堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性研究

溫國(guó)琴

（朔州師范高等專(zhuān)科學(xué)校，山西 朔州 036002）

苦蕎具有很豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)于提高體質(zhì)有好處，可以起到預(yù)防心血管疾病的作用，很適合中老年人食用，對(duì)于保健養(yǎng)生有很好的作用。在加工處理后，可以從苦蕎麩皮中提取苦蕎蛋白物質(zhì)[1]?？嗍w富含多種人體所需營(yíng)養(yǎng)成分，并因其天然屬性成為人們喜愛(ài)的保健產(chǎn)品[2]。

在苦蕎蛋白提取過(guò)程中，一般采用酶解的方式。與苦蕎蛋白相比，苦蕎生物活性肽在生理保健功能上表現(xiàn)出更加突出的效果[3]。相關(guān)專(zhuān)家對(duì)于酶解法獲得苦蕎生物活性肽的相關(guān)研究逐漸增加，酶解法獲得苦蕎生物活性肽成為苦蕎蛋白水解技術(shù)發(fā)展的主要方向[4]。從生物學(xué)角度分析，苦蕎生物活性肽（bioactive peptides）作為一種蛋白水解產(chǎn)物，是苦蕎蛋白降解之后形成的。借助不同類(lèi)型的蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解[5]，可以產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的肽類(lèi)混合物并具有生物學(xué)活性特征[6]。從構(gòu)成角度分析，苦蕎生物活性肽的氨基酸組成與苦蕎蛋白基本一致，但經(jīng)酶水解后，人體更容易消化和吸收[7]。

酶水解苦蕎產(chǎn)物具有巨大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值[8]。值得注意的是，酶水解苦蕎產(chǎn)物的活性是關(guān)系其功能的重要因素。開(kāi)展堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性研究，分析不同條件下苦蕎生物活性肽的活性，以期為苦蕎生物活性肽的提取提供有價(jià)值的參考，助力堿性蛋白酶水解苦蕎的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值得到最大限度的利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑準(zhǔn)備

開(kāi)展試驗(yàn)測(cè)試的主要試劑材料為苦蕎粉和堿性蛋白酶?？嗍w粉為西蕎2 號(hào)，蛋白質(zhì)含量為74.5%。堿性蛋白酶為2709 堿性蛋白酶[9]，具體參數(shù)為2.4 AU/g。除上述材料外，在試驗(yàn)過(guò)程中使用到的其他試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備準(zhǔn)備

考慮到對(duì)苦蕎蛋白進(jìn)行酶水解需要執(zhí)行的操作步驟，使用的儀器及主要參數(shù)信息如表1 所示。

表1 儀器參數(shù)信息

1.3 試劑配制

需要配制的試劑為苦蕎蛋白溶液，在完成制備后，對(duì)其進(jìn)行純度測(cè)定。按照1∶5 的料液比將苦蕎全粉與石油醚充分混合，利用頂置式攪拌器，在常溫狀態(tài)下攪拌24 h。執(zhí)行該過(guò)程的主要目的是對(duì)苦蕎全粉進(jìn)行脫脂，確保最終配制苦蕎蛋白的純度。在24 h 后，利用雙層濾紙對(duì)配制的溶液進(jìn)行過(guò)濾，之后再進(jìn)行1 次脫脂處理，操作方式與第一次完全一致。需要注意的是，脫脂后苦蕎全粉需要置于通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行完全干燥，干燥時(shí)間為12 h。

對(duì)于得到脫脂苦蕎全粉，按照料液比1∶10 的比例進(jìn)行配制，配制溶劑為去離子水。充分混合后，利用pH 計(jì)讀取酸度值，當(dāng)酸堿度低于8.0 時(shí)，用4.0%的NaOH 溶液，采用逐滴滴定的方式，將pH 值調(diào)節(jié)至8.0，之后放置在頂置式攪拌器中常溫?cái)嚢? h。之后，將配制的苦蕎全粉懸濁液在離心機(jī)中進(jìn)行離心處理，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5 500 r/min，離心20 min 后，收集離心管中的上清液。對(duì)于離心管中的沉淀，重復(fù)執(zhí)行與去離子水的混合操作，調(diào)節(jié)pH 值至8.0，復(fù)提1 次。將兩次提取到的上清液合并。由于蛋白等電點(diǎn)pH 值為4.5，因此需要將上清液pH 值調(diào)整為4.5。再次離心，收集離心管底部的沉淀，冷凍保存，即為苦蕎凍干粉。與去離子水復(fù)溶并調(diào)節(jié)pH 值至7.0，即可得到苦蕎蛋白溶液。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)參數(shù)

按照3.0%的標(biāo)準(zhǔn)，利用去離子水配制苦蕎蛋白溶液。分別調(diào)節(jié)溶液的pH 值、溫度以及2709 堿性蛋白酶，酶解反應(yīng)完成后，將溶液置于磁力水浴鍋中，設(shè)置溫度為100 ℃，滅酶10 min 后，冷卻至室溫。在離心機(jī)上按照6 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min，此時(shí)離心管中的清液即為苦蕎蛋白水解產(chǎn)物，對(duì)其活性指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。試驗(yàn)因素包括溫度、pH 值、2709 堿性蛋白酶的使用量以及水解時(shí)間，具體設(shè)置如表2 所示。按照表2 參數(shù)進(jìn)行單因素影響測(cè)試，結(jié)果如圖1～圖4 所示。

