酶解豆粕飼料對草魚腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

■胡雪晴 郎宇曦 呂福軍 黃紫薇 潘雨佳 李應(yīng)東*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽 110866；2.沈陽波爾萊特飼料有限公司，遼寧沈陽 110000)

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，養(yǎng)殖產(chǎn)量和養(yǎng)殖面積近年來均處于魚類養(yǎng)殖之首[1]，并且在我國水產(chǎn)飼料體量中，草魚料的容量也是最大的（600萬噸/年）[2]。因此，尋求價格低廉、來源廣泛、回報率高的草魚飼料，對于草魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展具有重要作用。豆粕（SM）中蛋白質(zhì)含量高、價格實惠，被常用來作為水產(chǎn)飼料中的植物性蛋白源，但豆粕中含胰蛋白酶抑制因子、非淀粉多糖和植物血凝素等抗?fàn)I養(yǎng)因子會降低飼料蛋白質(zhì)消化率，影響水產(chǎn)動物的健康生長[3]。葉元土等[4]研究發(fā)現(xiàn)，豆粕飼料喂養(yǎng)的草魚血清谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力顯著高于對照組，顯示肝胰臟可能受到一定程度的影響。當(dāng)添加量到達60%時，引起草魚肝胰臟代償性增大，肝胰臟的蛋白酶活力顯著下降，推測是由一種或幾種抗?fàn)I養(yǎng)因子引起的[5]。豆粕經(jīng)發(fā)酵或酶解處理后，營養(yǎng)價值會顯著提高，酶解豆粕（ESM）中的抗?fàn)I養(yǎng)因子被徹底去除，將大豆蛋白水解為更容易被機體利用的小分子肽類物質(zhì)，產(chǎn)生對動物體有積極作用的活性物質(zhì)，更適于水產(chǎn)動物的喂養(yǎng)，是水產(chǎn)動物飼料中理想植物蛋白[6]。ESM對珍珠龍膽石斑魚幼魚蛋白質(zhì)合成代謝有促進作用,可改善脂肪蓄積，提高幼魚抗氧化能力[7]。ESM替代魚粉對大口黑鱸的生長性能和消化酶活力均有較好的促進作用[8]。ESM替代魚粉及添加包膜氨基酸和植酸酶可提高花鱸的生長性能,降低養(yǎng)殖水質(zhì)中氨氮、亞硝酸鹽氮和磷的排放,改善花鱸養(yǎng)殖水質(zhì)[9]。腸道是草魚重要的消化器官，腸道微生物組成易受飼料的影響，進而影響草魚的多種生理進程。飼料中添加大蒜能有效提高草魚腸道非特異免疫因子能力和改善腸道結(jié)構(gòu)[10]。飼料中添加桿菌七肽能促進草魚生長，改善腸道健康[11]。飼料中ESM添加水平對草魚腸道微生物菌群的影響尚不清楚。本研究以草魚為研究對象，分析了不同比例ESM飼料對草魚生長及腸道微生物菌群的影響，為ESM在草魚及其他魚類飼料中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料的制作及概略養(yǎng)分測定

實驗設(shè)計豆粕（SM）含量為32%基礎(chǔ)飼料（A）作為對照組，然后采用ESM分別替代基礎(chǔ)飼料中的普通豆粕和魚粉，組成了32% ESM 組（B）、36% ESM 組（C）和40% ESM 組（D），其中C 組和D 組飼料中魚粉添加量分別為8%和4%，實驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。酶解豆粕、礦物質(zhì)預(yù)混料和維生素預(yù)混料均由沈陽市波爾萊特飼料有限公司提供。所有原料均經(jīng)過齒爪式粉碎機粉碎（9FC-28，農(nóng)百順）后過20 目篩網(wǎng)，按照實驗配方稱重后充分手動混勻，加入10%水后采用顆粒飼料壓制機（農(nóng)百順）在120 ℃制成粒徑2.5 mm 的沉性顆粒飼料，用50 ℃的烘干箱（XMTD-8222）烘干2 h 后，在陰涼通風(fēng)處降溫，儲存于4 ℃水箱中備用。飼料樣品水分測定采用105 ℃烘箱干燥恒重法（GB/T 6435—2014）測定，粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量依次采用凱氏定氮法（GB/T 6432—2018）、索氏抽提法（GB/T 6433—2006）和馬福爐550 ℃灼燒法（GB/T 6438—2007）測定。

