單味中藥及其有效成分組織蛋白酶K抑制劑研究進(jìn)展

薛黎明 董志敏 金玉娥 蔣益萍 Dieter Br?mme

1.上海市疾病預(yù)防控制中心，上海 200336

2.上海師范大學(xué)，上海 200234

3.中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)，上海 200433

4.不列顛哥倫比亞大學(xué)，溫哥華V6T1Z3，加拿大

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見的發(fā)病率高、致殘率高的骨骼疾病，給我國(guó)帶來沉重的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。臨床治療骨質(zhì)疏松藥物，若長(zhǎng)期使用多存在不良反應(yīng)，如常用骨吸收抑制劑雙膦酸鹽可顯著下調(diào)或者破壞破骨細(xì)胞，但會(huì)影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的相互作用信號(hào)機(jī)制，導(dǎo)致骨形成減少[1]。組織蛋白酶K(Cathepsin K，CTSK)抑制劑是抗骨質(zhì)疏松癥新藥研發(fā)的熱點(diǎn)之一，臨床前和臨床研究數(shù)據(jù)表明CTSK抑制劑可特異性地抑制破骨細(xì)胞膠原降解酶的活性，而不影響破骨細(xì)胞活力，可以有效避免成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞雙向調(diào)節(jié)的失衡[2]。

傳統(tǒng)中藥含有豐富的促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收的活性物質(zhì)，如我國(guó)臨床原發(fā)性骨質(zhì)疏松診療指南中記錄骨碎補(bǔ)總黃酮、淫羊藿苷等[3]。多種中藥有效部位及中藥復(fù)方，如骨碎補(bǔ)總黃酮、杜仲醇提取物、復(fù)方甘草附子湯、補(bǔ)腎通絡(luò)方等[4-6]均報(bào)道具有抑制CTSK活性。目前僅有少量中藥來源的CTSK抑制劑的研究，本文擬通過查詢中國(guó)知網(wǎng)、萬方和Web of Science數(shù)據(jù)庫(kù)所收錄的CTSK抑制劑分類、單味中藥來源CTSK抑制劑的研究進(jìn)展，以期為中藥中開發(fā)安全、有效的CTSK抑制劑藥物提供思路。

1 組織蛋白酶K概述

CTSK屬于番木瓜蛋白酶家族，與組織蛋白酶B、L和S具有高度同源性，主要分布在骨組織，它特異性表達(dá)于破骨細(xì)胞邊緣褶皺處，其作用底物主要是骨基質(zhì)中含量達(dá) 90%以上的Ⅰ型膠原，還可降解骨基質(zhì)中Ⅱ型膠原、骨橋接素和骨連接素等蛋白，是破骨細(xì)胞中溶骨活性最強(qiáng)的關(guān)鍵酶[7]。CTSK基因表達(dá)的變異或缺失會(huì)導(dǎo)致患者患致密性成骨不全癥、骨質(zhì)疏松癥和骨脆性骨折增加等疾病[8]。除了骨組織，CTSK在皮膚、心臟、骨骼肌、胎盤、小腸、肺、大腦和甲狀腺等組織中均有表達(dá)，發(fā)揮著重要的生理作用。CTSK基因缺失可引起肺纖維化、呼吸、心血管、免疫系統(tǒng)功能障礙、甲狀腺功能異常、癌癥、甚至學(xué)習(xí)記憶缺陷等癥[9]。

2 組織蛋白酶K抑制劑

2.1 活性位點(diǎn)抑制劑

基于CTSK與抑制劑共培養(yǎng)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)CTSK分子活性位點(diǎn)位于頂部的一個(gè)V形裂縫，結(jié)構(gòu)域由Cys25、His162和Asn161等氨基酸殘基組成(見圖1)[10]，它含有催化二氫半胱氨酸-組氨酸結(jié)構(gòu)，可以接受脯氨酸殘基，這與膠原蛋白中脯氨酸和羥脯氨酸殘基的高含量有關(guān)[11]。CTSK在酸性環(huán)境中，通過自動(dòng)斷開其前端部分而暴露其催化活性位點(diǎn)，直接作用于膠原端肽區(qū)，將完整的三股螺旋體結(jié)構(gòu)膠原蛋白降解成不規(guī)則結(jié)構(gòu)的纖維碎片[11]。目前制藥企業(yè)研發(fā)CTSK抑制劑均是針對(duì)活性位點(diǎn)開發(fā)的，通過直接競(jìng)爭(zhēng)性與CTSK活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制CTSK活性，稱為活性位點(diǎn)抑制劑(active site inhibitor)。迄今為止，有50多種CTSK抑制劑藥物申請(qǐng)了專利，但都在臨床前或臨床試驗(yàn)階段宣告失敗，其失敗原因與導(dǎo)致非骨骼組織嚴(yán)重不良反應(yīng)密切相關(guān)[2]。

