老化石油污染土壤微生物群落多樣性特征

管圣迪，蘇穎軒，李夢(mèng)莉，羅海梅，于 妍

(中國(guó)礦業(yè)大學(xué)(北京)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京 100083)

我國(guó)經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展，能源需求迅速增長(zhǎng)，能源供需矛盾日益突出，非常規(guī)能源越來(lái)越受到人們的重視[1]。但是頁(yè)巖氣開(kāi)采造成土壤中石油含量增加，顯著影響微生物群落，導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量減少及生物多樣性降低[2]。土壤微生物是土壤的重要組成部分，其種類(lèi)較多，在土壤的形成發(fā)育、物質(zhì)循環(huán)和肥力演變等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。頁(yè)巖氣開(kāi)采造成的土壤污染具有隱蔽性、滯后性、累積性、不可逆轉(zhuǎn)性等特點(diǎn)[3]。因此，切實(shí)有效地解決石油污染土壤的修復(fù)問(wèn)題，成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[4]。石油污染土壤的修復(fù)技術(shù)主要有物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)和生物修復(fù)[5]。其中，生物修復(fù)技術(shù)因具有成本低、幾乎不產(chǎn)生二次污染和可進(jìn)行原位修復(fù)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[6-8]。

延長(zhǎng)油氣田位于鄂爾多斯盆地，鄂爾多斯盆地延長(zhǎng)組長(zhǎng) 7 段烴源巖分布廣泛，處于生油窗后期——生濕氣窗的高峰期[9]，油氣共生，部分成熟度較高的區(qū)域產(chǎn)氣強(qiáng)度較大，具備頁(yè)巖氣成藏的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，頁(yè)巖氣開(kāi)采發(fā)展迅速。但在頁(yè)巖氣開(kāi)采過(guò)程中產(chǎn)生的油基巖屑會(huì)污染土壤[10]。2015年，我國(guó)出臺(tái)了禁止油基巖屑落地的政策，因此后期沒(méi)有新增石油污染土壤，但是了解石油污染土壤的污染現(xiàn)狀對(duì)于指導(dǎo)土壤生物修復(fù)具有重要意義。 基于此，作者采集延長(zhǎng)某頁(yè)巖氣井田場(chǎng)地老化石油污染土壤，以周?chē)词苁臀廴就寥雷鳛閷?duì)照，利用 MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析土壤微生物群落多樣性，采用冗余分析(RDA)探究微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，為探究土壤微生物對(duì)石油的耐性機(jī)制、開(kāi)發(fā)土壤修復(fù)技術(shù)提供理論支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 土壤樣品采集

2020年10月在陜西省延長(zhǎng)某頁(yè)巖氣井田場(chǎng)地按照棋盤(pán)布點(diǎn)法設(shè)置6個(gè)點(diǎn)位，每個(gè)點(diǎn)位采集50 cm×50 cm小樣方的四角及中心0～20 cm深的土壤樣品，混合得到該點(diǎn)位的土壤樣品，依次編號(hào)為YC1～YC6；同時(shí)在井田場(chǎng)地外采集未污染土壤樣品作為對(duì)照，編號(hào)為YC。所有土壤樣品剔除草根和石塊后儲(chǔ)存于采樣袋內(nèi)，置于裝有冰袋的恒溫箱中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室4 ℃保存，用于微生物高通量測(cè)序的土壤樣品于-80 ℃下保存。

1.2 土壤樣品的理化性質(zhì)分析

將采集的土壤樣品自然風(fēng)干，研磨過(guò)篩，采用火焰原子吸收分光光度法測(cè)定總鉻，采用石墨爐原子吸收分光光度法測(cè)定鉛，采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗分光光度法測(cè)定有效磷，采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測(cè)定有機(jī)碳，采用凱氏定氮法測(cè)定總氮，采用電位法測(cè)定pH值，采用重量法測(cè)定含水率和含鹽量，采用氣相色譜法測(cè)定石油烴。采用SPSS 22軟件對(duì)土壤樣品的各項(xiàng)理化指標(biāo)的變化量進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 微生物DNA的提取及高通量測(cè)序

