總評(píng)歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化米槁葉多糖的提取工藝

魏 晴，何蘭鳳，鄭 雙，梁珊珊，孫慶文

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 大果木姜子研究中心，貴州 貴陽 550025；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 植物多糖研究中心，貴州 貴陽 550025)

米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)為樟科(Lauraceae)樟屬(Cinnamomum)常綠喬木。大果木姜子為米槁的干燥成熟果實(shí)，是貴州苗族民間常用藥物，最早收錄于《本草綱目拾遺》。大果木姜子具有驅(qū)散、疏通中焦寒氣而止痛的作用，臨床常用來治療因寒邪阻滯而引起的胸腹部疼痛[1]。但大果木姜子產(chǎn)量低、體積小、不易采摘。目前對(duì)米槁果實(shí)的化學(xué)成分和藥理學(xué)研究比較深入[2-4]，但對(duì)米槁其它部位如葉、種子等的研究較少。

多糖與蛋白質(zhì)功能相似，作為生命活動(dòng)中不可缺少的大分子，在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用[5-9]。傳統(tǒng)的多糖提取工藝存在耗時(shí)長、溶劑用量大、工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。因此，需要開發(fā)一種操作簡單、高效的多糖提取工藝。由于單一評(píng)價(jià)指標(biāo)不足以全面反映多糖提取工藝的優(yōu)化結(jié)果，故選取多個(gè)指標(biāo)綜合評(píng)價(jià)多糖提取工藝[10]。作者以米槁葉為研究對(duì)象，以米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用總評(píng)歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化米槁葉多糖的提取工藝，為米槁葉的開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

米槁葉，采摘于貴州省羅甸縣，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定為米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)的葉。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(純度>98%，批號(hào)MB6951)，大連美侖生物技術(shù)有限公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，純度>99%)，美國Sigma公司；苯酚、無水乙醇，分析純，西隴科學(xué)。

UV1100型紫外可見分光光度計(jì)，上海赫爾普儀器有限公司；KQ-3200E型超聲波清洗儀，青島精誠儀器儀表有限公司。

1.2 米槁葉的前處理

取新鮮的米槁葉，除去多余的枝梗和雜質(zhì)，置于室內(nèi)通風(fēng)處陰干后，粉碎，過40目篩，得到米槁葉粉末。

1.3 米槁葉多糖提取工藝的優(yōu)化

以得膏率、多糖含量和抗氧化活性等3個(gè)指標(biāo)對(duì)米槁葉多糖提取工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。采用Hassan法歸一化處理得膏率、多糖含量、抗氧化活性這3個(gè)指標(biāo)[11]，所有指標(biāo)最終通過總評(píng)歸一值(OD)進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察提取時(shí)間(25 min、30 min、35 min、40 min、45 min)、提取功率(40 W、60 W、80 W、100 W、120 W)、液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，mL∶g，下同)、提取次數(shù)(1、2、3、4、5)、提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對(duì)米槁葉得膏率、多糖含量、抗氧化活性的影響。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取時(shí)間、提取功率、液料比為考察因素，以O(shè)D值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化米槁葉多糖的提取工藝。

1.4 檢測方法

1.4.1 得膏率的測定

參照文獻(xiàn)[12-13]方法測定得膏率。將潔凈蒸發(fā)皿置于105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重(m0)，精密量取提取液10 mL，置于蒸發(fā)皿中水浴蒸干，再于105 ℃干燥至恒重，冷卻30 min后，迅速精密稱重(m)。按式(1)計(jì)算得膏率：

(1)

式中：V為提取液體積，mL；W為米槁葉粉末樣品質(zhì)量，g。

1.4.2 多糖含量的測定

參照文獻(xiàn)[14-15]方法繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.02 mg，置于105 ℃恒溫干燥箱中干燥至恒重，移入50 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，得到0.20 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)母液；然后將標(biāo)準(zhǔn)母液依次稀釋得到0.10 mg·mL-1、0.05 mg·mL-1、0.025 mg·mL-1、0.012 5 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，混勻，再迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻后冷卻至室溫，以1 mL蒸餾水作為空白對(duì)照，測定490 nm處吸光度。以葡萄糖濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得到線性回歸方程為：A=8.201c+0.05327，R2=0.9994。

參照文獻(xiàn)[16-17]方法測定米槁葉多糖含量。取提取液0.1 mL，加入0.9 mL蒸餾水、1 mL 6%苯酚溶液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻后冷卻至室溫，測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算提取液中的多糖含量，按式(2)計(jì)算多糖含量：

(2)

式中：c為提取液中的多糖含量，mg·mL-1；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；W為米槁葉粉末樣品質(zhì)量，mg。

1.4.3 抗氧化活性的測定

通過測定米槁葉多糖對(duì)DPPH自由基的清除率評(píng)價(jià)其抗氧化活性。參照文獻(xiàn)[18]方法，取提取液2 mL，加入2 mL DPPH自由基工作液，搖勻，避光靜置30 min，測定517 nm處吸光度，平行測定3次，取平均值。按式(3)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(3)

