響應(yīng)面法優(yōu)化納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶培養(yǎng)條件

潘冬梅，部麗群，楊傳倫，田杰偉，張心青，郭南南，冉新新，王紅霞，馬春峰，牟文杰，于帥帥

（1.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500；2.山東京博控股集團(tuán)有限公司，山東 濱州 256500；3.京博農(nóng)化科技有限公司，山東 濱州 256500）

納豆激酶（nattokianse，NK）是由納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶[1]，由日本學(xué)者須見(jiàn)洋行對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品納豆及其提取物作研究時(shí)發(fā)現(xiàn)的[2]。納豆激酶是目前最具有潛力的口服溶栓藥物[3]，體內(nèi)溶栓試驗(yàn)表明，納豆激酶能減緩血栓的形成時(shí)間，明顯提高血栓的再通率和減少肺內(nèi)血栓的形成[4]，且溶栓效果顯著高于同等劑量的尿激酶[5]。體外溶栓試驗(yàn)表明，納豆激酶能使纖溶酶原激活物抑制劑（plasminogen adivator inhibitor，PAI）失活，從而將血纖維蛋白溶酶原轉(zhuǎn)化為血纖維蛋白溶酶，通過(guò)蛋白水解作用直接溶解纖維蛋白凝塊[6]，沒(méi)有任何毒副作用，這一點(diǎn)不同于市面常用藥物組織型纖溶酶原激活劑、尿激酶、鏈激酶[7]。納豆激酶因具有高效的溶纖活性、安全性好[8]、生產(chǎn)成本低[9]、無(wú)毒副作用[10]、半衰期長(zhǎng)[11]、在胃腸的穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[12]，而被廣泛關(guān)注。

傳統(tǒng)上，納豆激酶均是經(jīng)過(guò)固態(tài)發(fā)酵獲得；目前，商業(yè)化應(yīng)用的固態(tài)發(fā)酵工藝的納豆激酶活性一般能達(dá)到20～100 FU/g[13]。由于這種方法的產(chǎn)率低、勞動(dòng)強(qiáng)度大，已經(jīng)很少使用。現(xiàn)在普遍采用的是液體發(fā)酵法。納豆芽孢桿菌的發(fā)酵過(guò)程較為復(fù)雜，優(yōu)化其培養(yǎng)條件對(duì)納豆激酶工藝開發(fā)、性能改善和工業(yè)化應(yīng)用發(fā)揮至關(guān)重要的作用[14]。熊曉輝等[15]對(duì)納豆激酶的深層液體發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，得到的發(fā)酵液酶活為700 IU/mL；董明盛等[16]篩選出菌株NK-5，對(duì)其進(jìn)行了培養(yǎng)條件的優(yōu)化，發(fā)酵液酶活力達(dá)683.3 U/mL；田秀媛等[17]利用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)納豆芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到的最佳種齡為8.5 h；KWON E Y等[18-19]都對(duì)納豆芽孢桿菌的液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化，而且酶活力也有較大提高。雖然納豆芽孢桿菌的產(chǎn)酶活力提高了很多，但納豆激酶總體產(chǎn)率較低、成本較高限制了其廣泛使用。

大量試驗(yàn)表明，響應(yīng)面分析方法在優(yōu)化培養(yǎng)基[20]、優(yōu)化培養(yǎng)條件方面是非常高效的工具[21-22]，響應(yīng)面分析方法能用較少的試驗(yàn)次數(shù)針對(duì)影響試驗(yàn)?zāi)康牡闹饕蛩亟?shù)學(xué)回歸模型[23]，并對(duì)模型進(jìn)行方差、顯著性分析，確定各因素之間的交互關(guān)系，找出響應(yīng)值最高對(duì)應(yīng)研究因素的最佳取值。本研究以實(shí)驗(yàn)室分離的一株高產(chǎn)納豆激酶的納豆芽孢桿菌為研究對(duì)象，在前期培養(yǎng)基優(yōu)化基礎(chǔ)上。先利用單因素試驗(yàn)優(yōu)化納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶培養(yǎng)條件，再利用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高納豆激酶活力，為納豆激酶產(chǎn)品的成本降低、廣泛使用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）：本實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。

