薯蕷皂苷通過ERα/miR503/RANK信號(hào)通路抑制破骨細(xì)胞生成

蔣太平 關(guān)智宇 劉志倫 李成蹊 劉昭明

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000

2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷科，貴州 貴陽 550001

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨骼疾病，好發(fā)群體為中老年人，其特點(diǎn)是骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致骨組織承受載荷的能力下降，骨組織的脆性增加[1]。骨質(zhì)疏松是骨折的主要危險(xiǎn)因素，其帶來的后果嚴(yán)重影響著中老年人的生命健康和生活質(zhì)量[2-3]。臨床上治療骨質(zhì)流失的方法較多，但多數(shù)效果不佳或存在嚴(yán)重不良反應(yīng)[4-5]。因此，筆者期望從中醫(yī)藥寶庫中探尋更安全、有效的治療骨質(zhì)疏松癥的方法。

薯蕷皂苷同時(shí)廣泛存在于薯蕷科、百合科、石竹科和薔薇科等藥用植物中，前期的研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷可能是山藥(Dioscoreae Rhizoma)、黃精(Polygonatum sibiricum Delar.ex Redoute)等補(bǔ)腎健脾類中藥發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的主要有效成分之一[6-7]。通過生物信息學(xué)研究顯示ER通路可能是薯蕷皂苷抗骨質(zhì)疏松作用的重要調(diào)控途徑之一，且薯蕷皂苷具有雌激素樣活性，可通過多途徑調(diào)控骨吸收和骨形成的平衡，具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用[8-9]。

ERα/miR-503/RANK是參與破骨細(xì)胞形成和骨吸收功能的通路之一，ERα通過上調(diào)miR-503-5p的表達(dá)，靶向抑制RANK的表達(dá)，對(duì)下游的TRAP、CTSK、MMP-9等破骨標(biāo)志性基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控，介導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化形成和功能[10]。因此，本研究利用RANKL誘導(dǎo)小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞(RAW264.7)分化成破骨細(xì)胞的模型，從ERα/miR-503/RANK通路探討薯蕷皂苷抑制破骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和試劑

Raw264.7細(xì)胞(BNCC354753，北納生物)，完全DMEM培養(yǎng)基(KGM12800 S，凱基生物)，F(xiàn)BS(10099-141，Gibco)，RANKL(HY-P73388，MCE)，雌二醇(S30633，源葉生物)，薯蕷皂苷元(B21177，源葉生物)，CCK-8法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(KGA317，凱基生物)，抗酒石酸酸性磷酸酶染色液(G1492，Solarbio)，Trizon Reagent(CW0580 S，CWBIO)，HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(R223-01，Vazyme)，超純RNA提取試劑盒(CW0581 M，CWBIO)，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02，Vazyme)，miRNA提取試劑盒(CW0627 S，CWBIO)，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(MR101-02，Vazyme)，BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M，Elabscience)，RIPA細(xì)胞裂解液(C1053，北京普利萊基因技術(shù)有限公司)，Rabbit Anti ERα(AF6058，Affinity，1/1000)、Rabbit Anti RANK (DF12532，Affinity，1/1000)、Mouse Anti-β-Actin (HC201，TransGen Biotech，1/2000)，HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) (GB23301，Servicebio，1/2000)，HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)(GB23303，Servicebio，1/2000)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組：雌二醇與薯蕷皂苷采用DMSO分別溶解后配置成5 μg/mL的雌激素溶液和1 μmol/L、2.5 μmol/L的薯蕷皂苷溶液。小鼠單核巨噬細(xì)胞(RAW264.7)細(xì)胞置于39 ℃干式恒溫加熱器中復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞密度至80%～90%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行傳代，經(jīng)1×PBS洗兩遍、0.25%胰酶(含0.02% EDTA)消化、細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化、6 000 r/min離心3 min處理后，再根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行種板。為比較薯蕷皂苷與雌激素對(duì)破骨分化的抑制作用，實(shí)驗(yàn)分為4組：模型對(duì)照組、雌激素組、低劑量薯蕷皂苷組、高劑量薯蕷皂苷組，接種于含50 μg/L的RANKL完全培養(yǎng)基2 mL，處理7 d后，分別更換為含5 μg/mL雌二醇的完全培養(yǎng)基2 mL、含1 μmol/L薯蕷皂苷元的完全培養(yǎng)基2 mL與含2.5 μmol/L薯蕷皂苷元的完全培養(yǎng)基2 mL，培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)檢測(cè)。

