菟絲子活性成分預(yù)防復(fù)發(fā)性流產(chǎn)作用機(jī)制研究進(jìn)展

孟永麗 李 暉

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450011；2.河南省中醫(yī)院，河南鄭州 450002）

在《自然流產(chǎn)診治中國(guó)專家共識(shí)（2020年版）》中建議將連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）2次及以上定義為復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），包括連續(xù)發(fā)生的生化妊娠[1]。RSA發(fā)生率占妊娠總數(shù)的5%[2]，其病因復(fù)雜且致病機(jī)理不明，目前臨床上尚缺少有效的、規(guī)范的、更有力的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的診療方案，多采用抗凝、免疫、激素補(bǔ)充等療法，有效性和安全性仍具爭(zhēng)議[1-3]。

RSA可歸屬于中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇，治療上尤為重視補(bǔ)腎。清代醫(yī)家張錫純?cè)趬厶ネ柚幸暂私z子為君藥，重在補(bǔ)腎，取腎旺蔭胎之理。菟絲子首見(jiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》[4]：“主續(xù)絕傷，補(bǔ)不足，益氣力，肥健。……久服明目，輕身延年”，臨證常用于治療腎虛胎漏、胎動(dòng)不安、滑胎、不孕癥、月經(jīng)后期及閉經(jīng)、陽(yáng)痿遺精、遺尿尿頻及黃褐斑、白癜風(fēng)等疾病[5]。現(xiàn)代藥理研究表明，菟絲子具有調(diào)節(jié)激素水平、平衡免疫、抗氧化應(yīng)激、抗骨質(zhì)疏松、增強(qiáng)內(nèi)分泌系統(tǒng)功能等作用[6]，其主要化學(xué)成分為金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等黃酮類化合物和β-谷甾醇類、多糖類及揮發(fā)性成分[7]。既往研究表明，菟絲子活性成分通過(guò)調(diào)節(jié)母胎界面免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)平衡以預(yù)防RSA[8]。本文通過(guò)梳理菟絲子活性成分在RSA信號(hào)通路中的藥物作用機(jī)制，以期為臨床運(yùn)用菟絲子預(yù)防RSA及新藥研發(fā)提供思路和方法。

1 參與胚胎著床

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是 絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋白 激酶家族重要的一員，介導(dǎo)了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激 酶（the extracellular signal-related kinases 1/2，ERK1/2）、p38 MAPK激 酶、Jun N端 激 酶/應(yīng) 激活化蛋白激酶（Jun N-terminal kinase/stressactivated protein kinase，JNK/SAPK）、ERK5信 號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等4種MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)[9]。ERK信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育和分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)核心[10]，其中ERK1/2在胚胎發(fā)育早期階段具有廣泛表達(dá)，其通過(guò)干預(yù)孕早期滋養(yǎng)層細(xì)胞（CTB）和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等妊娠過(guò)程參與胚胎著床[11]。當(dāng)MAPK表達(dá)下降時(shí)，會(huì)減弱孕早期CTB侵襲力，導(dǎo)致子宮上皮和基質(zhì)以及胎盤(pán)的巨細(xì)胞和海綿滋養(yǎng)細(xì)胞中腫瘤壞死因子（TNF）-α過(guò)度表達(dá)，促使孕早期CTB的進(jìn)一步凋亡，同時(shí)刺激前列腺素E2（PGE2）釋放，興奮子宮平滑肌，引發(fā)流產(chǎn)[12]?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）9可影響子宮內(nèi)膜細(xì)胞外基質(zhì)的降解與重塑能力，而PI3K/AKT信號(hào)通路參與妊娠期前3個(gè)月胎盤(pán)絨毛組織增殖、黏附及侵入子宮內(nèi)膜的過(guò)程與MMP-9的表達(dá)趨勢(shì)一致[13]，表明MMP-9在促進(jìn)絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移和侵襲方面發(fā)揮了重要作用。當(dāng)MMP-9分泌減少時(shí)，已著床的胚胎易發(fā)生蛻膜出血，造成流產(chǎn)[13]。另有研究表明，滋養(yǎng)層中的Notch信號(hào)通路可阻止胎盤(pán)不受控制地生長(zhǎng)，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制初級(jí)CTB向絨毛外滋養(yǎng)層（EVT）細(xì)胞的分化，從而確保EVT的形成和分化平衡，使EVT細(xì)胞正常分泌MMP-9，維持EVT細(xì)胞侵襲能力[14]。