2.2 非活性位點(diǎn)抑制劑

CTSK與粘多糖(glycosaminoglycans，GAGs)，如硫酸軟骨素(CSA)，結(jié)合后可形成一種CTSK-GAGs復(fù)合物，只有這種復(fù)合物形成，CTSK才能夠發(fā)揮膠原酶活性，如果GAGs缺失，CTSK將失去膠原酶活性，但仍保留CTSK的其他正常肽酶活性[10]。非活性位點(diǎn)抑制劑(Ectosteric-site inhibitor)不是競(jìng)爭(zhēng)性抑制三螺旋膠原與CTSK的結(jié)合，而是競(jìng)爭(zhēng)性抑制CTSK與GAGs結(jié)合的寡聚化位點(diǎn)，GAG-CTSK結(jié)合位點(diǎn)G1含K119、K122、R123和R127殘基，結(jié)合位點(diǎn)G2含K40、K41、R108、R111和K214殘基[12](圖1)。Sharma等[13]在人CTSK(1ATK)蛋白分子上鑒定了非活性位點(diǎn)1的結(jié)構(gòu)域由一個(gè)由Y87、E93和E94的鉤狀環(huán)形成(圖1)[13]。Novinec等[14]報(bào)道在CTSK(1ATK)分子上鑒定到非活性位點(diǎn)2，其位置毗鄰與于GAGs位點(diǎn)，結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有K119、N199、R198、K176、Y169、R123和K122殘基(圖1)，除該位點(diǎn)外，還預(yù)測(cè)了CTSK分子可能還存在6個(gè)潛在的CTSK變構(gòu)作用位點(diǎn)[14]。目前基于非活性位點(diǎn)抑制劑的研究，都來自傳統(tǒng)中藥的活性物質(zhì)。

圖1 組織蛋白酶K變構(gòu)位點(diǎn)位置和結(jié)構(gòu)域。黃色：活性位點(diǎn)[10]；綠色：非活性位點(diǎn)1[13]；粉紅色：GAG位點(diǎn)[12]；青色：非活性位點(diǎn)2[14]Fig.1 Location and binding pocket of allosteric sites on cathepsin K. Yellow： active site [10], Green： Ectosteric site 1[13], Pink： GAG site[12], and Cyan： Ectosteric site 2[14]

3 單味中藥及其有效成分CTSK抑制劑研究

3.1 丹參

丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消癰之功效，臨床主要用于預(yù)防和治療心腦血管疾病。Guo等[15]綜述了傳統(tǒng)中藥丹參治療骨質(zhì)疏松的臨床應(yīng)用，超過30%的中藥方劑包含丹參。發(fā)現(xiàn)丹參乙醇提取物顯著抑制膠原降解，而不影響CTSK降解活性位點(diǎn)合成底物Z-FR-MCA，故推測(cè)丹參乙醇提取物可能含有CTSK非活性位點(diǎn)抑制劑。Preety等[16]研究丹參中30多種丹參酮類成分進(jìn)行膠原酶活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6種丹參酮化合物抗膠原酶IC50值均小于500 nmol/L，能顯著抑制破骨細(xì)胞骨吸收活性，但對(duì)破骨細(xì)胞活力和骨形成活性無影響，被認(rèn)為是較為理想的非活性位點(diǎn)抑制劑[17]。其中二氫丹參酮I(DHT1)和丹參酮ⅡA磺酸鈉的抗膠原酶活性IC50為(6.2±0.7)μmol/L和(2.7±0.2)μmol/L，接近默克odanacatib的(0.21±0.05)μmol/L，對(duì)CTSK活性位點(diǎn)底物明膠、甲狀腺球蛋白和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)沒有抑制作用[13,18]。分子對(duì)接結(jié)果發(fā)現(xiàn)DHT1結(jié)合在CTSK非活性位點(diǎn)1中Tyr87、Pro88和Val90氨基酸殘基形成的溝狀結(jié)構(gòu)，與Asn99殘基氫鍵相互作用[13]。丹參酮ⅡA磺酸鈉也同樣與活性位點(diǎn)1結(jié)構(gòu)裂縫相吻合，與Glu94和Ser95形成氫鍵相互作用，與Tyr87、Pro88和Met97的疏水殘基相互作用，其對(duì)接得分最高，原因可能是由于含有一個(gè)磺酸根基團(tuán)且?guī)в须姾墒蛊浣Y(jié)合更緊密[18]。最新臨床研究發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液可有效治療骨質(zhì)疏松和術(shù)后骨折[19-20]。

3.2 淫羊藿

淫羊藿，又名仙靈脾，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，為中醫(yī)補(bǔ)腎壯骨的代表藥材，其活性部位淫羊藿總黃酮和成分淫羊藿苷臨床證實(shí)對(duì)治療骨質(zhì)疏松效果顯著[3,21]。戴娜桑等[22]研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L淫羊藿苷就可以顯著抑制CTSK降解膠原活性，1 mmol/L淫羊藿苷對(duì)CTSK活性位點(diǎn)熒光底物A-H-D-ALK-AMC具有明顯的抑制作用，抑制率高達(dá)75.34%。Sun等[23]采用SDS-PAGE方法考察淫羊藿苷降解膠原作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷在5 μmol/L濃度時(shí)，顯著抑制膠原降解，其呈劑量依賴性，推測(cè)是一種有效的CTSK抑制劑。但Xue等[24]研究報(bào)道濃度高達(dá)100 μmol/L的淫羊藿苷對(duì)CTSK降解膠原和合成底物Z-FR-MCA無任何抑制作用。