對(duì)土壤樣品進(jìn)行預(yù)處理，用DNA提取試劑盒(E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit，Omega)提取DNA。對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)檢，樣本濃度在6.04～24.60 ng·μL-1之間。采用16S rRNA通用引物341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)、805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′)對(duì)V3-V4區(qū)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在第二輪擴(kuò)增中引入Illumina橋式PCR兼容引物。最后，在MiSeq平臺(tái)對(duì)16S rRNA的V3-V4高變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)MiSeq測(cè)序所得原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接，區(qū)分樣本后對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，然后對(duì)所得操作單元(operational taxonomic unit，OTU)進(jìn)行聚類(lèi)分析和物種分類(lèi)學(xué)分析?；贠TU聚類(lèi)分析結(jié)果，對(duì)OTU進(jìn)行多種多樣性指數(shù)分析，計(jì)算alpha多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)等)，以表征微生物群落多樣性，鑒別采樣點(diǎn)的石油降解優(yōu)勢(shì)菌屬。利用R語(yǔ)言繪制OTU聚類(lèi)韋恩圖、聚類(lèi)堆積柱狀圖，并對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)、菌屬的豐度與理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 土壤樣品的理化性質(zhì)(表1)

表1 土壤樣品的理化性質(zhì)Tab.1 Physicochemical properties of soil samples

采樣點(diǎn)地處西北，干旱少雨，鹽堿積累，土壤的pH值和含鹽量高。由表1可知，污染土壤樣品的pH值范圍在8.45～9.98之間，均高于未污染土壤樣品；污染土壤樣品的有機(jī)碳含量在0.81～5.18 g·kg-1之間，均高于未污染土壤樣品；未污染土壤樣品的含鹽量較低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于污染土壤樣品，但含水率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于污染土壤樣品，主要是因?yàn)槭途哂惺杷?，石油污染土壤的疏水性也隨之升高，導(dǎo)致土壤儲(chǔ)水能力下降，含水率除低[11]；污染土壤樣品的鉛含量在3.03～17.10 mg·kg-1之間；污染土壤樣品的石油烴含量在38.81～320.69 mg·kg-1之間，均高于未污染土壤樣品，其中YC4樣品的石油烴含量最高，是未污染土壤樣品的40倍左右。石油烴含量較高的土壤樣品(YC1、YC3、YC4、YC6)的碳氮比失衡，均高于100/10，主要是由于陜北地區(qū)黃綿土氮含量低，碳含量高，導(dǎo)致碳氮比較高[12]。

將污染土壤樣品與未污染土壤樣品的理化性質(zhì)進(jìn)行Person相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 土壤理化性質(zhì)的Person相關(guān)性分析Tab.2 Person correlation analysis of physiochemical properties of soil

由表2可知，pH值與有機(jī)碳含量呈極顯著負(fù)相關(guān)性，總氮含量與有效磷含量、鉛含量與石油烴含量均呈極顯著正相關(guān)性，有效磷含量與含水率呈顯著正相關(guān)性，其它指標(biāo)間的相關(guān)性不顯著。

2.2 微生物群落多樣性分析

2.2.1 OTU聚類(lèi)分析(圖1)

圖1 OTU聚類(lèi)韋恩圖Fig.1 Clustering Venn diagram of OTU

由圖1可知，7個(gè)土壤樣品共同含有532個(gè) OTU。OTU數(shù)量順序?yàn)椋篩C>YC6>YC3>YC1>YC4>YC5≈YC2，其中YC樣品含有的OTU數(shù)量最多，YC5和YC2樣品含有的OTU數(shù)量最少，說(shuō)明石油污染土壤中微生物數(shù)量減少，主要是受石油污染物的脅迫和環(huán)境因素的影響[13]。

2.2.2 多樣性指數(shù)分析

在97%相似度水平下，計(jì)算alpha多樣性指數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 alpha多樣性指數(shù)Tab.3 alpha Diversity index

Chao1指數(shù)和 Shannon指數(shù)反映了微生物群落的豐富度和多樣性，數(shù)值越大說(shuō)明群落豐富度和多樣性越高； Simpson 指數(shù)反映了微生物群落的均勻性，數(shù)值越小，說(shuō)明群落分布越均勻。由表3可知，YC和YC6樣品的Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)較大，說(shuō)明微生物群落豐富度和多樣性較高；YC樣品的Simpson 指數(shù)最小，說(shuō)明未污染土壤樣品的微生物群落均勻性高于污染土壤樣品。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，石油烴的攝入降低了土壤微生物豐富度，石油烴含量越高，多樣性越低，群落分布越不均勻。

