一株刺參腸道乳酸菌的發(fā)酵條件及其對刺參生長、非特異性免疫的影響

■袁 磊 宋美玲 周 怡,3 程元秋 黎 葉 邱少卿 趙彥翠

(1.山東商務(wù)職業(yè)學(xué)院糧油食品學(xué)院，山東煙臺 264670；2.膠州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東青島 266300；3.青島瑪斯特生物技術(shù)有限公司，山東青島 266319；4.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東煙臺 264025)

刺參（Apostichopus japonicus）是我國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟動物之一，其養(yǎng)殖產(chǎn)量由2004 年的53 315 噸增加到2020 年的196 564 噸[1-2]。刺參養(yǎng)殖產(chǎn)量的快速增長的同時，養(yǎng)殖過程中其疾病也頻發(fā)，例如：腐皮綜合癥、腫嘴病、排臟綜合癥等疾病[3-6]，嚴重威脅刺參養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)綠色可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展。在刺參疾病防治中，雖然抗生素的效果不錯，但抗生素會使刺參免疫系統(tǒng)更加脆弱，增加了攻毒后刺參的死亡率[7]，同時濫用抗生素引起抗生素殘留、耐藥性細菌的出現(xiàn)等相關(guān)問題[8-11]，因此許多研究者將研究重點放在尋找綠色高效的方法來防治刺參的疾病，其中益生菌的研發(fā)與應(yīng)用越來越受到重視[12-21]。

益生菌是活的、滅活的細菌細胞或者是細菌細胞的一部分，當益生菌通過飼料或者是養(yǎng)殖水體使用時，可改善養(yǎng)殖動物本身腸道菌群或養(yǎng)殖水體菌群，從而達到增強養(yǎng)殖動物抗病力、提高養(yǎng)殖動物健康、促進養(yǎng)殖動物生長、提高飼料利用率、提高養(yǎng)殖動物對外界刺激的耐受力等目的[22]。乳酸菌是常用的益生菌之一，其代謝產(chǎn)生的酸會形成一個不利于食源性致病菌與腐敗菌的生存環(huán)境，代謝產(chǎn)生的過氧化氫、抗菌蛋白肽等物質(zhì)對致病菌和腐敗菌發(fā)揮抑制作用[23]，在人和動物腸道中可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，形成抗菌生物屏障，提高人與動物免疫力。目前，乳酸菌在水產(chǎn)動物中的研究與應(yīng)用較多，但在刺參中應(yīng)用研究較少，已報道外源性乳酸菌對刺參生長、免疫、抗病力的影響[19，24-27]。本研究從刺參腸道中篩選內(nèi)源性乳酸菌菌株入手，在鑒定菌株、探索菌株發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，研究飼料中添加篩選的菌株對刺參生長和非特異性免疫的影響，為開發(fā)潛在的內(nèi)源性乳酸菌菌株，促進刺參養(yǎng)殖綠色可持續(xù)高質(zhì)量發(fā)展提供基礎(chǔ)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 菌株的分離鑒定

自然條件下放養(yǎng)的健康刺參（5頭，平均體重150 g）取自山東東方海洋公司萊州分公司，加冰運輸至實驗室。無菌條件下，獲得5 頭刺參的腸道，將腸道與0.85%的無菌生理鹽水按照重量∶體積比=1∶9的比例混合后，用玻璃勻漿器在冰上充分研磨，然后用無菌生理鹽水按10 倍梯度逐級稀釋，在MRS 瓊脂培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）上涂布，MRS培養(yǎng)基用海水配制，25 ℃、厭氧培養(yǎng)48 h。根據(jù)菌落形態(tài)，挑取單菌落劃線分離至長出單一的單菌落，再挑取單菌落培養(yǎng)，用甘油生理鹽水保種，-80 ℃保存?zhèn)溆谩＜毦崛NA后，進行16S rRNA基因的擴增，具體操作步驟參考Govindaraj 等[28]，序列的測定由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