1.2.2CCK8細(xì)胞毒性測(cè)定：將RAW264.7細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，分為6組，每組設(shè)5副孔，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的薯蕷皂苷(0、0.1、1、2.5、5、10 μmol/L)進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后將待測(cè)的96孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100 μL，每孔加入10 μL CCK8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后通過酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測(cè)吸光度(optical density，OD)值。通過下述公式計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率：OD給藥組/OD對(duì)照組×100%。

1.2.3抗酒石酸堿性磷酸酶染色(TRAP染色)：吸除皿中的培養(yǎng)基，自然晾干后予TRAP固定液4 ℃固定60 s，水洗晾干后切片入TRAP孵育液，37 ℃溫箱避光浸染45～60 min，水洗后予甲基綠染色液染色2～3 min，水洗、晾干后鏡檢。染色后破骨細(xì)胞胞漿被染成紫紅色，細(xì)胞核被甲基綠染成綠色。每孔隨機(jī)選取5個(gè)不相鄰視野求均值，計(jì)數(shù)每組TRAP陽性多核細(xì)胞數(shù)。

1.2.4實(shí)時(shí)定量PCR[11]：根據(jù)試劑盒說明分別提取細(xì)胞microRNA和總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，配置成20 μL的反應(yīng)體系，在熒光PCR儀[CFX ConnectTM實(shí)時(shí)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]上按照反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃反應(yīng)10 s變性，58 ℃反應(yīng)30 s退火，72 ℃反應(yīng)30 s延伸，進(jìn)行40次循環(huán)。

引物均由通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司合成，U6是miR-503的參考基因，β-actin是ERα、RANK、TRAP、MMP9、CTSK的參考基因，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，使用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.5Western blot檢測(cè)：加入RIRP細(xì)胞裂解液，12 000 r/min離心10 min，取上清；BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白水平，95 ℃加熱5 min使蛋白變性。將樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，加入脫脂牛奶封閉2 h；分別加入RANK抗體(1/1 000)、ERα抗體(1/1 000)和β-Actin抗體(1/2 000)，4 ℃孵育過夜；與HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體室溫孵育2 h；通過超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)處理印跡，進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實(shí)驗(yàn)至少進(jìn)行3次。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性較好，多組樣本比較采用單因素方差分析(ANOVA)，采用最小顯著性差異法(LSD)-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，組間顯著性差異為P<0.05，以*表示。

2 結(jié)果

2.1 薯蕷皂苷在0.1～10 μmol/L濃度下對(duì)RAW264.7細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性

培養(yǎng)48 h后，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，薯蕷皂苷的濃度為0.1～10 μmol/L時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性無明顯毒性作用。0.1、1、2.5、5、10 μmol/L濃度的薯蕷皂苷干預(yù)與不使用薯蕷皂苷干預(yù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。薯蕷皂苷在0～10 μmol/L濃度內(nèi)均未顯示出毒性作用。見圖1。根據(jù)CCK-8結(jié)果及其他參考文獻(xiàn)[12]，選取1 μmol/L(低劑量)和2.5 μmol/L(高劑量)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 不同濃度薯蕷皂苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of different concentrations of dioscin on the viability of RAW264.7 cells

2.2 薯蕷皂苷抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞生成

TRAP染色結(jié)果如圖2、表2所示，各組均出現(xiàn)融合生長，胞質(zhì)染色較深，形態(tài)大的TRAP陽性多核細(xì)胞。與RANKL模型組比較，雌激素組和高劑量(2.5 μmol/L)薯蕷皂苷組陽性細(xì)胞顯著減少(P<0.05)。低劑量組(1 μmol/L)陽性細(xì)胞數(shù)目平均值雖然低于RANKL組，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 各組Trap染色結(jié)果A：RANKL誘導(dǎo)組；B：雌激素組；C：低劑量薯蕷皂苷組；D：高劑量薯蕷皂苷組 Fig.2 Trap staining results of each groupA： RANKL-induced group; B： Estrogen group; C： Low-dose dioscin group; D： High-dose dioscin group

表2 各組TRAP染色陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)Table 2 TRAP staining positive cell count in each group

2.3 對(duì)破骨細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組破骨標(biāo)志基因的表達(dá)，結(jié)果顯示，與RANKL模型組比較，雌激素組與低、高劑量薯蕷皂苷組中MMP-9、CTSK、TRAP的基因表達(dá)均被抑制(P<0.05)。見圖3。

圖3 qPCR檢測(cè)破骨標(biāo)志性基因(TRAP、CTSK和MMP-9)Fig.3 Osteoclast-specific gene expression (TRAP, CTSK, and MMP9) was analyzed with qPCR注：與RANKL組比較，*P<0.05。