研究顯示，菟絲子總黃酮（TFSC）以時(shí)間和劑量依賴性活化MAPK通路，促進(jìn)早期CTB增殖，下調(diào)p-ERK和p-p38磷酸化，同時(shí)上調(diào)雌二醇（E2）、孕酮（P）和催乳素激素受體水平，防止RSA[15]。GAO F X等[16]研究發(fā)現(xiàn)，5 μg/mL濃度的TFSC可上調(diào)Notch/AKT/MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的MMP-9表達(dá)，使得EVT細(xì)胞的遷移和侵襲最大化。ZHU G S等[17]實(shí)驗(yàn)研究亦表明，10 μg/mL濃度的TFSC能有效促進(jìn)EVT細(xì)胞活性。槲皮素作為黃酮類化合物，可通過(guò)抑制p38 MAPK和JNK磷酸化，提高谷胱甘肽（GSH）水平，減少氧化應(yīng)激損傷，以助于孕早期CTB植入子宮內(nèi)膜，促進(jìn)胚胎著床[18]。

2 促進(jìn)血管生成

胎盤(pán)血管生成是妊娠早期新生血管形成的一種主要方式，在子宮內(nèi)膜發(fā)育及子宮蛻膜化中具有關(guān)鍵作用，也是胚胎著床和維持正常妊娠的必要環(huán)節(jié)。有研究表明，重鑄的母胎界面血管是維持妊娠的關(guān)鍵，其本質(zhì)是血管新生[19]。磷酯 酰 肌 醇-3激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）信 號(hào)通路屬酪蛋白激酶受體型轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，PI3K/AKT信號(hào)通路可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）產(chǎn)生NO，刺激血管舒張、血管重塑和血管生成[20]。同時(shí)，PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的產(chǎn)生，后者在血管生成中起核心作用，可促進(jìn)生長(zhǎng)因子依賴的絨毛滋養(yǎng)層生長(zhǎng)與細(xì)胞侵襲，其機(jī)制可能是VEGF通過(guò)與其受體VEGFR-2結(jié)合，使AKT活化進(jìn)而激活PI3K/AKT通路，上調(diào)環(huán)氧化酶（COX）-2、誘導(dǎo)型NOS（iNOS）的表達(dá)，從而引起持續(xù)性血管新生[21]。KUTLUER G等[22]證實(shí)，VEGF的降低與早孕流產(chǎn)相關(guān)。此外，MAPK信號(hào)通路為VEGF下游常見(jiàn)的信號(hào)通路之一[23]，Notch信號(hào)通路是胎兒CTB入侵并重塑母體血管過(guò)程的關(guān)鍵組成部分，其中Notch1主要表達(dá)于早孕期絨毛分化及胎盤(pán)形成，調(diào)控胎盤(pán)血管生成和胚胎發(fā)育[24]。

研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者母胎界面中存在過(guò)多的炎癥反應(yīng)，降低了絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞活性，是導(dǎo)致早期胚胎植入失敗的一大原因[25]。當(dāng)炎癥因子如白細(xì)胞介素（IL）-1β、干擾素（IFN）-γ、TNF-α等升高時(shí)，會(huì)阻礙胎盤(pán)血管生成，同時(shí)產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)[26-27]。蔡美云等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TFSC中的山柰酚通過(guò)p38 MAPK信號(hào)通路下調(diào)6-羥多巴胺（6-OHDA）誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞炎性相關(guān)蛋白COX-2、iNOS以及核因子-κB（NF-κB）的表達(dá)水平，從而發(fā)揮抗炎作用。異鼠李素具有血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用，其機(jī)制與其抑制氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）所致氧化應(yīng)激損傷有關(guān)[29]。此外，PI3K/AKT 和血紅素加氧酶-1（HO-1）可能是抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的新靶點(diǎn)，研究表明，異鼠李素可顯著增加HO-1表達(dá)，激活A(yù)KT磷酸化，并促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2易位，起到抗細(xì)胞凋亡的作用[30]。

3 平衡母胎免疫

母胎免疫耐受機(jī)制在RSA中起著重要作用，其中輔助性T細(xì)胞（Th）1/Th2平衡在免疫微環(huán)境中的調(diào)控作用尤為關(guān)鍵[31]。Th1細(xì)胞主要分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12等細(xì)胞因子，有免疫殺傷作用[32]，TNF-α表達(dá)增強(qiáng)可殺死內(nèi)皮細(xì)胞，促使孕早期CTB凋亡，造成血栓形成、缺血、出血、組織壞死、子宮平滑肌興奮等，引發(fā)機(jī)體對(duì)胚胎的免疫排斥反應(yīng)[33]。Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)體液免疫，誘導(dǎo)免疫耐受，利于母胎免疫耐受的維持與建立，多項(xiàng)研究證實(shí)IL-10能有效抑制Th1細(xì)胞因子的表達(dá)[34]?？傊琓h2細(xì)胞免疫主導(dǎo)母體免疫系統(tǒng)時(shí)，可維持正常妊娠，而Th1細(xì)胞免疫占主導(dǎo)時(shí)則易引發(fā)流產(chǎn)。母胎界面的CD4+T細(xì)胞在著床期及妊娠早期介導(dǎo)免疫耐受平衡，研究表明，不明原因RSA發(fā)生機(jī)制可能與Notch1信號(hào)通路和Foxp3特異性轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，阻礙CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)免疫排斥有關(guān)[35]。