得到的基因序列在Genebank中利用Blast進行同源性檢索，獲得同源性較高的細菌的16S rRNA 基因序列。用ClustalX（1.8）軟件對從Genbank中獲取細菌的16S rRNA 基因序列和本實驗中菌株16S rRNA 基因的序列進行多序列比對，使用系統(tǒng)發(fā)生推斷軟件包MEGA4.0 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和聚類分析，用Kimura 雙參數(shù)模型計算各序列間的分化距離，其中缺少和不確定的位點在計算中都被省略。通過鄰接法（neighbor joining methods）獲得分支的系統(tǒng)樹，并通過自檢分析（boostrap），將自檢數(shù)據(jù)集設(shè)為1 000 次，進行置信度的檢測。

1.2 菌株的發(fā)酵條件

1.2.1 初始pH對菌株生長的影響

調(diào)節(jié)MRS 培養(yǎng)基的初始pH 分別為1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0，按1.0%的接種量，將菌株接種于MRS培養(yǎng)液中（10.0 mL），每個初始pH設(shè)3個重復(fù)，搖床培養(yǎng)24 h。以MRS培養(yǎng)基為空白，測定發(fā)酵菌液在600 nm處的吸光值（OD值）。

1.2.2 溫度對菌株生長的影響

將菌株按1.0%的接種量，接種于裝有10.0 mL MRS 培養(yǎng)基的試管中，分別放置于15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 ℃下進行搖床培養(yǎng)，每個溫度設(shè)3 個重復(fù)。36 h后，以MRS培養(yǎng)基為空白，測定發(fā)酵液的OD600nm值。

1.2.3 不同的碳源、氮源對菌株生長的影響

在優(yōu)化培養(yǎng)液（酵母浸粉10.0 g/L，磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L、海水1 000.0 mL）中，分別添加麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖4 種不同的碳源各20.0 g/L，每種碳源設(shè)3 次重復(fù)。在優(yōu)化培養(yǎng)液（蔗糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L，海水1 000.0 mL）中，分別添加蛋白胨、酵母浸出粉、硝酸銨、硝酸鉀、尿素5種不同的氮源各10.0 g/L，每種氮源設(shè)3次重復(fù)。以1.0%的接種量，將菌株接種于10.0 mL培養(yǎng)基中，25.0 ℃，搖床培養(yǎng)36 h。以液體培養(yǎng)基為空白，測定發(fā)酵液的OD600nm值。

1.2.4 碳源、氮源的正交優(yōu)化

根據(jù)單因素實驗結(jié)果進行正交實驗。實驗因素水平編碼及設(shè)置見表1。將碳源、氮源按正交表L9（34）配比，添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液（磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L，海水1000 mL）中，以1.0%的接種量，將菌株接種于10.0 mL培養(yǎng)基中，每個實驗組合重復(fù)3次，25 ℃，搖床培養(yǎng)36 h。以液體培養(yǎng)基為空白，測定發(fā)酵液的OD600nm值。

表1 正交實驗因素和水平（g/L）

1.2.5 不同的接種密度對菌株生長的影響

初始接種菌液的濃度為4.70×105CFU/mL，得出最佳碳源和氮源后，用優(yōu)化培養(yǎng)液（蔗糖20.0 g/L、酵母浸粉10.0 g/L、磷酸氫二鉀2.0 g/L、檸檬酸鈉2.0 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、乙酸鈉5.0 g/L、硫酸錳2.0 g/L，海水1 000.0 mL），以0.25%、0.5%、1.0%、2.0%的接種量（對應(yīng)接種密度分別為1.18×105、2.35×105、4.70×105、9.40×105CFU/mL）分別接種于10.0 mL培養(yǎng)基中，每個接種密度重復(fù)3次，25 ℃，搖床培養(yǎng)36 h。

1.3 養(yǎng)殖實驗與樣本采集

健康刺參購買于山東省乳山市一水產(chǎn)公司，在實驗室內(nèi)投喂鼠尾藻粉暫養(yǎng)2 周，每日更換40.0%的海水。根據(jù)乳酸菌的添加量，設(shè)4個處理：M0（對照組）、M5、M7、M9，乳酸菌M2-4 的添加量分別為量0、1.0×105、1.0×107、1.0×109CFU/g。每組4個重復(fù)，每個重復(fù)隨機放置25個大小相似的海參[（2.641±0.047）g]。M0組投喂鼠尾藻粉，其余各組在鼠尾藻粉中添加乳酸菌，將各組飼料與一定量的無菌海水混合后，制成直徑為2～5 mm 的小球，投喂量為刺參體重的1.0%，每天下午18：00 投喂一次，投喂飼料前吸出殘余餌料，更換40%的海水。海水的溫度、鹽度和pH 分別保持在15～18 ℃、30‰～32‰、7.8～8.0。

