一例疑似由禽白血病引起蛋雞腫瘤的診斷

武世珍，靖吉強(qiáng)，李 舫，張興娟

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 山東 濰坊 261061）

近幾年，蛋雞養(yǎng)殖快速發(fā)展，養(yǎng)殖條件不斷改善，但在淘汰蛋雞屠宰檢疫過(guò)程中，常發(fā)現(xiàn)蛋雞十二指腸及附近組織出現(xiàn)白色腫瘤樣病變，造成雞胴體廢棄，有些雞群胴體廢棄率達(dá)2 % 以上，給蛋雞養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的危害。筆者對(duì)發(fā)病雞群進(jìn)行了病因調(diào)查和防控措施的探討。

1 發(fā)病雞群調(diào)查

發(fā)病雞群中大部分雞精神、食欲正常，每天的產(chǎn)蛋量相對(duì)穩(wěn)定，但穩(wěn)中有降。少部分雞精神沉郁并逐漸加重，體重漸進(jìn)性減輕，產(chǎn)蛋減少且蛋殼質(zhì)量變差，嚴(yán)重時(shí)停止產(chǎn)蛋。剖檢病雞，有時(shí)見(jiàn)胸肌萎縮，血液稀薄。剪開(kāi)腹壁，十二指腸、胰腺、腺胃壁、腸系膜、輸卵管壁、腹壁均見(jiàn)腫瘤（圖1、圖2），但肝臟、脾臟大小基本正常。腫瘤有不斷向周?chē)M織蔓延的趨勢(shì)。病雞氣管、食道、心臟、腎臟、卵巢未見(jiàn)異常。雞群發(fā)病率在4 %~10 %，病死率和發(fā)病率相當(dāng)。頭孢類(lèi)抗生素治療無(wú)效果。

圖2 病雞胰腺、腹膜出現(xiàn)腫瘤

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

2.1 病理學(xué)診斷

用鋒利手術(shù)刀一次性切下十二指腸上的腫瘤組織，修成2mm×2mm×3mm 的小組織塊，用10 % 福爾馬林固定，脫水透明，浸蠟、包埋，切片、貼片，蘇木精-伊紅染色，封片，用顯微鏡觀察。

2.2 RT-PCR 檢測(cè)禽白血病病毒

2.2.1 引物合成參考 DB21?T1889—2001《禽白血病診斷技術(shù)規(guī)程》合成下列引物：F:AAGTAA GGTGGTACGATCTG，R: CTGCTTCATTCAGGT GTTCGCAAT，該特異性引物擴(kuò)增的目的基因是禽白血病病毒LTR 序列，擴(kuò)增片段為220 bp。

2.2.2 核酸提取 利用北京索萊寶科技有限公司的總RNA 提取試劑盒提取核酸，主要步驟是：取100 mg 腫瘤組織加1 ml 裂解液，用勻漿器勻漿，室溫放置5 min，向勻漿液體中加0.2 ml 氯仿，振蕩 0.5 min，25 ℃ 放置 5 min。4 ℃12 000 rpm 離心10 min，把水相轉(zhuǎn)移到新離心管中。收集的液體中加入200 μl 無(wú)水乙醇混勻，然后加入經(jīng)前處理后的吸附柱靜置 2 min，4 ℃12 000 rpm 離心2 min，棄廢液。向吸附柱中加入600 μl 漂洗液，4 ℃ 12 000 rpm 離心2 min，棄廢液。漂洗2 次后，12 000 rpm 離心2 min，棄掉收集管，將吸附柱置于室溫放置10 min，然后將吸附柱放入新離心管中，向柱中央滴加100 μl 無(wú) RNA 酶 水， 室 溫 放 置 5 min ，12 000 rpm 離心2 min 即得到RNA。

2.2.3 RT-PCR 檢測(cè) 利用北京索萊寶科技有限公司的通用RT-PCR 試劑盒，在42 ℃ 反應(yīng)1h，取2 μl 作為模板進(jìn)行PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃ 1 min；94 ℃ 0.5 min，55 ℃ 0.5 min；72 ℃ 0.5 min；35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

