茶多酚對圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎的調(diào)節(jié)作用及機制

■孫奕爍 安彥昊 馬學(xué)虎 竇文麗 寶 華 馬燕芬，*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，寧夏銀川 750021；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，動物營養(yǎng)與飼料研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

奶牛健康養(yǎng)殖與消費者餐桌上乳制品質(zhì)量密切相關(guān)。因此，保證奶牛健康生長和泌乳是十分重要的。圍產(chǎn)期（產(chǎn)犢前21 d 至產(chǎn)犢后21 d）作為奶牛泌乳周期中極為重要的一段時間，需要經(jīng)歷妊娠、分娩、泌乳、換料、環(huán)境變化等重要的生理和代謝變化過程，從而遭受一系列應(yīng)激導(dǎo)致奶牛產(chǎn)生自由基和清除自由基的能力失衡，能量需求和耗氧量需求增大，活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成增多，降低了奶牛機體的抗氧化能力，引起機體脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致奶牛就會處于氧化應(yīng)激（oxidative stress, OS）狀態(tài)[1]。持續(xù)的氧化應(yīng)激不僅會損傷奶牛乳腺上皮細胞（bovine mammary epithelial cells, bMECs）的功能，還會影響奶牛的產(chǎn)奶量和乳制品的質(zhì)量[2]，同時也是降低圍產(chǎn)后期奶牛免疫功能、增加炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵原因[3]。因此，降低和預(yù)防奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激對促進奶牛健康泌乳具有重要意義。茶多酚可以通過抑制丙二醛（malondialdehyde, MDA）和ROS 的產(chǎn)生，提高血清中抗氧化酶活性，降低機體脂質(zhì)過氧化水平，進而減緩奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生的氧化損傷[4]，在環(huán)保無毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性的前提下，可應(yīng)用于預(yù)防圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎的形成且在加快奶牛健康綠色養(yǎng)殖方面發(fā)展前景極為廣闊。

1 圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎致病機制

1.1 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的乳腺炎

圍產(chǎn)期奶牛面臨泌乳能量需求遠大于干物質(zhì)攝入量的問題，極易造成能量負平衡（negative energy balance, NEB），引起機體動員大量脂質(zhì)代謝從而顯著增加ROS和自由基的產(chǎn)量，產(chǎn)生的多余的ROS和自由基就會隨血液循環(huán)進入乳腺并聚集在乳腺內(nèi)，如果不能及時清除，極易使奶牛機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致全身機體免疫應(yīng)答降低，進而引起機體免疫功能失衡，最終導(dǎo)致乳腺炎的發(fā)生[5]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細胞炎性反應(yīng)是由于氧化應(yīng)激激活了如絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）、NF-κB（nuclear factor-kappaB, NF-κB）等多個信號通路[6]而導(dǎo)致的。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，由線粒體持續(xù)生成的ROS 能通過激活MAPK 信號通路下游的c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase, JNK）、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2）和p38MAPK，從而誘發(fā)細胞炎性反應(yīng)和凋亡[7]；其次，ROS還可以通過激活ERK、NF-κB、p38MAPK 信號通路，從而激活Nalp-3炎性復(fù)合體引起炎性反應(yīng)[8-10]；此外，作為胞內(nèi)模式識別受體的Nalp-3炎性復(fù)合物還能夠加快白細胞介素-18（Interleukin-18, IL-18）與白細胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）成熟，從而引起炎性反應(yīng)的發(fā)生[10]。NF-κB與MAPK信號通路還可以通過增強腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的表達，誘導(dǎo)細胞炎性反應(yīng)和凋亡[11]，引起奶牛乳腺產(chǎn)生炎癥，使奶牛免疫功能降低，導(dǎo)致奶牛乳腺炎的發(fā)生[12]。