經(jīng)過30 d的飼養(yǎng)實驗，將刺參饑餓24 h。從每個重復(fù)中隨機抽取6 頭刺參，在無菌條件下進行解剖，收集腸道，去除呼吸樹，用鑷子排盡殘余的糞便，迅速用0.85%無菌生理鹽水漂洗腸道，漂洗完畢后，將6頭刺參的腸道合并在一起放在無菌離心管中為一個樣品。在無菌條件下將樣品剪碎，進行標記并稱重。按照腸道重量∶生理鹽水體積為1∶9 的比例，將腸道和生理鹽水混合，在冰上，用玻璃勻漿器研磨，研磨后用離心管收集勻漿液，勻漿液離心后得到上清液，上清液用于酸性磷酸酶、總一氧化氮合酶、溶菌酶的檢測。

1.4 指標的測定

1.4.1 生長指標的測定

實驗結(jié)束后，對每個處理各重復(fù)中所有刺參進行稱重，計算平均終末體重、刺參增重率和特定生長率。養(yǎng)殖實驗期間，各組刺參成活率均為100%。

增重率（%）=[（Wt-W0）/W0]×100

特定生長率（%/d）=[（LnWt-LnW0）/t]×100

式中：Wt和W0——分別為刺參的平均終末體重和平均初始體重（g）；

t——養(yǎng)殖天數(shù)30 d。

1.4.2 非特異性免疫指標的測定

刺參腸道上清液蛋白質(zhì)含量、酸性磷酸酶（ACP）、總一氧化氮合酶（T-NOS）、溶菌酶（LSZ）活力的測定均采用南京建成生物工程研究所有限公司生產(chǎn)的試劑盒，測定步驟執(zhí)行試劑盒的操作說明。刺參腸道研磨上清液中蛋白質(zhì)的測定采用考馬斯亮藍法；ACP的測定采用磷酸苯二鈉方法；T-NOS的測定以精氨酸為底物進行測定；LSZ的測定采用溶壁微球菌自身對照法。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析方法

所有數(shù)據(jù)使用Excel整理，用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，當顯著性水平P＜0.05，采用Tukey's檢驗進行多重比較。正交實驗進行正交實驗方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

M2-4 菌落在MRS 平板上呈不透明、圓形、乳白色菌落，菌落濕潤，表面光滑、邊緣整齊。經(jīng)過16S rRNA基因測序，通過NCBI-balst進行同源性檢索，從中選取6 株與M2-4 相似性較高的菌株（相關(guān)菌株的16S rRNA基因序列來源和數(shù)據(jù)庫存取號見表2）進行聚類分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖1），菌株M2-4 與Lactobacillus rhamnosusstrain LE40b（KP090127.1）聚在一起，因此將菌株M2-4 鑒定為鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)。

圖1 菌株M2-4的16S rRNA序列聚類分析結(jié)果

表2 16S rRNA基因序列來源和數(shù)據(jù)庫存取號

2.2 菌株的發(fā)酵條件

2.2.1 初始pH對菌株M2-4生長的影響

由圖2 可知，在培養(yǎng)液初始pH＜5.5 之前，菌株的生長量隨著pH的上升而逐漸升高。而當培養(yǎng)液初始pH＞5.5 之后，菌株的生長量則隨著pH 的上升而逐漸降低。當培養(yǎng)液的初始pH為5.5，該菌株的生長量顯著高于pH為1.5、2.5、3.5、4.5、6.5、7.0時的生長量（P＜0.05），但與pH 為6.0 時的生長量差異不顯著（P＞0.05），所以菌株M2-4的最適pH為5.5～6.0。

