基于響應面法優(yōu)化高產乙酸乙酯清香型白酒大米查酒醅發(fā)酵工藝

高文靜，甄 攀，李惠源，趙瑛璐，趙港國，韓 英，賈麗艷

（1.山西農業(yè)大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801；2.山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801；3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 呂梁 032209）

白酒是我國的國酒[1]，是中國特有的蒸餾酒[2]。根據風格的不同，可將白酒劃分為清香型、濃香型、醬香型、米香型等香型[3]，其中，由于清香型白酒具有“清香純正，綿甜爽凈，醇甜柔和”的風格[4-5]，深受國內外廣大消費者的喜愛。清香型白酒是以高粱為原料，以大曲為糖化發(fā)酵劑，采用“清蒸二次清，地缸固態(tài)發(fā)酵，甑桶蒸餾”工藝生產而成的白酒，其主要的風味物質為乙酸乙酯[6-9]。乙酸乙酯的含量影響著白酒的品質及風格[10]。由于清香型白酒的發(fā)酵過程是“物系、酶系、菌系”及發(fā)酵條件動態(tài)變化過程[11-12]。乙酸乙酯的形成因受外界環(huán)境影響，具有一定的波動性[13]。因此，研究發(fā)酵條件對清香型白酒中乙酸乙酯形成的影響，對于調控清香型白酒中乙酸乙酯的形成，穩(wěn)定和進一步提升清香型白酒中乙酸乙酯的含量，助推清香型白酒向可控化、智能化方向發(fā)展具有重要意義[14-17]。該研究以清香型白酒大米查發(fā)酵工藝為基礎，通過恒溫發(fā)酵的方式，采用單因素試驗，探究水添加量、大曲添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等因素對清香型白酒發(fā)酵過程中乙酸乙酯形成影響，并在單因素試驗基礎上，以乙酸乙酯產量為評價指標，采用響應面試驗優(yōu)化高產乙酸乙酯的發(fā)酵工藝條件，為清香型白酒品質穩(wěn)定和提升提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱（晉雜22號）、低溫大曲（精米查曲、紅心曲、后火曲的混合生產用曲）：山西某酒廠提供。

乙酸乙酯（分析純）、磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）：上海阿拉丁科技公司；無水乙醇、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市風和化學試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BS2010S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；Agilent 1260高效液相色譜（high-performance liquid chromatogra phy，HPLC）儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；85-2A磁力攪拌器：精鑿科技（上海）有限公司；ST2100 pH計：常州奧豪斯儀器有限公司；Top Pette移液槍：濟南東儀試驗室設備有限公司；SCAA-104有機相尼龍針式濾器：上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 清香型白酒的加工工藝流程及操作要點

操作要點：參考《清香型白酒生產技術》[18]。

1.3.2 分析檢測

酒精度的測定：參考國標GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》[19]中的酒精計法；乙酸乙酯含量的測定：參考魏志陽等[20]的高效液相色譜法，略有修改。高效液相色譜分析條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速1.0mL/min；進樣量20μL；檢測波長210nm。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗

將粉碎后的高粱，在不同發(fā)酵時間（0、3 d、7 d、15 d、17 d、21 d、28 d）、發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、大曲添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、水添加量（80%、100%、120%、140%、160%）的條件下進行發(fā)酵。分別測定酒醅酒精度和乙酸乙酯含量，探究以上各因素對清香型白酒發(fā)酵大米查酒醅中乙酸乙酯形成的影響。

（2）響應面試驗

根據單因素試驗，確定影響清香型白酒發(fā)酵大米查酒醅中乙酸乙酯形成的三個顯著因素，以大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）為評價因素，以酒醅中乙酸乙酯含量（Y）作為響應值，設計響應面試驗，響應面試驗的因素與水平見表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation process optimization

1.3.4 數據處理

利用Origin 8.5軟件繪圖，Design Expert 10.0.7進行響應面試驗數據分析。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間對清香型白酒酒醅中乙酸乙酯形成的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵時間在0～21 d范圍內的增加，清香型白酒發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度均呈現(xiàn)先增加后略有降低的趨勢，發(fā)酵初期酒醅中乙酸乙酯含量快速上升；當發(fā)酵時間達到21 d時，發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯含量達到最高，為（0.71±0.020）g/kg；當發(fā)酵時間達到17 d時，酒精度最高，為（11.8±0.20）%vol；發(fā)酵時間在21～28 d時，酒醅中乙酸乙酯含量略微降低。發(fā)酵時間在17～28 d時，酒精度略有降低。發(fā)酵后期，酒醅中營養(yǎng)物質被消耗，微生物代謝緩慢，產酯能力下降。因此，選擇最適發(fā)酵時間為21 d。

圖1 發(fā)酵時間對酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.1.2 發(fā)酵溫度對清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影響

低溫發(fā)酵有利于養(yǎng)醅，防止酒醅生酸過快[21]，可以提高出酒率；并且低溫發(fā)酵酒甜，綿柔爽凈；高溫發(fā)酵的酒苦，后味苦澀、雜味大[22]。

由圖2可知，當發(fā)酵溫度在24～28 ℃范圍內的升高，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量隨之增加；當發(fā)酵溫度為28 ℃時，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度達到最高，分別為（0.75±0.02）g/kg、（11.9±0.21）%vol；當發(fā)酵溫度在28～34 ℃時，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量隨之下降。通過與室溫發(fā)酵對比發(fā)現(xiàn)，在一定的溫度范圍內，當酒醅發(fā)酵溫度恒定，有利于酒醅發(fā)酵中乙酸乙酯和乙醇的形成。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.1.3 大曲添加量對清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影響大曲