1.2 高精料日糧誘發(fā)的乳腺炎

隨著消費者生活水平提高和居民飲食結(jié)構(gòu)改變，加大了對乳產(chǎn)品的需求。為了極大程度提高奶牛產(chǎn)奶量，通常會增加奶牛日糧中的精料比例。但長時間飼喂高精料日糧會出現(xiàn)奶牛瘤胃菌群紊亂等一系列問題，導(dǎo)致瘤胃釋放大量的細菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）[13]，引發(fā)奶牛發(fā)生亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis, SARA）[14]，顯著降低瘤胃液pH，增加瘤胃肽聚糖片段—γ-D-谷氨酸-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸（γ-d-glutamyl-meso-diaminopimelic acid, iE-DAP）濃度并使其易位進入血液，通過觸發(fā)奶牛乳腺中的核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白1（Nucleotide oligomerization domain protein 1, NOD1）/半胱天冬酶-8（Caspase-8）途徑來誘導(dǎo)乳腺上皮細胞產(chǎn)生炎癥和凋亡[15]。高精料日糧誘導(dǎo)的奶牛SARA會增加iE-DAP 濃度，iE-DAP 結(jié)合NOD1 后激活了奶牛乳腺中炎性轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，引發(fā)乳腺促炎反應(yīng)，顯著上調(diào)促炎因子IL-1β、白細胞介素-6（Interleukin-6, IL-6）和TNF-α的表達量[16]。此外，Toll 樣受體4（Tolllike receptor 4, TLR4）/NF-κB信號通路在奶牛高精料日糧誘導(dǎo)的乳腺中也會被激活，TLR4被LPS激活后，緊接著會激活髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）的依賴途徑和下游信號分子，包括NF-κB、MAPK 和干擾素調(diào)節(jié)因子3（Interferon regulatory factor 3, IRF3），促使乳腺分泌大量炎細胞因子，最終誘發(fā)乳腺炎[17]。這表明NOD1/NF-κB 和TLR4/NF-κB兩種炎癥信號通路協(xié)同觸發(fā)了高精料日糧誘導(dǎo)的乳腺中的促炎反應(yīng)，這種協(xié)同作用無疑加劇了SARA誘導(dǎo)的乳腺的損傷。另外，飼喂高精料日糧也會引起消化道衍生的LPS 和組胺激活奶牛乳腺中的炎癥反應(yīng)[17-18]，增加了瘤胃屏障、腸道屏障和血乳屏障的通透性[19]。由于奶牛產(chǎn)后大量泌乳，乳腺血流量增加，大量的LPS和組胺就會經(jīng)血液循環(huán)聚集在乳腺組織中，從而導(dǎo)致奶牛乳腺發(fā)生炎性反應(yīng)。因此，奶牛泌乳初期和高峰期飼喂高精料日糧導(dǎo)致的SARA可能與奶牛乳腺炎的發(fā)生密切相關(guān)。

1.3 病原微生物入侵引起的乳腺炎

病原微生物入侵也是引起奶牛乳腺炎的主要誘發(fā)因素之一，致病菌突破乳頭管的屏障侵入乳腺組織后迅速定植并且產(chǎn)生大量內(nèi)毒素和外毒素。乳頭管因其結(jié)構(gòu)與內(nèi)襯的角質(zhì)蛋白成為預(yù)防病原菌入侵的第一道物理性防御屏障，可以封閉管道，角質(zhì)蛋白中的高濃度脂肪酸還能夠精準(zhǔn)杜絕病原菌與細菌的繁殖，乳頭末端含有的括約肌也對病原菌入侵乳腺起到主要屏障作用，可以在乳汁與外界病原菌之間建立一道屏障，以防止細菌入侵；其次，乳汁中的殺菌成分和體細胞，尤其是中性粒細胞和巨噬細胞也有免疫防御作用。但是，如果擠奶后乳腺導(dǎo)管的括約肌開放、閉合不全或者乳頭管的角蛋白塞部分丟失，那么就會損傷乳房的第一道物理性防御屏障，很容易導(dǎo)致病原菌突破乳頭管的屏障侵入乳腺增加感染乳腺的幾率[20]。奶牛乳腺炎根據(jù)流行病學(xué)分為環(huán)境性乳腺炎和傳染性乳腺炎[21]。環(huán)境性病原微生物大腸桿菌（Escherichia coli, E. coli）主要通過乳頭孔進入乳頭管后，在乳池或乳腺中大量繁殖感染，導(dǎo)致乳汁異常，乳腺產(chǎn)生局部炎癥甚至全身性臨床癥狀[22]，其主要毒力因子LPS激活TLR4 后，激活MyD88 依賴途徑，活化的MyD88可與IL-1 受體相關(guān)激酶（interleukon-1receptorassociatedkinase, IRAK）和轉(zhuǎn)化生長因子β激活性激酶（TGFβ-activated kinase 1, TAK1）結(jié)合，最終激活NFκB，誘導(dǎo)乳腺產(chǎn)生促炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和白細胞介素-12（Interleukin-12, IL-12）[23]，并刺激趨化因子（如IL-8 和RANTES）的表達來誘導(dǎo)乳腺產(chǎn)生強烈的炎性反應(yīng)[24]。傳染性病原微生物金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）入侵乳腺組織后主要定植于乳頭管，隨之大量釋放毒性休克綜合毒素1（toxic shock syndrome toxin 1, TSST-1）、表皮剝脫毒素（exfoliative toxins）、葡萄球菌腸毒素（staphylococcal enterotoxins, SE）和溶血素（hemolysins）等毒力因子[25]，這些毒力因子分泌在乳腺上皮細胞的表面并大量表達，緊接著迅速與宿主細胞外基質(zhì)成分黏附進而損害宿主細胞甚至破壞機體免疫系統(tǒng)[26]。病原微生物刺激奶牛乳腺組織后會產(chǎn)生不良影響甚至?xí)斐刹豢赡娴膿p傷，導(dǎo)致產(chǎn)奶量下降給乳制品行業(yè)帶來巨大損失[27]。