圖2 初始pH對菌株M2-4生長的影響

2.2.2 溫度對菌株M2-4生長的影響

由圖3可知，20、25 ℃時菌株M2-4的生長量顯著高于其他溫度（P＜0.05），而20、25 ℃時菌株M2-4 的生長量差異不顯著（P＞0.05），表明菌株M2-4 的最適溫度范圍為20～25 ℃。

圖3 溫度對菌株M2-4生長的影響

2.2.3 碳源、氮源對菌株M2-4生長的影響

如圖4所示，菌株對乳糖及麥芽糖的利用能力較弱；對葡萄糖和蔗糖的利用能力較強。蔗糖為菌株M2-4 的最佳碳源，生長量顯著高于葡萄糖、乳糖、麥芽糖（P＜0.05）。如圖5 所示，菌株對尿素、硝酸鉀、硝酸銨3 種無機氮源的利用無顯著差異（P＞0.05）；對酵母提取物和蛋白胨的利用較高，且顯著高于3種無機氮源（P＜0.05）。

圖4 不同碳源對菌株M2-4生長的影響

圖5 不同氮源對菌株M2-4生長的影響

2.2.4 碳源、氮源的正交優(yōu)化結(jié)果

由表3 可知，最佳組合為A3B2C1，OD 值達到了0.285，即蔗糖20.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L。通過極差分析可知RA＞RB＞RC，各因素影響菌體生長程度從大到小依次為蔗糖、酵母提取物、蛋白胨。從方差分析P值（見表4）可以看出：蔗糖和酵母提取物對菌體的生長影響顯著（P＜0.05），而蛋白胨對菌體的生長影響不顯著（P＞0.05）。

表3 正交實驗指示結(jié)果

表4 正交實驗方差分析

2.2.5 不同的接種密度對菌株M2-4生長的影響

如圖6所示，當接種密度為4.70×105CFU/mL 時，菌株的生長量顯著高于1.18×105、2.35×105CFU/mL（P＜0.05），而高接種密度9.40×105CFU/mL 與4.70×105CFU/mL相比并未提高菌株的生長量（P＞0.05），因此菌株M2-4的最適接種密度為4.70×105CFU/mL。

圖6 不同的接種密度對菌株M2-4生長的影響

2.3 乳酸菌M2-4對刺參生長指標的影響

由表5 可知，投喂刺參含有乳酸菌M2-4 的飼料30 d 后，實驗組（M5、M7、M9）刺參的增重率、特定生長率與對照組（M0）相比差異不顯著。

表5 飼料中添加乳酸菌M2-4對刺參生長的影響

2.4 非特異性免疫指標

由表6 可知，投喂刺參含有乳酸菌M2-4 的飼料30 d 后，與對照組相比，當乳酸菌添加量為105、107、109CFU/g 時，刺參腸道ACP、T-NOS 活力顯著提升（P＜0.05），當乳酸菌添加量為105、107CFU/g 時LSZ活力顯著提高（P＜0.05）。當添加量為109CFU/g 時ACP活力最高，LSZ活力以添加量為107CFU/g時最高。

表6 飼料中添加乳酸菌M2-4對刺參腸道免疫酶活性的影響(U/g prot.)

3 討論

隨著飼料全面禁抗，養(yǎng)殖中減抗、限抗，抗生素的替代成為水產(chǎn)養(yǎng)殖研究力求突破的瓶頸。益生菌作為安全、綠色、有效防治水產(chǎn)動物疾病的生物產(chǎn)品，是非常有前景的替抗產(chǎn)品。乳酸菌是在水產(chǎn)養(yǎng)殖上尤其是魚類[29]和蝦類[30-31]上被廣泛研究和應(yīng)用的一類益生菌。近幾年，乳酸菌在刺參上的應(yīng)用研究也越來越受到重視。研究表明，刺參健康的養(yǎng)殖池發(fā)現(xiàn)了乳酸菌[32]，刺參發(fā)病池未檢測到乳酸菌，說明乳酸菌對維持刺參的健康有重要作用。乳酸菌可以促進刺參的生長[19，24-25]、提高其腸道消化酶活力[19，26]、改善刺參腸道菌群[24，26-27]、提高刺參免疫酶活性[24-26]、促進相關(guān)免疫基因的表達[25]、增強其抗病能力[26]。但相對于魚類和蝦類上的研究，仍然缺乏刺參內(nèi)源性乳酸菌的開發(fā)。本實驗從健康刺參腸道分離出一株內(nèi)源性乳酸菌，通過16S rRNA 基因測序及同源性分析將其鑒定為鼠李糖乳桿菌，并初步探明了其發(fā)酵條件包括最適初始pH、適宜溫度、適宜碳源和氮源、氮源和氮源正交、接種密度等，為此菌的后續(xù)研究及其在刺參養(yǎng)殖上應(yīng)用開發(fā)提供基礎(chǔ)資料。