菟絲子多糖（PAR）具有抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞、抗衰老、增強(qiáng)免疫功能及抑制腫瘤細(xì)胞增殖等作用[36]。黃長(zhǎng)盛等[37]研究發(fā)現(xiàn)，PAR以劑量依賴性增加妊娠期糖尿病大鼠CTB細(xì)胞增殖活性，通過(guò)提高血清E2、P水平，降低血清TNF-α、IFN-γ濃度，誘導(dǎo)異常蛻膜細(xì)胞凋亡，并提高IL-10、IL-4水平，從而預(yù)防RSA。馬紅霞等[38]研究發(fā)現(xiàn)，TFSC通過(guò)提高流產(chǎn)模型大鼠血清P水平，直接或間接下調(diào)蛻膜Th1細(xì)胞因子（IFN-γ、TNF-α）、上調(diào)Th2細(xì)胞因子（IL-4、IL-10）表達(dá)，使內(nèi)分泌-母胎界面免疫達(dá)到平衡，從而預(yù)防流產(chǎn)，其作用與運(yùn)用P相似。KIM S Y等[39]研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素能顯著抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞中TNF-α、IL-1β和 IL-6的分泌，包括NO和前列腺素E2的生成，其抗炎機(jī)制與阻斷NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。另有研究表明，槲皮素可改善流產(chǎn)模型小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，并調(diào)節(jié)外周血Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量以減少血清IL-6、IL-8的分泌，并上調(diào)巨噬細(xì)胞數(shù)量和IL-10分泌，從而使母胎界面免疫平衡[40]。

4 其他相關(guān)作用

Fas/Fas配體（FasL）與TNF-α同屬一族，由Fas/FasL介導(dǎo)的針對(duì)特異性T淋巴細(xì)胞的凋亡是保證胎兒不被母體免疫系統(tǒng)排斥的防御機(jī)制之一[41]。肝素表皮生長(zhǎng)因子（HB-EGF）是一種刺激細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)因子，可促進(jìn)基質(zhì)細(xì)胞增殖[42]。此外，可通過(guò)抑制半胱氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）活性和促凋亡Bax表達(dá)，上調(diào)抗凋亡Bcl-2 mRNA水平以阻止基質(zhì)細(xì)胞凋亡，從而保護(hù)子宮蛻膜[42]。馬紅霞等[43]研究發(fā)現(xiàn)，TFSC通過(guò)降低流產(chǎn)模型大鼠蛻膜、胎盤(pán)Fas/FasL的表達(dá)，促使血清P分泌、下調(diào)母胎界面TNF-α表達(dá)，從而改善母胎免疫耐受，進(jìn)而預(yù)防RSA；同時(shí)通過(guò)自分泌或旁分泌增加CTB中HB-EGF表達(dá)，增強(qiáng)CTB的增殖、侵入和缺氧耐受。β-石竹烯屬菟絲子揮發(fā)性成分，具有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡、抗菌等作用，有明顯的藥物劑量依賴性[44]。劉京東等[45]通過(guò)動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯可以抑制腦缺血再灌注損傷大鼠海馬中Notch1、NF-κB、Hes1蛋白表達(dá)，降低TNF-α及IL-1β等炎性因子水平，保護(hù)缺血損傷及降低炎性反應(yīng)。此外，β-谷甾醇作為菟絲子主要活性成分之一，可通過(guò)抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活和促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[46]。

5 結(jié)語(yǔ)

綜上，菟絲子活性成分通過(guò)調(diào)控MAPK、PI3K/AKT、Notch等信號(hào)通路參與胚胎著床、胎盤(pán)及其血管形成，促進(jìn)母胎界面血流及免疫平衡?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦證實(shí)，含菟絲子的經(jīng)典名方和中成藥，如壽胎丸、滋腎育胎丸、補(bǔ)腎安胎沖劑、孕康口服液等以補(bǔ)腎為主的方劑可通過(guò)VEGF、MAPK、PI3K/AKT、TGF-β等相關(guān)信號(hào)通路，調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白及細(xì)胞因子表達(dá)，繼而預(yù)防RSA。

本文在梳理菟絲子活性成分的藥理作用研究相關(guān)文獻(xiàn)時(shí)，亦發(fā)現(xiàn)以下幾點(diǎn)不足：（1）菟絲子活性成分預(yù)防RSA的研究大多集中在菟絲子黃酮類化合物相關(guān)經(jīng)典通路，缺少其他活性成分如甾醇類、揮發(fā)性成分等重要信號(hào)通路在預(yù)防RSA方面的研究；（2）RSA相關(guān)信號(hào)通路的相互作用機(jī)制研究較少。后期我們將進(jìn)行菟絲子多種活性成分與RSA靶點(diǎn)的細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以剖析各信號(hào)通路間的相互聯(lián)系及具體作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用和藥物研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。