表2 試驗(yàn)因素水平設(shè)置

從圖1～圖4 的單因素測(cè)試結(jié)果可以看出，因素水平處于1、2、3 階段水解度較高，是水解度峰值出現(xiàn)的主要階段。以1、2、3 階段對(duì)應(yīng)的因素指標(biāo)參數(shù)為基準(zhǔn)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。測(cè)試階段各個(gè)組別的因素水平設(shè)置如表3 所示。

表3 正交試驗(yàn)參數(shù)設(shè)置

圖1 溫度單因素測(cè)試結(jié)果

圖2 pH 值單因素測(cè)試結(jié)果

圖3 堿性蛋白酶使用量單因素測(cè)試結(jié)果

圖4 水解時(shí)間單因素測(cè)試結(jié)果

2.2 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集

按照試驗(yàn)設(shè)置，分別測(cè)試不同組別的苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性情況。根據(jù)苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH 自由基的清除能力對(duì)其活性進(jìn)行計(jì)算。以無(wú)水乙醇為溶劑，配制0.2 mmol 的DPPH 溶液。需要注意的是，在試驗(yàn)階段，DPPH 溶液需要現(xiàn)用現(xiàn)配，以此避免由于溶液靜置導(dǎo)致自由基聚集沉降影響測(cè)試結(jié)果的可靠性。將其與抗壞血酸VC 按照100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)，等體積充分混合，構(gòu)建測(cè)試的對(duì)照組。按照100 μL 的標(biāo)準(zhǔn)，將試劑分別與測(cè)試組樣品溶液等體積混合，在30 ℃的環(huán)境溫度下避光反應(yīng)30 min。在酶標(biāo)儀中讀取吸光值，設(shè)置光柵參數(shù)為517 nm。對(duì)應(yīng)的DPPH 自由基清除能力計(jì)算公式如下。

式中：P1表示溶液的DPPH 自由基清除率，x0表示對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果，x1表示測(cè)試組試驗(yàn)結(jié)果。

對(duì)苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物總抗氧化能力的測(cè)定，根據(jù)苦蕎蛋白酶解產(chǎn)物對(duì)ABTS+自由基的清除能力進(jìn)行計(jì)算。將ABTS+工作液與抗壞血酸VC 按照2∶1 的比例配制30 μL 溶液，充分混合后作為試驗(yàn)的對(duì)照組。將試劑分別與10 μL 的試驗(yàn)溶液充分混合，在室溫環(huán)境下反應(yīng)6 min 后，在酶標(biāo)儀中讀取吸光值，設(shè)置光柵參數(shù)為414 nm。ABTS+自由基清除能力計(jì)算公式如下。

式中：P1表示溶液的ABTS+自由基清除率，y0表示對(duì)照組試驗(yàn)結(jié)果，y1表示測(cè)試組試驗(yàn)結(jié)果。

3 試驗(yàn)結(jié)果

測(cè)試階段各組別因素水平設(shè)置下抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果如表4 所示。從表4 可以看出，對(duì)比不同組的測(cè)試結(jié)果，e 組的DPPH 自由基的清除能力和ABTS+自由基清除能力均處于最高水平，DPPH 自由基清除能力為（85.33±0.011）%，ABTS+自由基清除能力為（22.06±0.005）%。對(duì)照表3 參數(shù)設(shè)置情況可知，e 組溫度為45.0 ℃，pH 值為9.0，2709 堿性蛋白酶的使用量為60.0 AU/g，水解時(shí)間為4.0 h。試驗(yàn)表明，在此條件下，堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性最高。

表4 抗氧化活性檢測(cè)結(jié)果

4 結(jié)論

第一，在溫度低于最優(yōu)水解溫度（45.0 ℃）的條件下，溫度上升會(huì)在一定程度上提高堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性；當(dāng)溫度高于45.0 ℃時(shí)，溫度上升會(huì)在一定程度上降低堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性。第二，在pH 值低于最優(yōu)水解條件（pH 值9.0）時(shí)，pH 值上升會(huì)在一定程度上提高堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性，但作用效果并不明顯；當(dāng)pH 值高于9.0時(shí)，pH 值上升同樣會(huì)在一定程度上降低堿性蛋白酶水解苦蕎的抗氧化活性。第三，2709 堿性蛋白酶使用量在低于最優(yōu)值（60.0 AU/g）時(shí)，會(huì)對(duì)苦蕎水解產(chǎn)物的抗氧化活性起到積極作用；使用量高于60.0 AU/g 時(shí)，不會(huì)明顯影響苦蕎水解產(chǎn)物的抗氧化活性。第四，水解時(shí)間對(duì)苦蕎水解產(chǎn)物的抗氧化活性影響不顯著；當(dāng)達(dá)到最優(yōu)水解時(shí)間條件后，水解時(shí)間的增加并不會(huì)對(duì)抗氧化活性產(chǎn)生影響。第五，在溫度、pH 值、2709 堿性蛋白酶使用量以及水解時(shí)間4 個(gè)因素中，溫度對(duì)苦蕎水解產(chǎn)物的抗氧化活性影響最明顯，其次是pH 值。