3.3 墨旱蓮

墨旱蓮，具有滋補(bǔ)肝腎，涼血止血功效，適用于肝腎陰虛，牙齒松動(dòng)等癥，與女貞子組方二至丸臨床用于治療骨質(zhì)疏松。墨旱蓮乙醇提取物(EAE)和活性成分蟛蜞菊內(nèi)脂報(bào)道能抑制破骨細(xì)胞分化和下調(diào)骨吸收標(biāo)記基因c-src和CTSK表達(dá)[25-26]。蔣益萍等[27]研究了墨旱蓮正丁醇、乙酸乙酯、石油醚和二氯甲烷提取物對(duì)CTSK降解膠原和合成底物Z-FR-MCA活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)墨旱蓮石油醚和正丁醇部位的膠原降解抑制率分別為95.6%和78.3%，而與Z-FR-MCA結(jié)合的抑制率分別為72.3%和25.9%，說明墨旱蓮正丁醇部位可能存在潛在非活性位點(diǎn)抑制劑。正丁醇部位化學(xué)成分墨旱蓮皂苷V、I、Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ和刺囊酸6個(gè)成分對(duì)Z-FR-MCA底物結(jié)合活性均無抑制作用，僅墨旱蓮皂苷Ⅸ在100 μmol/L顯著抑制CTSK膠原酶活性，抑制率為70.3%，推測(cè)墨旱蓮皂苷Ⅸ可能為潛在的非活性位點(diǎn)抑制劑。

3.4 補(bǔ)骨脂

補(bǔ)骨脂，具有溫腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉之功效，藥理活性表現(xiàn)為抗腫瘤、抗菌、抗骨質(zhì)疏松、雌激素作用等。丁黎艷等[28]對(duì)補(bǔ)骨脂33種化學(xué)成分與人CTSK蛋白分子(3KWZ)的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)與CTSK具有較高親和力，均存在兩個(gè)疏水基團(tuán)與CTSK活性位點(diǎn)的疏水空穴結(jié)合。其中6個(gè)是黃酮類化合物，推測(cè)原因?yàn)辄S酮6C-3C-6C的基本骨架，3C烯酮結(jié)構(gòu)，空間位阻小，易于CTSK活性位點(diǎn)凹槽位置較好吻合，烯酮中的羰基氧或6C骨架上的羥基易于Cyr25殘基形成氫鍵。因此，補(bǔ)骨脂可能含有多個(gè)CTSK抑制劑，通過多成分協(xié)同抑制骨吸收作用。但是，近年來補(bǔ)骨脂及抗骨質(zhì)疏松活性成分補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚等均報(bào)可能引起肝損傷，臨床使用需予以注意[29]。

3.5 其他

王丹華[30]分別構(gòu)建了人CTSK(4x6i)蛋白分子活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)和CTSK變種(5j94)[14]的別構(gòu)位點(diǎn)藥效團(tuán)模型，對(duì)由淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參和地黃組成的中成藥仙靈骨葆膠囊中活性化合物進(jìn)行分子對(duì)接，分別得到98個(gè)和75個(gè)化合物對(duì)接成功，且分別展示了活性位點(diǎn)和別構(gòu)位點(diǎn)綜合評(píng)分最佳的9個(gè)化合物，多以苯丙素、黃酮、環(huán)烯醚萜苷和三萜結(jié)構(gòu)骨架類型化合物為主。仙靈骨葆膠囊是臨床常用于治療骨質(zhì)疏松中成藥，推測(cè)可能是存在多種CTSK抑制劑協(xié)同發(fā)揮作用。

4 展望

臨床治療骨質(zhì)疏松中藥是理想的CTSK抑制劑候選庫(kù)，具療效確切且不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)。中藥中可能不僅含有CTSK抑制劑降低骨吸收，同時(shí)也存在促進(jìn)骨形成活性成分，二者組合協(xié)同發(fā)揮療效。甚至篩查到的CTSK抑制劑，除了抑制骨吸收，還可能促進(jìn)骨形成活性，表現(xiàn)出多靶點(diǎn)調(diào)控骨代謝，如淫羊藿苷雙向調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收作用，多靶點(diǎn)調(diào)控作用也可能降低其作為CTSK活性位點(diǎn)抑制劑的不良反應(yīng)。這種中藥的整體觀組合治療或多靶點(diǎn)作用的思路，可能是中藥臨床發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的重要作用機(jī)理。

CTSK非活性位點(diǎn)抑制劑不僅發(fā)揮CTSK降解骨膠原的活性，且不會(huì)影響其在其他組織的正常生理活性，是潛在的理想型CTSK抑制劑藥物研發(fā)的新方向。從中藥中篩選CTSK非活性位點(diǎn)抑制劑，不存在臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的活性位點(diǎn)抑制劑的安全性問題。