2 茶多酚

茶多酚是一種健康安全的植物制劑，是茶葉中多酚化合物的總稱[28]，主要來源于各種茶葉、茶片、茶碎末和茶樹鮮葉等原料中[29]，市場純度90%茶多酚參考價格為340元/kg[30]，主要富含黃烷酮類、花色素類、黃酮醇類、花白素類和酚酸及縮酚酸類等生物活性化合物[31]，其中最重要的是黃烷酮類中的兒茶素類化合物，占茶多酚總量的65%～80%，為活性多羥基結(jié)構(gòu)[32]。茶多酚具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、防癌和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[33]。茶葉中豐富多樣的維生素和礦質(zhì)元素，有助于維持動物機體的正常生長代謝，提高機體的免疫能力及抗氧化能力。因茶多酚具有營養(yǎng)豐富、價格低廉等特點又富含天然活性物質(zhì)可以作為一種綠色安全的飼料添加劑應(yīng)用在反芻動物的飼料原料中，具有極大的潛在發(fā)展市場，在動物生產(chǎn)中越來越受到重視。

3 茶多酚對圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎的調(diào)節(jié)作用

3.1 茶多酚在反芻動物中的應(yīng)用

茶葉是一種價格適中、來源廣泛、富含多種活性功能的天然植物。茶提取物可以作為畜禽的飼料原料或添加劑，具有很大的潛在發(fā)展市場。目前茶提取物在反芻動物中的應(yīng)用越來越多。在奶牛上的研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加1%烏龍茶粉飼喂奶牛后，能提高奶牛產(chǎn)奶量10%以上，節(jié)約飼養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟效益[34]。日糧中添加20 g/（頭·d）綠茶提取物能夠增加奶牛機體抗氧化能力和免疫力，降低乳中體細胞數(shù)，提高奶牛產(chǎn)奶量[35]；而在奶牛日糧中添加50 g/（頭·d）純度為23%的茶多酚除能夠提高奶牛機體免疫能力和產(chǎn)奶量外，還能發(fā)揮抗菌作用[36]。本課題組的研究也發(fā)現(xiàn)，在奶牛圍產(chǎn)期補充0.2 g/kg 茶多酚能夠通過增加血漿中抗炎細胞因子濃度，降低促炎細胞因子濃度，緩解高酮血癥奶牛的炎癥反應(yīng)，進一步改善哺乳早期高酮血癥奶牛的產(chǎn)奶量和健康狀況[37]。奶牛飼糧中適量添加茶及其副產(chǎn)品除了能夠提高奶牛乳產(chǎn)量和乳品質(zhì)還能改善奶牛腸道微生物的菌群數(shù)量。以上奶牛方面的研究提示茶多酚作為一種價格適中且具有多功能的活性物質(zhì)，具有抗氧化作用和抗炎作用，可提升奶牛健康狀況和生產(chǎn)性能。在羊上的研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加80 mg/（只·d）茶多酚能夠提高波爾山羊血清中的抗氧化能力，并且在開始飼喂后的30 d左右，其血清的抗氧化水平達到高峰[38]。在反芻動物上的研究說明茶多酚作為飼料添加劑在促進反芻動物健康和生產(chǎn)性能方面有很大作用。此外，在反芻動物飼糧中添加適量的茶多酚還能夠抑制乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase, LDH）的活性，緩解氧化應(yīng)激對反芻動物的損害，提升反芻動物免疫力方面有很大作用[39]。

