ROS主要在線粒體和細(xì)胞膜上產(chǎn)生。在氧化磷酸化過(guò)程中，線粒體活性氧簇 (mitochondrial ROS, mtROS)主要通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的電子傳遞鏈產(chǎn)生。例如，·O2ˉ是通過(guò)線粒體呼吸鏈復(fù)合物Ⅰ的異咯秦半醌(FAD)、泛醌、復(fù)合物Ⅲ的細(xì)胞色素b566、輔酶Q等還原輔酶或輔基將單個(gè)電子轉(zhuǎn)移到氧分子上而產(chǎn)生的[11]。細(xì)胞膜上ROS的生成主要由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NOX)介導(dǎo)。NOX由多個(gè)蛋白亞基組合而成，位于質(zhì)膜上的亞基被激活后，磷酸化并招募胞內(nèi)亞基，形成有活性的NOX復(fù)合體。激活的NOX復(fù)合體直接從煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)向游離氧分子轉(zhuǎn)移電子，生成ROS[12-13]。

在NOX家族的7個(gè)成員中，破骨細(xì)胞主要表達(dá)可生成·O2ˉ的NOX1/2和生成H2O2的NOX4[14]。核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)信號(hào)募集和激活TRAF6后，可激活小GTP酶RAC1，其激活后可與NOX1的胞內(nèi)亞基結(jié)合組成復(fù)合物，從而激活NOX1，短暫生成ROS[15]。NOX2的質(zhì)膜亞基gp91phox對(duì)于生成ROS起重要作用，其敲除小鼠模型的骨髓源性單核巨噬細(xì)胞定向分化過(guò)程產(chǎn)生破骨分化缺陷表現(xiàn)，且可被H2O2補(bǔ)償[16]。Nox4敲除小鼠骨密度較高，破骨細(xì)胞數(shù)量和標(biāo)志物減少[17]。利用基因敲除和敲低技術(shù)相結(jié)合的方法，研究[18]發(fā)現(xiàn)在促破骨細(xì)胞分化時(shí)，NOX1和NOX2之間存在靈活的代償機(jī)制，而NOX4并不參與該代償機(jī)制。最新的研究[19]發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞表面的髓系細(xì)胞觸發(fā)受體2 (Trem2)是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的另一關(guān)鍵分子，其被激活后可與受體DAP12結(jié)合，從而激活酪氨酸激酶Syk，使ROS產(chǎn)生增加。

細(xì)胞內(nèi)抗氧化機(jī)制可清除ROS，阻止其過(guò)量積聚，從而維持細(xì)胞內(nèi)ROS的穩(wěn)態(tài)[20]。在抗氧化酶中，最具代表性的是超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，它通過(guò)將·O2ˉ轉(zhuǎn)化為H2O2而降低其活性[21]。由SOD催化產(chǎn)生的H2O2可被過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞漿中的過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)轉(zhuǎn)化為水和分子氧[22]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是另一重要的抗氧化酶，其與酶解產(chǎn)物如膽紅素和一氧化碳等共同發(fā)揮抗氧化、抗炎作用[23-24]。HO-1的表達(dá)受抗氧化蛋白NRF2所調(diào)控。氧化應(yīng)激條件下，NRF2磷酸化入核與小MAF蛋白組成異源二聚體，與抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidant response element, ARE)結(jié)合，促進(jìn)HO-1的轉(zhuǎn)錄[25-26]。

2 ROS對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的調(diào)控

在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，RANKL/核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是調(diào)控破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化成熟的關(guān)鍵信號(hào)通路[27]。骨髓基質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌的RANKL與破骨細(xì)胞表面RANK結(jié)合后，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(TNF receptor associated factors，TRAFs)的募集和激活，導(dǎo)致核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB )、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)、轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白1(activator protein-1，AP-1)和AKT等多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活。這些信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)最終促進(jìn)活化T細(xì)胞核因子1(nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1)的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)破骨細(xì)胞分化和多種溶骨相關(guān)基因如ACP5、CTSK和MMP9等的表達(dá)，促使破骨細(xì)胞發(fā)生融合、細(xì)胞骨架重塑和發(fā)揮骨吸收功能[28-30]。

