響應(yīng)面法優(yōu)化煙草發(fā)酵培養(yǎng)基提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量

胡仙妹，張 晨，楊雪鵬，張 展，尹獻(xiàn)忠

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)有限公司，河南 鄭州 450016）

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種由β-1,4葡萄糖苷鍵連接而成的生物高分子聚合物。BC與植物纖維結(jié)構(gòu)相似，因其具有高純度、高聚合度、高結(jié)晶度、高持水性、高抗張強(qiáng)度和生物相容性好等特點(diǎn)[1]，已被廣泛應(yīng)用于食品[2-3]、造紙[4]、生物醫(yī)藥[5-6]和紡織品[7-8]等領(lǐng)域。常見(jiàn)的細(xì)菌纖維素發(fā)酵菌屬有醋酸菌屬（Acetobacter）[9]、根瘤菌屬（Rhizobium）[10]和土壤桿菌屬（Agrobacterium）[11]等。目前，已有大量文獻(xiàn)采用優(yōu)良菌株選育[12-14]、發(fā)酵工藝優(yōu)化[15]、生物合成調(diào)控[16]等方法來(lái)提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，但細(xì)菌纖維素產(chǎn)量仍然偏低，生產(chǎn)成本較高，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的要求，而靜態(tài)培養(yǎng)法有培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、產(chǎn)品性能優(yōu)異、產(chǎn)品形狀可控等優(yōu)點(diǎn)，是細(xì)菌纖維素制備的首選方法[17]。

我國(guó)的煙葉種植面積超過(guò)100萬(wàn)hm2，年均產(chǎn)生的煙草廢棄物（低次煙葉、莖稈、杈煙等）多達(dá)400萬(wàn)t[18]，其處理方式大多為隨意丟棄或者集中焚燒銷毀，造成了較大的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[19]。因此，開發(fā)利用廢棄煙末進(jìn)行細(xì)菌纖維素生產(chǎn)，對(duì)其培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化是提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的有效途徑[20]。張婷婷等[21]開發(fā)了利用廢棄煙末發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素的技術(shù)，并對(duì)接種量、溫度、pH和發(fā)酵時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。由煙草廢棄物制備細(xì)菌纖維素雖然已經(jīng)實(shí)現(xiàn)，但煙草原料中煙堿等物質(zhì)對(duì)菌體生長(zhǎng)及BC合成有一定的抑制作用，使其產(chǎn)量較低，煙草廢棄物的利用率僅為2%左右。因此，提高煙草廢棄物的利用率，對(duì)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。

本研究以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為試驗(yàn)菌株，采用靜態(tài)發(fā)酵的方式，對(duì)煙草廢棄物進(jìn)行發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素，通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)煙草發(fā)酵培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，以期提高細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，為后續(xù)細(xì)菌纖維素的放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與材料

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）ATCC 23767：由鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物催化與轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)室保藏；煙末廢棄物：由貴州中煙工業(yè)有限公司提供。

1.1.2 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；無(wú)水葡萄糖（分析純）：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限責(zé)任公司；無(wú)水乙醇、乳酸（均為分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限責(zé)任公司；蛋白胨（生化試劑）、水楊酸、草酸、蘋果酸、延胡索酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；氫氧化鈉、硫酸銨、硝酸銨、檸檬酸（均為分析純）：天津市登科化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L、酵母粉10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L，115 ℃滅菌20 min，冷卻后添加1%（V/V）無(wú)水乙醇。

煙草發(fā)酵培養(yǎng)基：煙末100 g，以固液比為1∶10（g∶mL）加水，60 ℃浸提1.5 h后過(guò)濾，取濾液，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-ID超凈工作臺(tái)：蘇州凈化有限公司；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；GR85DA高壓蒸汽滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；ZQWY-200S臥式全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海知楚儀器有限公司；SHP-150生化培養(yǎng)箱：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌纖維素的制備

從-80 ℃冰箱中取保藏的菌液100 μL，接種至裝液量為50 mL/250 mL的種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h，制成種子液。將種子液以10%（V/V）的接種量接種于裝液量為150 mL/500 mL的煙草發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃恒溫靜置培養(yǎng)7 d后即可制得細(xì)菌纖維素膜。

1.3.2 細(xì)菌纖維素的純化處理

將靜置發(fā)酵7 d后獲得的BC膜取出，浸泡至0.1 mol/L的NaOH溶液中，于沸水浴加熱1 h，以除去殘留在纖維素膜表面的菌體及發(fā)酵液，然后用蒸餾水反復(fù)洗滌至BC膜至中性。經(jīng)過(guò)純化處理的BC用于產(chǎn)量測(cè)定及持水性能分析。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)