式中：A0為DPPH自由基工作液的吸光度；A1為提取液+DPPH自由基工作液的吸光度；A2為提取液的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間的影響(表1)

表1 提取時(shí)間對(duì)米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.1 Effect of extraction time on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表1可知，隨著提取時(shí)間的延長，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí)，各指標(biāo)達(dá)到最高；當(dāng)提取時(shí)間繼續(xù)延長至45 min時(shí)，各指標(biāo)略有下降?？赡苁怯捎冢崛r(shí)間過長，米槁葉中其它成分被提取出來，導(dǎo)致多糖占比降低、抗氧化活性下降。因此，提取時(shí)間選擇40 min較為適宜。

2.1.2 提取功率的影響(表2)

表2 提取功率對(duì)米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.2 Effect of extraction power on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表2可知，隨著提取功率的增大，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)提取功率為80 W時(shí)，各指標(biāo)達(dá)到最高；當(dāng)提取功率繼續(xù)增大至100 W后，各指標(biāo)略有下降。可能是由于，提取功率過大，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，提取功率選擇80 W較為適宜。

2.1.3 液料比的影響(表3)

表3 液料比對(duì)米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.3 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表3可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)液料比為30∶1時(shí)，各指標(biāo)達(dá)到最高；當(dāng)液料比繼續(xù)增大至40∶1后，各指標(biāo)略有下降?？赡苁怯捎冢崛∪軇┯昧窟^多，更多其它成分被溶出，導(dǎo)致多糖含量下降、抗氧化活性降低。因此，液料比選擇30∶1較為適宜。

2.1.4 提取次數(shù)的影響(表4)

表4 提取次數(shù)對(duì)米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.4 Effect of extraction times on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由表4可知，隨著提取次數(shù)的增加，得膏率略有升高，多糖含量、抗氧化活性先略微升高而后降低，總體變化不大。綜合考慮，提取次數(shù)選擇1次較為適宜。

2.1.5 提取溫度的影響(表5)

由表5可知，隨著提取溫度的升高，得膏率、多糖含量、DPPH自由基清除率均逐漸升高；當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，各指標(biāo)達(dá)到最高；當(dāng)提取溫度繼續(xù)升至70 ℃后，各指標(biāo)均明顯下降。因此，提取溫度選擇60 ℃較為適宜。

表5 提取溫度對(duì)米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性的影響Tab.5 Effect of extraction temperature on extraction rate of solid extracts,polysaccharides content,and antioxidant activity of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見表6，設(shè)計(jì)與結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平Tab.6 Factors and levels of response surface methodologies

表7 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.7 Design and results of response surface methodologies

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析

對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到回歸方程為：OD值=0.96-0.039A+0.092B+0.086C+(2.350E-003)AB+(6.250E-004)AC-0.11BC-0.26A2-0.24B2-0.46C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表8。

表8 方差分析Tab.8 Analysis of variance

由表8可知，模型的P<0.0001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)F=6.02，P=0.0578>0.05，不顯著，說明該模型擬合度較好。一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)BC，交互項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)OD值的影響極顯著。進(jìn)一步比較F值可知，各因素對(duì)米槁葉多糖提取的影響大小順序?yàn)椋禾崛」β?B)>液料比(C)>提取時(shí)間(A)。

2.2.3 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線圖見圖1。

由圖1可知，提取功率與液料比的響應(yīng)曲面較陡，且等高線呈橢圓，說明兩者交互作用對(duì)OD值影響較大，與方差分析結(jié)果一致。由方程得到米槁葉多糖的最佳提取工藝為：提取時(shí)間39.33 min、提取功率77.30 W、液料比28.67∶1，在此條件下，OD值為0.956 0。

圖1 各因素交互作用對(duì)OD值影響的響應(yīng)面圖及等高線圖Fig.1 Response surface plots and contour plots for interaction between various factors on OD value

2.3 工藝驗(yàn)證

考慮到實(shí)際可操作性，將米槁葉多糖的最佳提取工藝調(diào)整為：提取時(shí)間40 min、提取功率80 W、液料比30∶1。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，OD平均值為0.957 1，與預(yù)測值(0.956 0)的相對(duì)偏差為0.11%，米槁葉多糖含量為3.42%。說明該模型預(yù)測性較好，多指標(biāo)評(píng)價(jià)優(yōu)化的米槁葉多糖提取工藝可行。

3 結(jié)論

以米槁葉得膏率、多糖含量和抗氧化活性為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用總評(píng)歸一-響應(yīng)面法優(yōu)化了米槁葉多糖的提取工藝。確定最佳提取工藝為：提取時(shí)間40 min、提取功率80 W、液料比30∶1(mL∶g)，在此條件下，OD值為0.957 1，米槁葉多糖含量為3.42%。該研究為開發(fā)米槁新的藥用部位提供了理論依據(jù)。