2.2.3 石油降解微生物優(yōu)勢(shì)菌落分析

門(mén)水平物種相對(duì)豐度如圖 2 所示。

圖2 門(mén)水平物種相對(duì)豐度聚類(lèi)堆積柱狀圖Fig.2 Clustering accumulation histogram of relative abundance of major microbial species at phylum level

由圖2可知，變形菌門(mén)(Proteobacteria)的相對(duì)豐度最高，為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，廣泛存在于石油污染土壤中，說(shuō)明其對(duì)老化石油污染土壤環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)性；放線菌門(mén)(Actinobacteria)在7個(gè)樣品中同樣表現(xiàn)出了豐度優(yōu)勢(shì)；此外，酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)在7個(gè)樣品中均有一定豐度。污染土壤樣品中， YC3樣品與其它樣品在門(mén)水平上有較大的差異，其余樣品微生物組成略有差異，YC2與YC6樣品在門(mén)水平上一致。相較于YC樣品，由于石油烴類(lèi)污染物的攝入，變形菌門(mén)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)的相對(duì)豐度明顯上升，其中石油烴含量較高的YC4樣品中變形菌門(mén)微生物的增加尤為明顯，而放線菌門(mén)的相對(duì)豐度有所降低。表明在石油污染土壤的老化過(guò)程中，變形菌門(mén)微生物增多，而放線菌門(mén)微生物減少。

當(dāng)土壤被石油烴污染時(shí)，相對(duì)豐度顯著升高或新出現(xiàn)的細(xì)菌可以被視為石油烴降解菌(嗜油性細(xì)菌)，而相對(duì)豐度顯著降低的細(xì)菌可以被視為疏油性細(xì)菌[14]。因此推斷延長(zhǎng)地區(qū)嗜油性菌門(mén)為變形菌門(mén)和綠彎菌門(mén)，這與遼河石油污染土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的研究[15]及陜北石油污染土壤微生物多樣性的研究[16]結(jié)果一致。

將相對(duì)豐度前15的物種進(jìn)行屬水平分析，結(jié)果如圖 3 所示。

圖3 屬水平物種相對(duì)豐度聚類(lèi)堆積柱狀圖Fig.3 Clustering accumulation histogram of relative abundance of major microbial species at genus level

由圖3可知，未污染土壤樣品與污染土壤樣品中優(yōu)勢(shì)菌群組間差異較大。不同采樣點(diǎn)屬水平上群落結(jié)構(gòu)有差異，其中YC2與YC6樣品在屬水平上相似性最高。根據(jù)各樣品理化性質(zhì)，可以看出屬水平相似性較高的樣品，其pH值、有機(jī)碳含量相似性最高。污染土壤樣品中主要菌屬有鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、分枝桿菌屬(Mycobacterium)、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、芽孢桿菌屬(Bacillus)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、交替紅色桿菌屬(Altererythrobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardioides)。

對(duì)屬水平占比較高的優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行功能性分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 占比較高的優(yōu)勢(shì)菌群的功能性分析Tab.4 Functional analysis of dominant bacteria with relatively high proportion

石油烴降解菌能將碳?xì)浠衔镛D(zhuǎn)化為能源、生物質(zhì)及生物廢料副產(chǎn)品[26]。石油污染土壤樣品中，共有7個(gè)屬具有石油烴類(lèi)污染物降解功能，其中諾卡氏菌屬和芽孢桿菌屬可產(chǎn)表面活性劑，降低石油烴類(lèi)污染物表面張力，實(shí)現(xiàn)其乳化和增溶；鞘氨醇單胞菌屬含有一組獨(dú)特的芳香化合物降解基因，可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞表面疏水性來(lái)適應(yīng)石油污染環(huán)境。

假單胞菌屬(Pseudomonas)、紅球菌屬(Rhodococcus)、微桿菌屬(Microbacterium)、芽孢桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬等是常見(jiàn)的石油烴降解菌[22]。王耀民[27]從大港油田長(zhǎng)期被原油污染的土壤中分離、篩選出4 株能以原油為唯一碳源的菌株，其中2株原油降解率高的菌株分別為不動(dòng)桿菌屬和芽孢桿菌屬。