1.1.2 試劑

胰蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、甘油、無(wú)水氯化鈣、七水硫酸鎂、十二水磷酸氫二鈉、無(wú)水磷酸二氫鉀、L-甲硫氨酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基[24]：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油43 g/L，豆粕粉24 g/L，無(wú)水氯化鈣0.14 g/L，七水硫酸鎂0.80 g/L，十二水磷酸氫二鈉3.00 g/L，無(wú)水磷酸二氫鉀1.00 g/L，L-甲硫氨酸0.20 g/L，pH 7.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BX-240H電子天平：日本島津公司；PHS-3C型精密pH計(jì)：上海雷磁儀器廠；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)：蘇州蘇凈凈化有限公司；HZQ-X100型振蕩培養(yǎng)箱：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；HC-2518R高速冷凍離心機(jī)：科大創(chuàng)新有限公司中佳分公司。

1.3 方法

1.3.1 納豆芽孢桿菌種子液及發(fā)酵液的制備

種子液的制備：挑取1環(huán)納豆芽孢桿菌菌株的新鮮斜面接種于裝液量為100 mL/500 mL的種子培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h（OD600nm值=1.5～1.6）。

發(fā)酵液的制備：將菌齡為24 h的種子液，按接種量5%（V/V）接種于裝液量為100 mL/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)96 h后，得到發(fā)酵液。

1.3.2 納豆激酶活力的測(cè)定

發(fā)酵液10 000 r/min離心10 min后，取上清液，采用紫外分光光度法[25]測(cè)定納豆激酶活力。

納豆激酶酶活力的定義：每分鐘波長(zhǎng)275 nm 處吸光度值增加0.01 所需要的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（FU/mL）。

1.3.3 納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

采用單因素輪換法依次考察培養(yǎng)溫度（27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃）、初始pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、培養(yǎng)時(shí)間（72 h、84 h、96 h、108 h、120 h）及菌齡（12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）對(duì)納豆激酶活力的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基初始pH（B）、接種量（C）、培養(yǎng)時(shí)間（D）、菌齡（E）為自變量，納豆激酶活力（Y）為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行5因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共分46個(gè)試驗(yàn)單元。其中40個(gè)為析因子，6個(gè)為中心重復(fù)試驗(yàn)以估計(jì)誤差。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for culture conditions optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 培養(yǎng)溫度的選擇

不同培養(yǎng)溫度對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖1。由圖1可知，當(dāng)培養(yǎng)溫度為27～33 ℃時(shí)，納豆激酶活力隨溫度升高而增大；當(dāng)培養(yǎng)溫度為33 ℃時(shí)，納豆激酶活力最高，為4 531 FU/mL；當(dāng)培養(yǎng)溫度為33～39 ℃時(shí)，納豆激酶活力有所下降。培養(yǎng)溫度由27 ℃升到33 ℃，納豆激酶活力逐漸升高，可見(jiàn)適溫可提高菌體的活性；培養(yǎng)溫度由33 ℃升到39 ℃，納豆激酶活力逐漸降低，可能高溫促進(jìn)了菌體的衰亡，影響了納豆激酶的產(chǎn)量。因此，最適培養(yǎng)溫度為33 ℃。

圖1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.1 Effect of different culture temperature on nattokinase activity

2.1.2 培養(yǎng)基初始pH的選擇

不同培養(yǎng)基初始pH值對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同培養(yǎng)基初始pH對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.2 Effect of different medium initial pH on nattokinase activity

由圖2可知，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0～7.5時(shí)，納豆激酶活力隨培養(yǎng)基初始pH升高而增大；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7.5時(shí)，納豆激酶活力最高，為4 556 FU/mL；當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7.5～8.0時(shí)，納豆激酶活力有所下降。pH偏低或偏高都不利于納豆激酶的合成。因此，最適培養(yǎng)基初始pH值為7.5。

2.1.3 接種量的選擇

不同接種量對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同接種量對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.3 Effect of different inoculum on nattokinase activity

由圖3可知，當(dāng)接種量為1%～3%時(shí)，納豆激酶活力隨接種量升高而增大；當(dāng)接種量為3%時(shí)，納豆激酶活力最高，為4 627 FU/mL；當(dāng)接種量為3%～9%時(shí)，納豆激酶活力有所下降。接種量偏小影響菌體的生長(zhǎng)、接種量偏大影響物質(zhì)的過(guò)快消耗，都阻礙了納豆激酶的產(chǎn)生。因此，最適接種量為3%。