3.2 茶多酚的抗氧化作用及機制

反映機體總抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC）的生物標(biāo)志物主要有超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase, GST）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）、MDA和α-生育酚等[40]。提升圍產(chǎn)期奶牛的T-AOC能夠顯著降低圍產(chǎn)期奶牛由氧化應(yīng)激引起的乳腺炎發(fā)病率[41]。在奶牛飼糧中添加茶多酚能夠增強血清中抗氧化酶GSH-Px、SOD 和CAT 活性，降低血清中MDA含量，同時降低機體脂質(zhì)過氧化水平[33，42-43]，抗氧化酶對自由基有高效清除作用，可以更好的清除自由基[44]。茶多酚里的酚羥基可結(jié)合氫離子生成酚氧自由基，滅活活性較強的自由基[45]?？诜辔箓抽T氏菌感染的小鼠茶多酚，可以增強SOD 和CAT 活性，降低MDA 含量，表明茶多酚具有調(diào)節(jié)鼠傷寒沙門氏菌所致回腸損傷過程中氧化應(yīng)激的能力[46]。在H2O2誘導(dǎo)的bMECS模型中，茶多酚可以通過下調(diào)MAPK通路中ERK1/2 和p38MAPK 的表達來促進核因子E2 相關(guān) 因 子2（nuclear factor erythroidderived 2-like 2,NFE2L2）介導(dǎo)的血紅素氧合酶1（Heme oxygenase 1,HMOX-1）的表達，從而減緩bMECS受到氧化應(yīng)激造成的損傷[47]。茶多酚中的多酚類化合物作為發(fā)揮抗氧化作用的主要因子可能是茶多酚能夠顯著提高機體抗氧化水平的關(guān)鍵作用機制，它能夠激活NFE2L2/HMOX1 通路增加抗氧化酶活性，抑制與ROS 生成有關(guān)的酶進而清除ROS，使細胞產(chǎn)生的氧化損傷有所緩解[4]。以上結(jié)果提示，茶多酚可以顯著增加機體抗氧化水平，對自由基有高效清除作用，在加強奶牛健康綠色養(yǎng)殖方面寓意深遠。

3.3 茶多酚的抗炎作用及機制

圍產(chǎn)期奶牛氧化應(yīng)激與炎癥關(guān)系密切[48]。氧化應(yīng)激促發(fā)炎性反應(yīng)的方式主要是通過激活促炎因子信號通路。如ROS 能夠激活氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，引起一系列促炎因子和其他的脂質(zhì)介質(zhì)表達上調(diào)，造成乳腺組織炎性損傷，引起乳腺炎[22]。多酚類化合物具有抗炎作用，其抗炎機制主要是通過調(diào)控抑制多種炎癥信號通路，抑制多種細胞因子和參與促炎相關(guān)的酶如環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2,COX-2）與誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（induciblenitric oxide synthase, iNOS）來抑制巨噬細胞的吞噬速率繼而下調(diào)促炎細胞因子的表達。如茶多酚中黃酮類化合物柚皮素和桑色素可通過調(diào)控低氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1, HIF-1）、NF-κB 和MAPK 信號通路，降低促炎因子IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β的表達，減輕LPS 誘導(dǎo)的bMECS炎癥[49-50]。此外，茶多酚中表兒茶素通過抑制bMECs 中IκB 激酶β（inhibitor kappa B kinaseβ,IKKβ, IKK-β）激酶活性，從而降低了NFκB通路的活性，進而下調(diào)炎性介導(dǎo)因子COX-2和iNOS的表達，降低前列腺素E2（prostaglandinE2, PGE2）和一氧化氮（nitric oxide, NO）的表達[51]，最終導(dǎo)致促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的表達量顯著下調(diào)，從而發(fā)揮抗炎作用[52]。此外，茶多酚中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechingallate, EGCG）能夠通過上調(diào)幾種不同的miRNA 從而影響基因調(diào)控和細胞增殖和凋亡等細胞功能[53]。EGCG通過促進人類軟骨細胞中has-miR-140-3p 的表達來抑制IL-1β誘導(dǎo)的解聚素金屬5 蛋白酶（depolymerizing metalloproteinase 5）的表達從而抑制炎性反應(yīng)[54]。以上研究說明，茶多酚發(fā)揮抗炎作用的方式主要有：抑制炎性反應(yīng)的多種信號傳導(dǎo)途徑，從而下調(diào)促進炎癥級聯(lián)發(fā)應(yīng)的促炎細胞因子和炎癥介導(dǎo)因子的表達；通過調(diào)控miRNA 進而調(diào)控基因表達和細胞功能。所以，利用茶多酚來抑制促炎細胞因子表達抑制炎癥級聯(lián)反應(yīng)，可為我們預(yù)防圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎發(fā)病提供一種新思路。

