NK細(xì)胞及其受體表達(dá)與再生障礙性貧血的相關(guān)性研究

孔令環(huán),王雪野,邢明雨,呂作福,艾英莉,邵萬艷,魏灼如

(吉林省人民醫(yī)院，吉林 長春130021)

再生障礙性貧血(AA)是一種由多種原因引起的造血功能衰竭綜合征，近年來被國內(nèi)外研究者定義為一種涉及免疫機(jī)制異常所導(dǎo)致的自身免疫性疾病[1-2]，免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)的平衡紊亂及分泌的造血負(fù)調(diào)控因子誘導(dǎo)了造血干/祖細(xì)胞的異常損傷和凋亡，引起造血衰竭，是再生障礙性貧血發(fā)生的重要原因。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對重型再生障礙性貧血(SAA)病人及非重型再生障礙性貧血(NSAA)病人外周血NK細(xì)胞數(shù)量及功能變化的研究，探討NK細(xì)胞在AA發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象2017年6月至2020年2月吉林省人民醫(yī)院血液科收治再生障礙性貧血病人初治28例(重型(SAA)9例，非重型(NSAA)19例)，其中男12例，女16例，年齡14-86歲，中位年齡61歲。按照張之南主編的《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(第3版)[3]，符合再生障礙性貧血的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時，選擇本院健康志愿者18例為對照組，男8例，女10例，年齡27-58歲，中位年齡45歲；所有檢測均知情同意。

1.2 檢測方法受試者清晨空腹靜脈采血2 ml，EDTA抗凝。采用微量全血免疫熒光技術(shù)標(biāo)記NK細(xì)胞，6 h檢測完畢?？贵w為Beckman Coulter 公司鼠抗人CD3-ECD、CD56-PC5、CD16-PC5、CD314(NKG2D)-FITC、CD159((NKG2A)- PE、顆粒酶granzymeβ-PE、穿孔素 perforin-FITC，破膜劑及溶血劑。常規(guī)方法標(biāo)記細(xì)胞后用Beckman Coulter公司EPICS-XL型流式細(xì)胞儀，應(yīng)用EXPO32ADCXL4 Color軟件分析，在FSC-SSC散點圖上選定淋巴細(xì)胞群，分析10000個細(xì)胞，結(jié)果以百分率表示。本試驗檢測的NK細(xì)胞包括CD16dimCD56bright亞型和CD16brightCD56dim亞型。同時常規(guī)進(jìn)行T淋巴細(xì)胞亞群的檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 AA病人外周血NK細(xì)胞數(shù)量及受體表達(dá)的變化(表1)

SAA組病人外周血NK細(xì)胞數(shù)，NKG2D，NKG2A，顆粒酶表達(dá)減少，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；穿孔素表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

NSAA組病人外周血NK細(xì)胞數(shù)，NKG2D，顆粒酶表達(dá)減少，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；NKG2A和穿孔素表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

SAA組病人外周血NK細(xì)胞抑制性受體NKG2A表達(dá)增加，與NSAA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 AA病人外周血NK細(xì)胞數(shù)量及受體表達(dá)的變化

2.2 AA病人NK細(xì)胞及其受體表達(dá)與造血指標(biāo)的相關(guān)性分析

NSAA病人活化性受體NKG2D表達(dá)與血紅蛋白含量(r=0.979，P=0.007)、血小板數(shù)(r=0.943，P=0.018)有相關(guān)性；顆粒酶表達(dá)與血紅蛋白含量(r=0.942，P=0.018)、網(wǎng)織紅細(xì)胞(r=0.906，P=0.029)有相關(guān)性；NK數(shù)量，NKG2A,穿孔素表達(dá)與白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞等造血指標(biāo)無相關(guān)性。

SAA病人NK細(xì)胞胞漿穿孔素表達(dá)與網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)有相關(guān)性(r=0.907，P=0.046)；NK數(shù)量，NKG2D，NKG2A,顆粒酶表達(dá)與白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、網(wǎng)織紅細(xì)胞等造血指標(biāo)無相關(guān)性。

2.3 AA病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化(表2)

NSAA組病人CD3+T淋巴細(xì)胞、CD8+T淋巴細(xì)胞比例增高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAA組病人CD4+T淋巴細(xì)胞減低，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SAA組病人B淋巴細(xì)胞比例增高，與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與NSAA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

SAA組與NSAA組比較，CD3+T淋巴細(xì)胞比例減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 AA病人NK細(xì)胞與T淋巴亞群的相關(guān)性分析

NSAA病人NK細(xì)胞的活化性受體NKG2D表達(dá)與CD3+T淋巴細(xì)胞(r=0.984，P=0.005)有相關(guān)性；NK細(xì)胞的胞漿顆粒酶表達(dá)與CD3+T淋巴細(xì)胞(r=0.865，P=0.042)，CD8+T淋巴細(xì)胞(r=0.928，P=0.022)，CD4+/CD8+(r=0.942，P=0.018)、B淋巴細(xì)胞(r=-0.877，P=0.038)有相關(guān)性；其他指標(biāo)沒有相關(guān)性。

表2 AA病人外周血T淋巴細(xì)胞亞群的變化

SAA病人NK細(xì)胞數(shù)與CD4+T淋巴細(xì)胞有相關(guān)性(r=0.988，P=0.006)，其他指標(biāo)沒有相關(guān)性。