表1 實驗飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.2 SDS-PAGE電泳分析

采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對制備得到的普通豆粕（SM）和酶解豆粕（ESM）分離蛋白分子組成進行分析（見圖1）。電泳條件為：濃縮膠濃度5%，分離膠濃度10%，150 V 電壓跑膠52 min。采用低分子質(zhì)量的標準蛋白，用考馬斯亮藍R-250 染色30 min后加熱快速脫色，脫色后保存并拍照。

圖1 普通豆粕（SM）和酶解豆粕（ESM）蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖

1.3 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗草魚于2021 年10 月25 日購于沈陽市蘇家屯養(yǎng)殖戶，后轉(zhuǎn)運至沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)與醫(yī)學(xué)學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室。試驗正式開始之前進行兩周的暫養(yǎng)，暫養(yǎng)期間投喂草魚基礎(chǔ)飼料（沈陽禾豐水產(chǎn)飼料有限公司）。試驗共設(shè)4個飼料處理組，每組3個平行，每個平行草魚25尾，初始體重（55.39±1.82）g，養(yǎng)殖桶的尺寸為1.2 m×0.8 m，水深1 m。對草魚進行24 h的饑餓處理后，挑選體格健壯、體表無傷、規(guī)格均勻的草魚，隨機分配到桶中，每天投喂一次（17：00），投喂量為體重的2%左右，根據(jù)攝食情況調(diào)整，養(yǎng)殖期間24 h連續(xù)充氧，每兩周稱重一次。養(yǎng)殖實驗為期8 周，期間每天換水1/2，并清理池底糞便，保證水質(zhì)條件如下：氨氮＜0.1 mg/L，亞硝態(tài)氮＜0.01 mg/L，溶解氧＞5 mg/L，pH 7.8±0.3，水溫（20±1.8）℃。

1.4 草魚生長指標的測定

試驗期間，分別在第3周、5周和8周對每只魚體進行稱重。試驗結(jié)束后計算生長指標。

存活率（SR，%）=100×試驗結(jié)束魚尾數(shù)/試驗初魚尾數(shù)

增重率（WGR，%）=100×(終末均重-初始均重)/初始均重

特定生長率（SCR，%/d）=100×（終末體重-初始體重）/飼養(yǎng)時間。

1.5 草魚腸道微生物指標的測定

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，在各組中隨機選取3 尾魚，在實驗室無菌條件下進行解剖，采用0.9%生理鹽水沖洗魚體表面，進行解剖后，采取全腸，放置凍存管中并標記后，立即置于液氮中冷凍，隨后干冰運送到上海派森諾公司進行腸道微生物16S rRNA V3-V4區(qū)宏基因組分類測序，引物序列為：正向：ACTCCTACGGGAGGCAGCA 反向：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。采用Illumina 平臺對群落DNA 片段進行雙端（Paired-end）測序。測序原始數(shù)據(jù)以FASTQ 格式保存，切除序列的引物片段，棄去未匹配引物的序列，然后調(diào)用DADA2 進行質(zhì)控、去噪、拼接、去嵌合體。在97%相似度水平對高質(zhì)量序列聚類，分別輸出代表序列和OTU表。使用RDP FrameBot軟件，對核酸序列中的插入和缺失錯誤進行糾正，獲得校正的核酸序列和蛋白序列。利用QIIME2（2019.4）軟件與參考序列數(shù)據(jù)庫進行比對。利用QIIME2（2019.4）軟件計算樣本Alpha多樣性指數(shù)，以Chao1和Observed species指數(shù)表征豐富度，以Shannon 和Simpson 指數(shù)表征多樣性，以Goods_coverage指數(shù)表征覆蓋度，計算Beta多樣性。