2.1.4 培養(yǎng)時(shí)間的選擇

不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.4 Effect of different culture time on nattokinase activity

由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72～96 h時(shí)，納豆激酶活力隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為96 h時(shí)，納豆激酶活力最高，為4 792 FU/mL；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為96～120 h時(shí)，納豆激酶活力有所下降。發(fā)酵時(shí)間過(guò)短有部分產(chǎn)物還沒(méi)有分泌完全，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)偏長(zhǎng)又可能導(dǎo)致納豆激酶作為營(yíng)養(yǎng)被菌體利用，都達(dá)不到生產(chǎn)的最大效益化。因此，最適培養(yǎng)時(shí)間為96 h。

2.1.5 菌齡的選擇

不同菌齡對(duì)納豆芽孢桿菌產(chǎn)納豆激酶活力的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同菌齡對(duì)納豆激酶活力的影響Fig.5 Effect of different cell age on nattokinase activity

由圖5可知，當(dāng)菌齡為12～18 h時(shí)，納豆激酶活力隨菌齡升高而增大；當(dāng)菌齡為18 h時(shí)，納豆激酶活力最高為5 069 FU/mL，種子液在對(duì)數(shù)期轉(zhuǎn)接發(fā)酵瓶，菌種活力最強(qiáng)，遲緩期和衰亡期轉(zhuǎn)種都不能使菌種的生理代謝最活躍；當(dāng)菌齡為18～36 h時(shí)，納豆激酶活力有所下降。因此，最適菌齡為18 h。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果與分析

Box-Benhnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 培養(yǎng)條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for culture conditions optimization

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)Box-Benhnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到納豆激酶活力（Y）對(duì)培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)基初始pH（B）、接種量（C）、培養(yǎng)時(shí)間（D）、菌齡（E）的多元二次回歸方程如下：

由表3可知，模型P值＜0.000 1，模型極顯著，失擬項(xiàng)P值0.054 1＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明模型擬合性良好。模型決定系數(shù)R2=0.979 1，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.962 4，說(shuō)明有97.91%的數(shù)據(jù)都可用該方程進(jìn)行解釋，具有較高相關(guān)性，模型試驗(yàn)誤差合理。由P值可知，一次項(xiàng)A、B、C、D、E，二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他交互項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，5個(gè)因素對(duì)納豆激酶活力影響由大到小順序?yàn)椋号囵B(yǎng)溫度（A）＞菌齡（E）＞培養(yǎng)時(shí)間（D）＞接種量（C）＞培養(yǎng)基初始pH（B）。

利用Design-Expert 8.0.6軟件根據(jù)多元二次回歸方程繪制培養(yǎng)溫度（A）和培養(yǎng)基初始pH（B）間交互作用的三維響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基初始pH間交互作用對(duì)納豆激酶活力影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between culture temperature and culture medium initial pH on nattokinase activity

由圖6可知，納豆激酶活力隨著培養(yǎng)溫度（A）和培養(yǎng)基初始pH（B）兩者均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，A、B間交互作用響應(yīng)面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明二者間交互作用對(duì)納豆激酶活力的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.2 模型驗(yàn)證

根據(jù)二次回歸方程得到納豆激酶優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度33.66 ℃、培養(yǎng)基初始pH 7.47、接種量2.86%、培養(yǎng)時(shí)間95.15 h、菌齡17.51 h。在此條件下，納豆激酶活力預(yù)測(cè)值為5 079 FU/mL。為了方便實(shí)際操作，將培養(yǎng)條件修正為：培養(yǎng)溫度34 ℃、培養(yǎng)基初始pH 7.5、接種量3%、培養(yǎng)時(shí)間95 h、菌齡17.5 h。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，納豆激酶活力分別為5 092 FU/mL、5 083 FU/mL、5 087 FU/mL，平均實(shí)際值為5 087 FU/mL，與預(yù)測(cè)值基本一致，納豆激酶活力較優(yōu)化前提高了18.83%。

3 結(jié)論

本研究取影響納豆激酶活力的5個(gè)重要條件因子，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)5因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，得出納豆激酶的最佳培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度34 ℃、發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值7.5、接種量3%、培養(yǎng)時(shí)間95 h、菌齡17.50 h。在此最佳培養(yǎng)條件下，納豆激酶活力達(dá)到5 087 FU/mL，較優(yōu)化前提高18.83%。