3.4 茶多酚的抑菌作用及機制

E.coli和S.aureus是兩種最為常見的突破乳頭管屏障侵入圍產(chǎn)期奶牛乳腺組織的外源致病菌，常會引起乳腺上皮細胞炎性反應(yīng)，導(dǎo)致乳腺產(chǎn)生炎癥[31]。茶多酚能夠預(yù)防圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎是由于其能夠抑制甚至殺死致病菌，其抑菌機制一是通過破壞細菌細胞膜的功能。細菌細胞膜是細菌內(nèi)外環(huán)境之間的屏障，介導(dǎo)細菌與其直接環(huán)境的相互作用，因此對傳染病的發(fā)病機制至關(guān)重要[55]，茶多酚能夠破壞細菌細胞膜的磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，破壞細菌細胞膜，降低細菌和宿主細胞的結(jié)合能力[56]。二是抑制菌體蛋白質(zhì)的合成與表達。茶多酚能夠顯著抑制大腸桿菌O157:H7 EDL933 生物膜的形成[57]，對E.coli的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration, MIC）為40 μg/mL，說明茶多酚對E.coli有很強的抑菌效果，主要是通過作用于E.coli的細胞膜，改變其通透性而發(fā)揮抑菌作用[58]；茶多酚對S.aureus也有很強的抑菌效果，抑菌圈直徑為（1.80±0.06）cm[59]，對S.aureus的最小抑菌濃度為8 mg/mL，當(dāng)茶多酚濃度達到2 倍的最小抑菌濃度時，對S.aureus生物膜的產(chǎn)生具有顯著的抑制作用[60]。上述研究表明，茶多酚抑制E.coli和S.aureus的作用機制是茶多酚能夠作用于菌體細胞膜和DNA，改變細胞通透性、破壞菌體壁膜結(jié)構(gòu)、抑制細菌生長、阻礙功能蛋白質(zhì)與多糖的合成和表達，直接結(jié)合肽聚糖進而干擾其生物合成來抵抗致病菌，因此茶多酚在圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎疾病防治中應(yīng)用前景廣闊。

4 小結(jié)與展望

茶多酚因具有抗氧化作用、抗炎作用和抑菌作用，可用于防控圍產(chǎn)期奶牛乳腺炎的發(fā)病，為生產(chǎn)中奶牛乳腺炎提出新的預(yù)防對策。但就目前來看，通過茶多酚來預(yù)防奶牛乳腺炎的作用機制研究還存在一定問題亟待解決，一是茶多酚對機體氧化應(yīng)激導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的作用靶點與作用機制需深度探索，二是要深入分析茶多酚在炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)方面的抗炎作用機制。目前，茶多酚依然是國內(nèi)、外業(yè)界的研究熱點，相信隨著人們對茶多酚研究的進一步深入，茶多酚在奶牛健康綠色養(yǎng)殖的應(yīng)用也將有更為廣闊的前景。