以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別選擇培養(yǎng)基的氮源種類（蛋白胨、酵母粉、硫酸銨和硝酸銨）及氮源添加量（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L和4 g/L）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%和4.0%）、有機(jī)酸種類（檸檬酸、水楊酸、草酸、蘋果酸、延胡索酸、乳酸）及有機(jī)酸添加量（0、0.25 g/L、0.50 g/L、0.75 g/L、1.00 g/L和1.25 g/L）進(jìn)行單因素試驗(yàn)優(yōu)化。培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)中，所有試驗(yàn)因素空白組均為未添加該因素的煙草發(fā)酵培養(yǎng)基，試驗(yàn)組為添加該因素的煙草發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.3.4 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇硫酸銨添加量（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）和蘋果酸添加量（C）3個(gè)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響明顯的因素為自變量，以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，采用Design Expert 10.0.8軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box Behnken tests for medium components optimization

1.3.5 細(xì)菌纖維素產(chǎn)量計(jì)算及持水性能的測(cè)定

純化處理后的BC膜經(jīng)4 000 r/min離心20 min，定義為濕膜，記為W濕；將80℃下烘干至恒質(zhì)量的細(xì)菌纖維素膜定義為干膜，記為W干；在常溫環(huán)境下將干膜浸入去離子水中，浸泡48h后用濾紙吸干表面水分，所得膜定義為復(fù)水膜，記為W復(fù)。

按公式（1）計(jì)算BC的產(chǎn)量，分別按公式（2）～（4）計(jì)算BC的含水率、復(fù)水率和溶脹率。

式中：R為細(xì)菌纖維素產(chǎn)量，g/L；V為發(fā)酵液體積，L；C1為濕膜含水率，%；C2為干膜復(fù)水率，%；C3為溶脹率，%。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS19.0和Origin2019進(jìn)行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 氮源種類及添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

氮源是菌體合成蛋白質(zhì)、氨基酸及核酸等含氮物質(zhì)的來(lái)源。菌株發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的過(guò)程中，充足的氮源不僅能夠?yàn)榫w生長(zhǎng)提供氮元素，還能夠作為細(xì)菌纖維素合成相關(guān)酶的輔助因子[22]。本試驗(yàn)考察了外源添加蛋白胨、酵母粉、硫酸銨和硝酸銨4種氮源對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響，氮源種類及添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 氮源種類（A）及硫酸銨添加量（B）對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of nitrogen sources (A) and ammonium sulfate addition(B) on bacterial cellulose production

由圖1A可知，硫酸銨對(duì)細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量提升效果最明顯，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為16.09g/L。因此，選擇硫酸銨為最佳氮源。由圖1B可知，隨著硫酸銨添加量在0～3 g/L范圍內(nèi)不斷增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量逐漸上升；當(dāng)硫酸銨添加量達(dá)到3 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，為23.44 g/L；隨著硫酸銨添加量在3～4 g/L范圍繼續(xù)增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量降低。因此，選擇硫酸銨的最適添加量為3 g/L。

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

在添加乙醇的情況下，乙醇作為額外碳源，會(huì)使微生物對(duì)葡萄糖的消耗減少，使得更多的葡萄糖可以用于BC的合成[23]，從而提高BC的產(chǎn)量。許燕娜等[24]認(rèn)為，木醋桿菌可以將乙醇轉(zhuǎn)化為乙酸，再將乙酸分解為二氧化碳和水，從而提高三磷酸腺苷水平，進(jìn)而提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on bacterial cellulose production

由圖2可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)在0～2%范圍內(nèi)的增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量逐漸增加；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到最大值，達(dá)到20.58 g/L，促進(jìn)效果較為明顯；但當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量降低。因此，選擇最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為2%。

2.1.3 有機(jī)酸種類及添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

有機(jī)酸種類及添加量對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 有機(jī)酸種類（A）及蘋果酸添加量（B）對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of types of organic acids (A) and malic acid addition (B)on bacterial cellulose production