作為重要的糖化劑和發(fā)酵劑[23]，是引起酒醅發(fā)酵的微生物及其代謝產物的主要來源[24]。大曲的品質和質量在清香型白酒發(fā)酵過程中尤其重要[25]。

由圖3可知，當大曲添加量在2%～12%范圍內的增加，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度隨之升高；當大曲添加量為12%時，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度最高，分別達到（0.81±0.01）g/kg、（11.8±0.15）%vol；隨著大曲添加量在2%～12%范圍內的增加，酒醅中酯化酶作用加快，加速了酒醅中淀粉的轉化，乙酸乙酯合成速率加快，所以酒醅中乙酸乙酯含量快速增加。因此，選擇最適大曲添加量為12%。

圖3 大曲添加量對酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.3 Effect of Daqu addition on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.1.4 水添加量對清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影響

白酒發(fā)酵過程中除了發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間等因素，水添加量也會在一定程度上影響到酒體的成分和品質[26]。

由圖4可知，隨著水添加量在80%～120%范圍內的增加，酒醅中的乙酸乙酯含量和酒精度隨之增加；當水添加量為120%時，酒醅中乙酸乙酯含量達到最高，為（0.86±0.01）g/kg；當水添加量為140%時，酒醅中酒精度最高，為（11.4±0.15）%vol；當水添加量＞120%之后，乙酸乙酯含量有所下降；當水添加量＞140%之后，酒精度稍有降低。因此，選擇最適水添加量為120%。

圖4 水添加量對酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.4 Effect of water addition on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

通過單因素試驗，篩選出了3個影響清香型白酒大米查發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度變化的顯著因子，以大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）為自變量，酒醅中乙酸乙酯含量（Y）作為響應值，進行響應面優(yōu)化試驗設計，結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計與結果Table2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

應用Design Expert 10.0.7軟件分析了大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）3因素對清香型白酒中乙酸乙酯含量的影響，得出酒醅中乙酸乙酯含量（Y）的二次回歸方程為：Y=+0.90+0.008 75A+0.031B+0.018C-0.005AB+0.012AC+0.002 5BC-0.097A2-0.097B2-0.13C2。

根據表3可知，建立的酒醅發(fā)酵產乙酸乙酯的回歸模型P值＜0.000 1，表明此響應面回歸模型極顯著。乙酸乙酯失擬項P值=0.123 4＞0.05，不顯著，說明試驗誤差較小，響應面模型預測的結果可靠?；貧w方程決定系數R2為0.997 6，校正決定系數R2adj為0.994 5，表明多元回歸關系顯著，此試驗設計可靠，因此可以利用該回歸方程預測上述因素對清香型白酒中乙酸乙酯含量的影響。由P值可知，一次項B、C及二次項A2、B2、C2對酒醅中乙酸乙酯含量影響均極顯著（P＜0.01），一次項A及交互項AC對酒醅中乙酸乙酯含量的影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3因素對酒醅中乙酸乙酯含量的影響順序為發(fā)酵溫度＞水添加量＞大曲添加量。

2.2.2 各因素對清香型白酒酒醅中乙酸乙酯形成影響的響應面分析

大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）三個因素交互作用對清香型白酒大米查酒醅中乙酸乙酯含量（Y）影響響應面及等高線見圖5。根據各因素之間的三維響應面圖形觀察各因素間交互作用的強弱，也可以反映出各個交互作用對響應值的影響強弱。等高線圖中曲線越陡，影響越顯著；曲線越平順，影響越微弱。三維響應面圖的形狀變化表示響應值的變化。

圖5 大曲添加量、發(fā)酵溫度和水分添加量間交互作用對乙酸乙酯含量影響的響應曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between Daqu addition,fermentation temperature and water addition on ethyl acetate contents

由圖5可知，各因素間交互作用對結果影響的響應面曲線走勢較陡，等高線呈橢圓形，說明AB、AC、BC之間存在交互作用，乙酸乙酯含量隨著大曲添加量（A）、水添加量（C）兩者交互作用響應面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，對乙酸乙酯含量的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.3 響應面驗證試驗

通過Design-Expert 10.0.8軟件得到最優(yōu)工藝參數為大曲添加量12.17%，發(fā)酵溫度28.31 ℃，水添加量118.52%。為了便于實際操作，將清香型白酒大米查最優(yōu)發(fā)酵工藝條件修正為：大曲添加量12.2%，發(fā)酵溫度28 ℃，水添加量118%，在此優(yōu)化條件下，進行3次平行驗證試驗，乙酸乙酯含量實際值為（0.91±0.02）g/kg，與預測值0.901 g/kg基本保持一致，故該模型可行。

3 結論

通過單因素及響應面試驗，確定了高產乙酸乙酯清香型白酒的最優(yōu)發(fā)酵條件為大曲添加量12.2%，發(fā)酵溫度28℃，水添加量118%。在此最佳條件下，酒醅中乙酸乙酯含量達到最高，為（0.91±0.02）g/kg。本研究為提高清香型白酒酒醅中乙酸乙酯的含量及促進清香型白酒向智能化、可控化方向發(fā)展提供技術支撐。