H19、CHI3L1在發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)研究

任冰鈺，王 玨，胡明欣，高曉凡，丁相福*

(1.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 甲狀腺外科，吉林 長(zhǎng)春130041;2.吉林大學(xué)白求恩口腔醫(yī)院 修復(fù)科，吉林 長(zhǎng)春130021)

根據(jù)癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告，甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是第九大最常被診斷出的癌癥[1]，居城市地區(qū)女性惡性腫瘤發(fā)生率第4位，預(yù)測(cè)將以年均20%的速率持續(xù)增長(zhǎng)[2]。甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是TC中最常見的病理類型，10年生存率高達(dá)90%[3]。隨著檢出率增高，高侵襲性、分化程度差、臨床分期晚的PTC數(shù)量逐年增加，它們的復(fù)發(fā)及死亡風(fēng)險(xiǎn)較大[4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long Noncoding RNA，lncRNA)具有相對(duì)較高的組織器官特異性[5]，研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中l(wèi)ncRNA出現(xiàn)差異表達(dá)基因，擬為阻斷淋巴管形成、降低側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、提高患者生存率提供靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集3例2020年在吉林大學(xué)第二醫(yī)院病理證實(shí)為發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者的癌組織、癌旁組織、無瘤甲狀腺組織。

第1例：男性，48歲，(甲狀腺左葉)微小乳頭狀癌(直徑分別為0.3 cm、0.5 cm)，(甲狀腺右葉)微小乳頭狀癌(直徑分別為0.2 cm、0.5 cm)，右頸Ⅲ、Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)(1/6)。

第2例：女性，27歲，(甲狀腺左葉)微小乳頭狀癌(多灶，最大直徑0.8 cm)，(甲狀腺右葉)乳頭狀癌，左側(cè)II-V區(qū)淋巴結(jié)(6/10)，左側(cè)VI區(qū)淋巴(7/12)，右側(cè)Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)(2/2)。

第3例：女性，26歲，(甲狀腺左葉)乳頭狀癌，(甲狀腺右葉)微小乳頭狀癌，左側(cè)Ⅱ-Ⅴ區(qū)淋巴結(jié)(2/6)，左側(cè)Ⅵ區(qū)淋巴結(jié)(7/12)。

1.2 方法

1.2.1去核糖體RNA(rRNA)鏈特異性文庫(kù)測(cè)序，操作流程圖及儀器試劑如圖1所示。

圖1 rRNA鏈特異性文庫(kù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程

1.2.2生信分析 見圖2。

圖2 生信分析流程圖

2 結(jié)果

2.1 lncRNA表達(dá)差異分析

差異表達(dá)基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：FDR<0.05&|log2FC|≥1。繪制出散點(diǎn)圖(圖3)、火山圖(圖4)。

2.2 篩選差異表達(dá)基因

見表1，圖3、圖4。

3 討論

回顧性分析發(fā)現(xiàn)PTC發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為20%-90%[6]。癌灶侵犯腺葉上段1/3、原發(fā)灶分期達(dá)到T3或T4、多中心病灶均為獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[7]?？傮w而言，這樣的患者預(yù)后較差[8]，死亡率高，尤其是老年患者[9]。若無影像學(xué)及穿刺病理學(xué)證實(shí)為發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC，否認(rèn)手術(shù)不會(huì)常規(guī)清掃側(cè)頸部淋巴結(jié)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，隱匿性發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC高達(dá)55%[10]。

圖3 差異基因可視化圖

圖4 差異基因可視化圖

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與淋巴管形成密不可分，腫瘤會(huì)直接或間接刺激淋巴管生成和產(chǎn)生促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生長(zhǎng)因子[11]。淋巴管生成是惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的限速步驟[12]。lncRNA被證實(shí)為多種腫瘤的驅(qū)動(dòng)或抑制因子，與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、細(xì)胞凋亡過程相關(guān)[13]，影響癌癥細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的各個(gè)方面[14]。

實(shí)驗(yàn)得出lncRNA H19明顯高表達(dá)、lncRNA CHI3L1明顯低表達(dá)，以此展開討論。H19位于染色體11p15，該位點(diǎn)還包含胰島素樣生長(zhǎng)因子2[15]，在胚胎發(fā)生中高表達(dá)，但出生后大多組織中幾乎檢測(cè)不到[16]。H19具有促癌和抑癌的雙向功能，證實(shí)與人類遺傳疾病和癌癥有關(guān)[16]，參與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程，在肺癌[17]、乳腺癌[18]、胃癌[19]高表達(dá)，而在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[20]、膀胱癌[21]中低表達(dá)。Lan[22]發(fā)現(xiàn)H19在PTC癌組織中表達(dá)下調(diào)。Liu等發(fā)現(xiàn)H19表達(dá)水平明顯高于癌旁或正常組織[23-24]，H19過表達(dá)時(shí)抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲性增加[23]。本實(shí)驗(yàn)得出H19在癌組織、癌旁組織中均高表達(dá)，推測(cè)與腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲相關(guān)，與發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，擬通過構(gòu)建lncRNA-H19敲除慢病毒，轉(zhuǎn)染高表達(dá)癌細(xì)胞，qPCR驗(yàn)證敲減水平，進(jìn)而檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。殼多糖酶3樣蛋白1(chitinase 3-like 1，CHI3L1)，也稱為YKL-40，位于染色體1q32.1，與多種惡性腫瘤相關(guān)：在結(jié)腸癌[25]、食管癌[26]、宮頸癌[27]高表達(dá)，提示侵襲性增強(qiáng)、預(yù)后不良，在口腔癌中高表達(dá)，提示與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[28]。Cheng等[29]發(fā)現(xiàn)CHI3L1在甲狀腺良性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)或不表達(dá)，在甲狀腺惡性腫瘤中高表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)CHI3L1低表達(dá)考慮與側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能也因?yàn)闃颖玖枯^少且未包含PTC亞型有關(guān)。

表1 差異表達(dá)基因

隨著全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)推進(jìn)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，lncRNA在多種腫瘤中出現(xiàn)基因表達(dá)差異，有望作為腫瘤標(biāo)志物用于疾病的診斷和治療。

綜上所述，H19、CHI3L1在發(fā)生側(cè)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC中出現(xiàn)差異表達(dá)，推測(cè)與惡性病理特征有關(guān)，是預(yù)后不良的分子標(biāo)志物，可作為靶點(diǎn)阻斷淋巴管形成，降低側(cè)頸部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率。