由圖3A可知，添加有機(jī)酸類物質(zhì)對(duì)木醋桿菌生產(chǎn)BC都有促進(jìn)作用，其中蘋果酸促進(jìn)作用最強(qiáng)，其BC產(chǎn)量為17.79 g/L。賈青慧等[25]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖酸和乙酸在一定范圍內(nèi)有利于木醋桿菌合成BC；錢子俊等[26]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬酸對(duì)BC產(chǎn)量具有一定促進(jìn)作用；李玨等[27]研究發(fā)現(xiàn)，乙酸代替檸檬酸作為有機(jī)酸成分加入發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，可提高BC合成量?？梢?jiàn)，有機(jī)酸是BC合成過(guò)程中常見(jiàn)的發(fā)酵促進(jìn)因子，但由于菌種等不同，各種有機(jī)酸的效果存在較大差異。由圖3B可知，隨著蘋果酸添加量在0～0.5 g/L范圍內(nèi)增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量逐漸增加；當(dāng)蘋果酸添加量為0.5 g/L時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到最高值，為19.98 g/L；當(dāng)蘋果酸添加量＞0.5 g/L，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量逐漸下降。BC的合成過(guò)程中需要大量能量，有機(jī)酸類物質(zhì)可通過(guò)氧化生成丙酮酸，參與細(xì)胞代謝并產(chǎn)生能量，較多的能量可以促進(jìn)BC的合成[28]。隨著蘋果酸添加量持續(xù)增加，反饋抑制增強(qiáng)，菌體的生長(zhǎng)受到抑制，使細(xì)菌纖維素產(chǎn)量有所降低[29]。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以細(xì)菌纖維素產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值，以對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量有明顯影響的3個(gè)因素硫酸銨添加量（X1）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（X2）和蘋果酸添加量（X3）為自變量，采用Design Expert 10.0.8軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box Behnken tests for medium component optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

運(yùn)用Design Expert 10.0.8軟件對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)擬合，得到響應(yīng)值與各因素之間的回歸方程：Y=33.86+1.21X1+0.29X2+0.22X3+0.18X1X2+0.07X1X3-0.005X2X3-2.61X12-2.73X22-1.92X32

由表3可知，回歸模型極顯著（P＜0.01）；失擬項(xiàng)不顯著（P值=0.7＞0.05），表明該模型具有較高可靠性，與實(shí)際情況擬合程度良好。該模型的決定系數(shù)R2=0.993 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.993 0，表明此模型方程是可靠的，用該方程進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值之間相關(guān)性較高。由表3亦可知，一次項(xiàng)X1、X2和二次項(xiàng)X12、X22和X32均對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量有極顯著影響（P＜0.01），一次項(xiàng)X3對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，各因素對(duì)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量影響強(qiáng)弱順序依次為X1（硫酸銨添加量）＞X2（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞X3（蘋果酸添加量）。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design Expert 10.0.8軟件得到煙草發(fā)酵培養(yǎng)基組分的最佳配方為：硫酸銨添加量3.234 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)2.030%，蘋果酸添加量0.515 g/L。在此優(yōu)化條件下，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量理論值為33.83 g/L。在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，考慮到實(shí)際操作可行性，將煙草發(fā)酵培養(yǎng)基組分的最佳配方調(diào)整為：硫酸銨添加量3.2 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)2.0%，蘋果酸添加量0.5 g/L。在此最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組合下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量實(shí)際值為32.27 g/L，實(shí)際值與理論值差異不大，充分證明該模型的準(zhǔn)確性與實(shí)用性，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量是優(yōu)化前的2.74倍。

2.3 細(xì)菌纖維素的持水性能測(cè)定結(jié)果

細(xì)菌纖維素的持水性能經(jīng)常用含水率和復(fù)水率來(lái)表示[30]，將煙草發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化前后的細(xì)菌纖維素進(jìn)行持水性能測(cè)定，其含水率、復(fù)水率和溶脹率結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 培養(yǎng)基優(yōu)化前后細(xì)菌纖維素的持水性能測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination results of water holding capacity of bacterial cellulose before and after medium optimization

由表4可知，與優(yōu)化前培養(yǎng)基相比，優(yōu)化后培養(yǎng)基的細(xì)菌纖維素含水率（94.35%）相差不大，但復(fù)水率（40.30%）和溶脹率（673.56%）分別增加了8%和2%。

3 結(jié)論

以木醋桿菌（Acetobacter xylinum）為試驗(yàn)菌株，靜態(tài)發(fā)酵煙草廢棄物制備細(xì)菌纖維素，最佳煙草發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：硫酸銨添加量3.2 g/L，蘋果酸添加量0.5 g/L，體積分?jǐn)?shù)2%的乙醇。在此最佳條件下，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量為32.27 g/L，是優(yōu)化前煙草發(fā)酵培養(yǎng)基的2.74倍。優(yōu)化后煙草發(fā)酵培養(yǎng)基制備的細(xì)菌纖維素含水率為94.35%，其復(fù)水率和溶脹率分別為40.30%和673.56%，與優(yōu)化前培養(yǎng)基的細(xì)菌纖維素相比，含水率相差不大，而復(fù)水率和溶脹率均有所增加。