ROS在破骨細(xì)胞分化過(guò)程中的調(diào)控作用早在上世紀(jì)90年代就有研究。在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)分化破骨細(xì)胞時(shí)無(wú)論直接添加H2O2還是SOD誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2均可促進(jìn)骨吸收[31-32]。后續(xù)發(fā)現(xiàn)，砷誘導(dǎo)產(chǎn)生的H2O2促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的作用在較低濃度內(nèi)具有劑量依賴(lài)性[33]。近期報(bào)道[34]，破骨細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白NRF2的缺乏增加了砷誘導(dǎo)的H2O2水平和p38的磷酸化。此研究揭示了H2O2濃度上升與破骨細(xì)胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路激活之間的潛在聯(lián)系。隨著ROS檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步，其在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)調(diào)節(jié)作用不斷被闡明。研究者運(yùn)用DCFH-DA熒光探針技術(shù)發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生隨著RANKL濃度的增加而增加[35]。隨著H2O2的加入，IκBα 和AKT以及ERK、JNK,、和p38的磷酸化程度呈劑量依賴(lài)性增加[35]。Satish Srinivasan等[36]利用電子自旋共振(electron paramagnetic resonance，EPR)捕獲技術(shù)，發(fā)現(xiàn)微缺氧條件下，ROS產(chǎn)生增加，IκBβ水平下降，破骨細(xì)胞分化增強(qiáng)，且可被抗氧化劑逆轉(zhuǎn)。在一項(xiàng)糖尿病引起骨質(zhì)疏松的機(jī)制研究[37]報(bào)道中，研究者發(fā)現(xiàn)，體外利用高糖培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)破骨細(xì)胞，可使ROS的產(chǎn)生增加，導(dǎo)致ERK、JNK和p38及IκB的磷酸化加強(qiáng)，并上調(diào)IKK，從而增強(qiáng)破骨細(xì)胞分化。綜上，隨著ROS檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和H2O2與高糖培養(yǎng)基質(zhì)及微缺氧培養(yǎng)條件的建立，ROS通過(guò)NF-κB、MAPK和AKT等多條信號(hào)通路調(diào)控破骨細(xì)胞分化的機(jī)制逐漸被闡明[38-39]。研究[40]顯示，以上信號(hào)通路中，磷酸化酶催化位點(diǎn)處的半胱氨酸解離常數(shù)(pKa )較低，主要以硫醇形式存在，可被ROS進(jìn)行氧化修飾從而影響該酶的催化活性。而在破骨細(xì)胞中，ROS對(duì)于多條信號(hào)通路的調(diào)控是否通過(guò)半胱氨酸的氧化修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)還未有研究。

除調(diào)控破骨細(xì)胞分化外，ROS也可能參與破骨細(xì)胞凋亡調(diào)控。據(jù)報(bào)道，含氮雙膦酸唑與原兒茶酸均可下調(diào)ROS并誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡，而香煙煙霧提取物可激活ROS并抑制破骨細(xì)胞凋亡[41-43]。但目前ROS調(diào)控破骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制還不清楚，且以上研究與激活ROS促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究結(jié)果[44]不一致，故ROS在破骨細(xì)胞凋亡中的調(diào)控作用及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

3 ROS作為溶骨性疾病治療靶點(diǎn)的研究進(jìn)展

由于ROS可通過(guò)多條信號(hào)通路調(diào)控破骨細(xì)胞的分化成熟，故將ROS作為靶點(diǎn)的抗氧化劑對(duì)于溶骨性疾病的治療研究也常有報(bào)道。研究[45]發(fā)現(xiàn)，老年人和女性人群的血漿中，抗氧化劑的含量明顯減少。在卵巢切除小鼠中應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸(NAC)或抗壞血酸鹽等抗氧化劑可以減少雌激素下降引起的骨丟失[46]。一些回顧性隊(duì)列研究[47-50]發(fā)現(xiàn)，服用常見(jiàn)抗氧化劑如維生素C、維生素E、 NAC和硫辛酸(LA)的人群骨密度(bone mineral density，BMD)相對(duì)較高。