該研究發(fā)現(xiàn)在鼠尾藻粉中添加該菌對刺參的生長并沒有顯著提高的作用。這與在飼料中添加嗜酸乳桿菌并未提高刺參生長[27]的研究結(jié)果一致。也有研究發(fā)現(xiàn)，在養(yǎng)殖池潑灑商業(yè)乳酸菌制品（屎腸球菌和植物乳桿菌的混合制品）可以明顯促進刺參的生長[24]；植物乳桿菌LL11、糞腸球菌LC3 可以促進刺參的生長[25]；一定量的滅活植物乳桿菌L-137 也可以促進刺參的生長[19]。因此乳酸菌對刺參的生長是否有顯著的促進作用，可能與乳酸菌的種屬有關(guān)，對生長的促進作用可能具有菌株特異性。本養(yǎng)殖實驗僅進行了30 d，更長周期的添加實驗有待開展，以更全面地驗證該株鼠李糖乳桿菌M2-4對刺參生長的影響。

刺參的免疫主要依靠非特異性免疫來抵抗病原的入侵。ACP、NOS、LSZ等酶活力都是反映刺參非特異性免疫能力的重要指標。在刺參的免疫體系中起著重要的作用[24]。ACP 作為一種重要的溶酶體酶的組成部分，是溶酶體的標志酶，在無脊椎動物的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，可以消化入侵生物體的異物[33]。NOS調(diào)控一氧化氮（NO）的生成，NO是動物體內(nèi)重要的信使分子、效應(yīng)分子、免疫調(diào)節(jié)分子，參與多種生理活動。免疫細胞受到外源刺激時，可以誘導(dǎo)NOS的表達，進而促進生物體合成NO，NO 可以與機體內(nèi)的超氧陰離子結(jié)合生成過氧化氮，過氧化氮是帶有高度毒性的產(chǎn)物，可以通過非特異性的方式來殺死入侵機體的病原，增強動物的免疫能力[34]。LSZ 是一種堿性蛋白，可以通過破壞細胞壁中的肽聚糖從而水解細菌的細胞壁，在刺參的非特異性免疫中有著重要作用[35]。和對照組相比，當乳酸菌添加量為105、107、109CFU/g時，刺參腸道ACP、T-NOS活力顯著提升，當乳酸菌添加量為105、107CFU/g時LSZ活力顯著性提高，這表明該乳酸菌在一定的添加水平上可以通過提高刺參腸道的ACP、T-NOS、LSZ 活力，從而促進刺參對體內(nèi)異物的分解、促進刺參NO 的生成、提高刺參的殺菌能力，從而增強機體的免疫力。

4 結(jié)論

①該研究通過MRS海水培養(yǎng)基從自然放養(yǎng)的健康刺參腸道中篩選出一株乳酸菌菌株M2-4，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定，確定其為鼠李糖乳桿菌。

②該菌株的發(fā)酵條件研究表明：其發(fā)酵最適初始pH 為5.5～6.0；最適發(fā)酵溫度為20～25℃；最適碳源為蔗糖；最適氮源為酵母提取物；最優(yōu)的碳源、氮源組合為蔗糖20.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、蛋白胨2.5 g/L；發(fā)酵最適接種密度為4.70×105CFU/mL。

③在鼠尾藻粉中添加1.0×105、1.0×107、1.0×109CFU/g 乳酸菌M2-4投喂刺參30 d，雖然刺參的生長沒有顯著變化，但刺參腸道ACP、T-NOS、LSZ 活力提高，根據(jù)以上酶活力指標判斷該菌在鼠尾藻粉中的適宜添加量為105～107CFU/g。