1.6 數(shù)據(jù)處理分析

結(jié)果用“平均值±標準差”表示。用SPSS Statistics26.0 對測得數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA）和Duncan’s 法多重比較。以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同比例ESM對草魚生長性能的影響

由表2可知，飼料中添加32%ESM使草魚增重率顯著高于其他組（P＜0.05），36%ESM 組和對照組無顯著差異（P＞0.05），40%ESM 組末重和增重率顯著低于其他組。試驗期間，4組草魚存活率均達到100%。

表2 不同時期草魚的體重

2.2 腸道微生物樣高通量測序結(jié)果分析

由表3可知，經(jīng)16S rDNA測序，共得到1 119 294條有效序列。由圖2可見，12個樣品中共產(chǎn)生7 921個OTU，共同擁有OTU數(shù)為804，占其總數(shù)的10.15%。

圖2 草魚腸道微生物群落組成Venn圖

表3 不同樣本草魚腸道細菌的序列數(shù)量統(tǒng)計

2.3 腸道微生物群落多樣性指數(shù)分析

由圖3可知，飼料中高添加量ESM對草魚道微生物的豐富度和多樣性有顯著影響。飼料中添加32%ESM草魚腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)與對照組無顯著影響（P＞0.05），隨著酶解豆粕替代比例的增高，36%ESM 組Simpson 顯著低于對照組（P＜0.05），40%ESM組Pielou_e指數(shù)也顯著降低（P＜0.05）。

圖3 不同比例ESM對草魚腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)的影響

2.4 腸道微生物群落組成分析

由圖4可知，在門水平下，4個處理組中優(yōu)勢菌門由變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria）5個門組成。A組與B組菌類組成在門水平上無顯著差別，梭桿菌隨著ESM添加量的增高而降低，而擬桿菌則相反。當(dāng)ESM比例為40%時，放線菌門（Actinobacteria）在草魚腸道菌群中的相對豐度最高(20.25%)。

圖4 不同ESM添加量下草魚腸道菌群門水平組成

2.5 腸道微生物群落相對豐度

由圖5草魚腸道微生物種水平聚類熱圖表明，嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila）隨著ESM添加量的增加而增多。馬氏副球菌（Paracoccus marcusii）、噬氨副球菌（Paracoccus aminovorans）、普拉梭菌（Faecalibacterium Prausnitzii）在32%ESM 組顯著高于其他組。

圖5 不同ESM添加量下草魚種水平聚類熱圖

2.6 PCA組成分布分析

由圖6可知，A組與B組分離不明顯，C組、D組分離明顯，36%和40%比例ESM組與對照組和32%比例ESM組差異較大。

圖6 屬水平下PCA相對豐度分析

3 討論

對于水產(chǎn)養(yǎng)殖動物而言，豆粕中含有大量植物過敏源和抗?fàn)I養(yǎng)因子，使蛋白質(zhì)的消化率和生物學(xué)效價遠不及魚粉等動物源性蛋白質(zhì)，影響機體的對營養(yǎng)物質(zhì)的利用率[12]。降低或消除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子、提高水產(chǎn)動物消化率是當(dāng)前漁用飼料工業(yè)發(fā)展的重要問題之一。ESM 可以有效去除豆粕中的部分抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而可以提水產(chǎn)動物對豆粕中營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收及利用[6]。本研究結(jié)果表明，與對照組普通豆粕相比，等量的ESM 替代飼料顯著增加了草魚的體重、特定生長率等生長性能。而ESM替代比例為40%時，生長性能下降。這與其他魚類的研究結(jié)果類似，李學(xué)麗[7]發(fā)現(xiàn)，過高的ESM 添加量會抑制珍珠龍膽石斑魚幼魚的生長。在飼料中使用50%ESM 替代魚粉會導(dǎo)致黑鱸生長率、飼料轉(zhuǎn)化率顯著降低[13]。蛋白飼料是水生動物日糧中的重要組成部分，配比、含量、種類在很大程度上會影響動物的生長性能及其品質(zhì)。適宜的植物蛋白比例，對水生動物的生長和飼料轉(zhuǎn)化率的效果最佳，超過適宜比例則會引起其機體生長性能急劇下降[14]。未來可通過對酶解技術(shù)的改進，進一步提高易消化吸收的小肽含量，或且同時補充低成本動物性營養(yǎng)元素，如利用黑水虻幼蟲繼續(xù)處理酶解后豆粕等方法，使水生動物對ESM中營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率的進一步提升[15]。