2.4 對(duì)ERα/miR-503/RANK通路表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，與RANKL組相比，雌激素與薯蕷皂苷組均能不同程度的激活ERα、miR-503-5p，并抑制RANK mRNA的表達(dá)(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，相較于RANKL組，ERα在雌激素組和薯蕷皂苷組的表達(dá)量均升高，RANK的表達(dá)量在雌激素組和薯蕷皂苷組均降低(P<0.05)。見圖4。以上結(jié)果說明雌激素與薯蕷皂苷對(duì)ERα/miR-503/RANK信號(hào)通路均有一定的激活作用。

圖4 A：通過qPCR檢測(cè)雌激素和不同濃度的薯蕷皂苷對(duì)破骨細(xì)胞中ERα、miR-503和RANK表達(dá)的影響；B：通過Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中ERα和RANK蛋白的表達(dá)量Fig.4 A：The effects of estrogen and different concentrations of dioscin on the expression of ERα, miR-503, and RANK in osteoclasts were analyzed with qPCR; B：The expression of ERα and RANK proteins in each group of cells was detected with Western blotting注：與RANKL組比較，*P<0.05。

3 討論

破骨細(xì)胞在骨骼的動(dòng)態(tài)平衡中扮演著重要的角色，是負(fù)責(zé)骨吸收的主要細(xì)胞。破骨細(xì)胞的過度活化可導(dǎo)致骨吸收、骨流失，甚至引發(fā)骨折。因此，破骨細(xì)胞作為一個(gè)骨質(zhì)疏松癥的重要治療途徑受到大量關(guān)注。而我國傳統(tǒng)補(bǔ)腎健脾的中藥在臨床上對(duì)骨質(zhì)疏松癥有著大量應(yīng)用，現(xiàn)代藥理學(xué)研究也顯示山藥、黃精等中藥具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用[13-16]。薯蕷皂苷作為補(bǔ)腎健脾類中藥山藥、黃精的主要活性成分之一，最近的研究也顯示薯蕷皂苷可調(diào)控骨吸收和骨形成的平衡，具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用，但其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[6-9]。

在骨骼的發(fā)育、骨質(zhì)重塑及骨量維持中ERα/miR-503/RANK信號(hào)通路起著關(guān)鍵作用，破骨細(xì)胞表面的ERα與雌激素結(jié)合后，可通過上調(diào)miR-503-5p的表達(dá)，靶向抑制RANK的表達(dá)，對(duì)下游的TRAP、CTSK、MMP-9等破骨標(biāo)志性基因的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控，從而抑制破骨細(xì)胞的生成，促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡[10,17-20]。ER是目前治療骨質(zhì)疏松癥的重要靶點(diǎn)之一，ERα基因表達(dá)不足的小鼠及患者都會(huì)表現(xiàn)出骨質(zhì)疏松的癥狀[21-22]。而在破骨細(xì)胞生成過程中，也有許多miRNA在不同程度地表達(dá)，并調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化和功能[23-25]。RANK屬于腫瘤壞死因子超家族，分布在破骨細(xì)胞前體細(xì)胞的膜上，是介導(dǎo)破骨細(xì)胞生成以及破骨細(xì)胞激活和生存所必須的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)[26-28]。

本研究發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷與雌激素均能夠抑制RAW264.7細(xì)胞的破骨分化，下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中破骨標(biāo)志基因(TRAP、CTSK、MMP-9)的表達(dá)。TRAP是一種由成熟破骨細(xì)胞和融合前單核細(xì)胞表達(dá)的含鐵糖蛋白，可通過水解無機(jī)磷鹽類和磷酸醋酶來破壞細(xì)胞基質(zhì)[29-30]；CTSK基因能反映破骨細(xì)胞的功能[31]；MMP-9可以破壞細(xì)胞外基質(zhì)成分，促使破骨細(xì)胞向骨表面遷移發(fā)揮骨吸收功能[32]。而破骨相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)進(jìn)一步證實(shí)了薯蕷皂苷對(duì)破骨分化的抑制作用。同時(shí)，薯蕷皂苷與雌激素能夠明顯上調(diào)ERα的蛋白及mRNA的表達(dá)水平，從而上調(diào)miR-503的miRNA表達(dá)水平，下調(diào)RANK的蛋白及mRNA表達(dá)。

綜上所述，薯蕷皂苷可抑制RAW264.7細(xì)胞中破骨標(biāo)志基因(TRAP、CTSK、MMP-9)的表達(dá)及破骨分化，而ERα/miR-503/RANK信號(hào)通路可能是薯蕷皂苷發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的重要途徑之一。后續(xù)將對(duì)該傳導(dǎo)途徑進(jìn)行更深入的研究，可通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及借助相應(yīng)靶向抑制劑加以驗(yàn)證。