3 討論

目前為止，AA的病因和發(fā)病機(jī)制尚沒有完全清楚，國內(nèi)外研究[4-5]已經(jīng)證實，T淋巴細(xì)胞免疫異常是AA發(fā)病機(jī)制之一；林贈華等報道[6],免疫介導(dǎo)的再生障礙性貧血小鼠模型的研制，以及Young等[7]的研究也證明T 淋巴細(xì)胞的異?；罨凸δ芸哼M(jìn)造成的骨髓損傷在原發(fā)性獲得性AA發(fā)病機(jī)制中占主導(dǎo)地位。本研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在AA疾病進(jìn)程中也起到重要作用。

NK細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過與DC、T細(xì)胞、B細(xì)胞相互作用，不僅調(diào)解固有免疫應(yīng)答，而且參與調(diào)解獲得性免疫應(yīng)答，是連接固有免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁[8]。NK細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用是通過膜上CD16、CD56與Th細(xì)胞膜上CD4發(fā)生免疫黏附[9]，同時激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1，使Th細(xì)胞激活，活化的Th細(xì)胞分泌IL-2，IFN-γ等，促進(jìn)CTL細(xì)胞分化成熟，從而增強(qiáng)T細(xì)胞的免疫效應(yīng)。NK細(xì)胞還可以通過DC細(xì)胞間接激活Th1細(xì)胞[10]。

T淋巴細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫，其數(shù)量及比例關(guān)系在體內(nèi)處于相對穩(wěn)定狀態(tài)。本研究中，NSAA組病人抑制性CD8+T淋巴細(xì)胞比例增高，SAA組病人輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞比例減低，都引起CD4+/CD8+比例失衡，T淋巴細(xì)胞免疫異常，引起造血細(xì)胞的免疫損傷，骨髓衰竭，引起血細(xì)胞減少，與報道一致[11-12]。本研究還發(fā)現(xiàn)，NSAA組病人NK細(xì)胞的NKG2D、顆粒酶表達(dá)與CD3+T淋巴細(xì)胞有相關(guān)性，SAA組病人NK細(xì)胞數(shù)與輔助性CD4+T淋巴細(xì)胞有相關(guān)性，可以認(rèn)為NK細(xì)胞間接參與了造血調(diào)控。

本研究中，無論SAA組或NSAA組病人外周血NK 細(xì)胞數(shù)量均低于對照組(P<0.05)，同金夢迪等[13-15]報道一致。NK細(xì)胞通過自身表面的活化性和抑制性受體，調(diào)節(jié)自身的細(xì)胞毒性。NKG2D是最重要的活化性受體之一，本研究中，SAA組和NSAA組病人外周血NK細(xì)胞活化性受體NKG2D表達(dá)均低于對照組，殺傷功能減弱；NK細(xì)胞的第二種殺傷途徑是細(xì)胞毒作用，NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的發(fā)揮主要依賴于細(xì)胞溶解蛋白(如穿孔素和顆粒酶)的產(chǎn)生和釋放[16-17]，本研究中SAA組和NSAA組病人外周血NK細(xì)胞胞漿顆粒酶表達(dá)均明顯低于對照組，細(xì)胞毒作用減低。以上綜合因素導(dǎo)致NK細(xì)胞對DC的殺傷作用減弱[18]，引起T細(xì)胞異常激活，分泌大量造血負(fù)調(diào)控因子IFN-γ等，引起骨髓造血衰竭，導(dǎo)致AA的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞與造血指標(biāo)有相關(guān)性。NSAA組病人的NK 細(xì)胞活化性受體NKG2D和顆粒酶表達(dá)與血紅蛋白含量有相關(guān)性；NKG2D表達(dá)與血小板數(shù)有相關(guān)性；顆粒酶表達(dá)與網(wǎng)織紅細(xì)胞有相關(guān)性。SAA組病人NK細(xì)胞胞漿穿孔素表達(dá)與網(wǎng)織紅細(xì)胞有相關(guān)性。所以，臨床AA的治療方案可以考慮通過提高NK細(xì)胞活性來提升造血指標(biāo)，與Liu 等[19]報道一致，外周血 NK 細(xì)胞及其亞群在初治 SAA 病人中均低于正常對照組，IST 治療后均升高，尤其以 CD56bright NK 細(xì)胞亞群變化最明顯，且這些變化與 SAA 病人的造血恢復(fù)情況呈正相關(guān)；因此有研究者[20]提出 NK 細(xì)胞參與了 SAA 的發(fā)生、發(fā)展，但其并非起“致病”性作用，而有可能起“保護(hù)”性作用。

SAA組病人外周血NK細(xì)胞抑制性受體NKG2A表達(dá)高于對照組，也高于NSAA組。抑制性受體NKG2A表達(dá)高，代表NK細(xì)胞識別能力增強(qiáng)，不確定與SAA組病人的急、重等臨床癥狀是否相關(guān)，有待進(jìn)一步研究。另外，SAA組病人B淋巴細(xì)胞明顯高于NSAA組，也高于對照組，體液免疫是否參與了SAA的疾病進(jìn)程也有待下一步研究。

通過NK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞亞群及各造血指標(biāo)的相關(guān)性分析，可以認(rèn)為NK細(xì)胞直接或間接參與了骨髓造血調(diào)控，與造血干/祖細(xì)胞的異常損傷和凋亡相關(guān)，是再生障礙性貧血發(fā)生的重要環(huán)節(jié)。