2.2.4 微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系

微生物群落結(jié)構(gòu)是土壤微生態(tài)環(huán)境的響應(yīng)，要結(jié)合理化指標(biāo)進(jìn)行分析。對(duì)7個(gè)土壤樣品微生物門(mén)和屬水平與理化性質(zhì)進(jìn)行冗余分析，結(jié)果如圖4所示。

圖4 微生物門(mén)水平(a)、屬水平(b)冗余分析Fig.4 Redundancy analysis of microorganism at phylum level(a) and genus level(b)

由圖4a可知，第一主軸和第二主軸分別解釋了總方差變量的45.38%和30.21%，第一主軸上總氮含量是主要的影響因子，第二主軸上pH值和總鉻含量是主要的影響因子。其中pH值、總氮含量、總鉻含量是微生物門(mén)水平的主要影響因子，石油烴含量也對(duì)微生物門(mén)水平有影響，尤其是與變形菌門(mén)具有顯著的正相關(guān)性。土壤中微生物數(shù)量最多的變形菌門(mén)受pH值的影響較大。鉛含量與石油烴含量存在顯著的相關(guān)性，說(shuō)明石油污染會(huì)導(dǎo)致土壤中重金屬含量升高，進(jìn)而加重土壤污染，與Person相關(guān)性分析(表2)結(jié)果一致。受石油烴的影響，微生物菌門(mén)在結(jié)構(gòu)上會(huì)發(fā)生變化， 其中YC2與YC6樣品的菌門(mén)結(jié)構(gòu)相似性高，其微生物菌門(mén)主要受石油烴含量、鉛含量、pH值的影響；YC4樣品主要受總氮含量的影響；YC1與YC5樣品的菌門(mén)結(jié)構(gòu)相似性較高，與門(mén)水平聚類(lèi)堆積柱狀圖(圖2)結(jié)果一致。

由圖4b可知，第一主軸和第二主軸分別解釋了總方差變量的45.88%和27.69%。第一主軸上pH值、鉛含量、石油烴含量是主要的影響因子，第二主軸上石油烴含量和總鉻含量是主要的影響因子，因此，與微生物群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較高的土壤理化指標(biāo)是石油烴含量、pH值和重金屬含量。Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、分枝桿菌屬與石油烴含量存在顯著正相關(guān)性，推測(cè)其對(duì)石油烴具有良好的降解潛能；分枝桿菌屬與鉛含量具有顯著正相關(guān)性，其對(duì)鉛具有良好的降解性能；鞘氨醇單胞菌屬與pH值具有顯著正相關(guān)性，與石油烴含量具有正相關(guān)性，與荊佳維等[13]的研究結(jié)果一致。Gp3、短波單胞桿菌屬(Brevundimonas)與總鉻含量存在顯著正相關(guān)性，推測(cè)其對(duì)總鉻有降解能力。YC1、YC2、YC5、YC6樣品的菌屬相似性較高，YC3、YC4樣品與其它樣品不同，未污染土壤與污染土壤樣品的菌屬差異性大。

3 結(jié)論

利用 MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)分析了延長(zhǎng)某頁(yè)巖氣井田場(chǎng)地老化石油污染土壤的微生物群落多樣性，采用冗余分析探究了微生物群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，結(jié)論如下：

(1)石油污染土壤偏堿性，土壤污染不均勻，石油烴含量差異較大，由于石油烴污染造成碳氮比失衡，氮含量不足。

(2)石油污染土壤微生物的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)和放線菌門(mén)；鞘氨醇單胞菌屬、分枝桿菌屬、Saccharibacteria_genera_incertae_sedis、芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬、交替紅色桿菌屬和諾卡氏菌屬等 7 種菌屬具有石油烴類(lèi)污染物降解功能，分枝桿菌屬和短波單胞桿菌屬具有重金屬降解功能。

(3)石油污染土壤微生物的多樣性和均勻度均有所下降，石油污染會(huì)導(dǎo)致鞘氨醇單胞菌屬、分枝桿菌屬、芽孢桿菌屬等菌屬的相對(duì)豐度有所上升。

(4)石油污染土壤微生物群落多樣性主要受pH值、石油烴含量和重金屬含量的影響，鉛含量與石油烴含量存在顯著正相關(guān)性，說(shuō)明石油烴的攝入會(huì)導(dǎo)致土壤中重金屬含量上升、營(yíng)養(yǎng)失衡，進(jìn)而加重土壤污染。