近年來(lái)，眾多新型抗氧化劑顯現(xiàn)出對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的靶向抑制作用，有望為骨質(zhì)疏松癥等溶骨亢進(jìn)型疾病提供治療新思路。根據(jù)其抗氧化作用原理不同，可將這些抗氧化劑分為兩大類(lèi)，即抑制ROS產(chǎn)生型和促進(jìn)ROS代謝型(表1)。

表1 新型抗氧化劑對(duì)于破骨細(xì)胞分化成熟的靶向調(diào)控Table 1 Targeting effects of novel antioxidants on osteoclast differentiation and maturation

抑制ROS產(chǎn)生型抗氧化劑包括米托蒽醌甲磺酸鹽(MitoQ)、木黃酮和葛根素和阿齊沙坦等，主要通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生，從而抑制破骨細(xì)胞分化。例如，MitoQ是一種線粒體特異性抗氧化劑，其可抑制缺氧環(huán)境下的mtROS的產(chǎn)生，從而通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制破骨細(xì)胞分化[36]；木黃酮通過(guò)抑制NOX1的翻譯和激活來(lái)減少破骨細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生從而抑制破骨細(xì)胞形成[7]；葛根素通過(guò)下調(diào)TRAF6和NOX1的表達(dá)，抑制TRAF6/ROS依賴(lài)的MAPK和NF-κB信號(hào)通路，從而抑制破骨細(xì)胞分化[8]。近期[51]發(fā)現(xiàn)，一種血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑阿齊沙坦可下調(diào)NRF2的表達(dá)以抑制ROS 的產(chǎn)生，來(lái)抑制MAPK和NF-κB信號(hào)通路，從而抑制破骨分化。

促進(jìn)ROS代謝型抗氧化劑包括姜黃素、髓過(guò)氧化物酶和白樺提取物BAG等，主要通過(guò)促進(jìn)ROS代謝分解，從而抑制破骨細(xì)胞分化。例如，姜黃素可上調(diào)NRF2的表達(dá)并增強(qiáng)SOD和CAT活性而促進(jìn)ROS的代謝，通過(guò)NF-κB/AKT信號(hào)通路來(lái)抑制NFATc1的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞分化成熟[52-54]。姜黃素環(huán)糊精包合物與金納米制劑聯(lián)用在體外證實(shí)可提高卵巢切除誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型的骨密度[55]。一期臨床試驗(yàn)[56]結(jié)果表明，姜黃素可提高骨密度和減少骨吸收，對(duì)骨質(zhì)疏松過(guò)程有抑制作用。姜黃素和阿侖膦酸鹽聯(lián)合治療可調(diào)節(jié)骨質(zhì)疏松絕經(jīng)后婦女的骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物并提高骨密度[57]。髓過(guò)氧化物酶通過(guò)分解細(xì)胞內(nèi)H2O2，抑制破骨細(xì)胞發(fā)生和骨吸收[58]。有H2O2暴露時(shí)，輔酶Q10可提高SOD和CAT酶活性及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)加速ROS代謝，以抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化[59]。

4 小結(jié)與展望

本文總結(jié)了ROS在破骨細(xì)胞分化成熟過(guò)程中的調(diào)控作用。破骨細(xì)胞在分化過(guò)程中伴隨著ROS的產(chǎn)生，ROS通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK和AKT信號(hào)通路，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟。將ROS作為靶點(diǎn)的常見(jiàn)抗氧化劑可作為治療溶骨性疾病的全新方向。近年來(lái)，多種新型抗氧化劑特異性靶向ROS產(chǎn)生和代謝酶類(lèi)，通過(guò)抑制ROS產(chǎn)生或促進(jìn)ROS代謝從而抑制溶骨作用，為溶骨亢進(jìn)型疾病治療藥物的研發(fā)提供了新思路。

盡管不同抗氧化劑均通過(guò)降低破骨細(xì)胞的ROS水平，從而抑制破骨細(xì)胞分化，但其所調(diào)控的信號(hào)通路卻有所不同，這其中的機(jī)理還未有研究。雖然在眾多新型抗氧化劑治療溶骨性疾病研究中的大部分仍處于基礎(chǔ)研究和早期臨床試驗(yàn)階段，但由于靶向分子的多樣性以及調(diào)控信號(hào)通路的可選擇性，使其在精準(zhǔn)醫(yī)療中具有巨大潛力。