魚類的腸道微生物在物質(zhì)能量代謝方面的重要作用，對于深入研究魚類與食物之間的關(guān)系尤為重要[16-17]。目前，圍繞草魚腸道微生物與飼料添加劑間關(guān)系的研究較多，飼料中添加大蒜和茯苓[10]、丁酸鈉[18]、大豆油[19]和木聚糖酶[20]等，均可以改善和優(yōu)化草魚腸道菌群結(jié)構(gòu)。ESM 中含有小肽、益生菌、有機酸等豐富營養(yǎng)物質(zhì)，適宜的比例可提高腸道微生物多樣性，為不同菌群生長繁殖提供舒適的環(huán)境。何嬌嬌等[21]發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕替代魚粉對大黃魚腸道微生物的香農(nóng)多樣性指數(shù)、辛普森指數(shù)和覆蓋率沒有顯著影響。本研究發(fā)現(xiàn)，32%ESM飼料草魚腸道微生物多樣性指數(shù)略有上升，但無顯著差異。這些不同的結(jié)果，可能與所用ESM 的種類、發(fā)酵菌種、代謝產(chǎn)物和替代魚粉的比例以及環(huán)境等因素有關(guān)。然而，當(dāng)添加量超過36%時，多樣性指數(shù)顯著降低。

草魚腸道中優(yōu)勢菌門主要有變形菌、厚壁菌、放線菌、擬桿菌和梭桿菌[16]，與本研究結(jié)果相同。但不同處理組中，優(yōu)勢菌門比例不同，A組與B組菌類組成在門水平上無顯著差別，梭桿菌隨著ESM添加量的增高而降低，而擬桿菌則相反。Koren等[22]認為，低密度的脂蛋白膽固醇和總膽固醇與梭桿菌門中的菌群的含量成正比，推測梭桿菌門相對豐度的降低可能會促進動物機體對飼料中脂類的利用。與其他魚類相比，草魚動物更容易積累擬桿菌。歐洲鰉腸道菌群中擬桿菌門的豐度隨飼料中植物棉籽蛋白的增加而升高[23]。當(dāng)ESM 比例為40%時，放線菌門（Actinobacteria）在草魚腸道菌群中的相對豐度最高（20.25%）。

索氏鯨桿菌屬廣泛存在于淡水魚腸道中，其可通過代謝產(chǎn)物乙酸激活副交感神經(jīng)系統(tǒng)，從而促進魚類胰島素表達和糖利用能力，對魚體健康起重要調(diào)控作用[24]。本試驗中ESM 比例為32%時鯨桿菌屬的豐度最高，可以促進維生素B12的合成，為機體提供營養(yǎng)需要保持機體健康穩(wěn)定[25]。隨著ESM比例提升，草魚腸道中梭桿菌門和鯨桿菌屬豐度下降，后壁菌門則上升，與Catalán 等[26]對大西洋鮭的研究結(jié)果相似。此外，普拉梭菌也在B 組豐度最高，其為丁酸的重要生產(chǎn)者之一，具有抗炎作用，維持細菌酶的活性，保護消化系統(tǒng)免受腸道病原體的侵害[27]。