3 結(jié)果

3.1 病理切片觀察

淋巴母細(xì)胞樣瘤細(xì)胞形態(tài)大小較一致，腫瘤病灶聚集性生長(zhǎng)（圖3），形成瘤細(xì)胞集中區(qū)域，擠壓周?chē)M織。

圖3 淋巴母細(xì)胞樣瘤細(xì)胞聚集性生長(zhǎng)（HE 染色1000 倍）

3.2 RT-PCR 檢測(cè)禽白血病病毒結(jié)果

取5 μl PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)束后，取出凝膠板置于凝膠成像儀進(jìn)行觀察。擴(kuò)增出了220bp 目標(biāo)片段（圖4）。將PCR 產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序。將所得序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果表明，該序列與禽白血病病毒的核酸同源性在98 %～100 %（圖5）。說(shuō)明該病例存在禽白血病的感染。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可看出：本病例中禽白血病病毒與在美國(guó)禽白血病病毒分離株核酸同源性最近，與湖北、廣東分離到的禽白血病病毒核酸同源性稍遠(yuǎn)，同2021 年比利時(shí)從肉雞體內(nèi)分離的禽白血病病毒的核酸同源性最遠(yuǎn)（圖6）。由此可推測(cè)，禽白血病病毒在不同地區(qū)的傳播可能與引進(jìn)種雞、雞產(chǎn)品交易等有關(guān)。對(duì)疑似病雞進(jìn)行及時(shí)檢測(cè)，對(duì)于控制該病具有重要意義。

圖4 禽白血病病毒目的片段電泳結(jié)果

圖5 核酸比對(duì)結(jié)果

圖6 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3.3 診斷結(jié)論

根據(jù)這種蛋雞腫瘤病的流行特點(diǎn)、癥狀、病變，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，可初步診斷為禽白血病病毒感染。對(duì)發(fā)病蛋雞場(chǎng)采取禽白血病凈化、消毒等綜合措施，病情得到了控制。由于禽白血病病毒不斷變異，深入研究蛋雞近年來(lái)十二指腸及其附近組織頻繁出現(xiàn)白色腫瘤的深層原因是十分必要的。

4 討論

4.1 檢測(cè)、凈化蛋種雞群，生產(chǎn)無(wú)禽白血病的蛋雞苗

禽白血病的流行，給蛋雞生產(chǎn)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1]。實(shí)行全進(jìn)全出制，阻斷垂直傳播，是控制該病的重要措施。蛋種雞場(chǎng)不從禽白血病陽(yáng)性雞場(chǎng)引入種雞、種蛋。引入的種雞應(yīng)先隔離飼養(yǎng)，檢測(cè)白血病抗體，并關(guān)注臨床表現(xiàn)，堅(jiān)決淘汰陽(yáng)性雞。蛋種雞開(kāi)產(chǎn)后，定期檢測(cè)雞群血清中A、B 或J 亞群 ALV 抗體水平，一旦異常，及時(shí)采取撲滅措施。

4.2 雞場(chǎng)強(qiáng)化生物安全措施

把好疫苗關(guān)，選擇正規(guī)廠家的疫苗。杜絕使用被外源性 ALV 污染的弱毒疫苗、卵黃液或其他生物制品。注射疫苗時(shí)，要及時(shí)更換針頭。種蛋應(yīng)及時(shí)收集，熏蒸消毒，孵化場(chǎng)，育雛室嚴(yán)格消毒，減少早期感染。雞場(chǎng)要遠(yuǎn)離家禽屠宰場(chǎng)、化工廠、交通要道、村莊等。雞場(chǎng)內(nèi)布局要合理，辦公區(qū)、生產(chǎn)區(qū)、糞污處理區(qū)要分開(kāi)。生產(chǎn)區(qū)內(nèi)臟道和污道分開(kāi)，注意防鳥(niǎo)滅鼠。雞場(chǎng)門(mén)口設(shè)消毒池，生產(chǎn)人員更衣、換鞋、淋浴后才能進(jìn)入雞舍。設(shè)立遠(yuǎn)程觀察系統(tǒng)和報(bào)警裝置，減少人員進(jìn)雞舍的次數(shù)。禁止無(wú)關(guān)人員進(jìn)入雞舍。

4.3 建立優(yōu)良公雞精液站

ALV 感染雞可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生和免疫抑制[2]，因此定期對(duì)公雞進(jìn)行禽白血病健康檢查，確保公雞精液不攜帶外源性 ALV 具有重要經(jīng)濟(jì)意義。建立優(yōu)良公雞精液站，推廣人工授精，減少因精液污染外源性 ALV 而造成的疫情擴(kuò)散。人工授精時(shí)注意輸精器械的消毒，減少人為傳播。

4.4 建立純種雞保護(hù)制度

增加純種雞保護(hù)經(jīng)費(fèi)的投入，優(yōu)化各種生物安全措施，定期檢測(cè)禽白血病。加強(qiáng)禽白血病的實(shí)驗(yàn)室快速監(jiān)測(cè)方法的研究，特別是分子生物學(xué)診斷[3]和抗體檢測(cè)方面，進(jìn)一步降低禽白血病檢測(cè)成本和提高準(zhǔn)確率。加強(qiáng)育種工作，利用基因編輯技術(shù)培育抗白血病的蛋雞新品種。