木葡糖酸醋桿菌發(fā)酵黃酒糟酶解液產(chǎn)細(xì)菌纖維素的研究

魯瑞剛，陸進(jìn)舟，朱佳蓮，周 牽，陸筑鳳，李加友

（1.浙江嘉善黃酒股份有限公司，浙江 嘉興 314100；2.嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001）

細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是由醋酸菌屬（Acetobacter）、根瘤菌屬（Rhizobium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）和八疊球菌屬（Sarcina）等微生物在不同條件下合成的纖維素統(tǒng)稱[1]。細(xì)菌纖維素不含木質(zhì)素、果膠和半纖維素等伴生產(chǎn)物，具有高結(jié)晶度和高聚合度，擁有納米級的超精細(xì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（因此又稱為細(xì)菌納米纖維素），具備良好的彈性、聚合性、延展性、可降解性[2-3]。目前，細(xì)菌纖維素廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)用敷料、人工角膜和復(fù)合材料等領(lǐng)域[4-8]，被譽(yù)為21世紀(jì)最具發(fā)展前景的生物材料[9-10]。

目前，國內(nèi)外對細(xì)菌納米纖維素相關(guān)方面的研究開展了大量工作，如高產(chǎn)菌株選育、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化、操作方式和代謝機(jī)理等[11-13]。但是，制約細(xì)菌纖維素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要原因是生產(chǎn)成本過高，其關(guān)鍵之處在于發(fā)酵效率較低和生產(chǎn)原料成本過高。因此，利用廢棄物如酒糟浸出液、黃水等生產(chǎn)細(xì)菌纖維素一方面可以降低生產(chǎn)成本，另一方面實(shí)現(xiàn)了廢棄物的資源化利用[14-16]。GAYATHRI G等[17]利用篩選獲得的Komagataeibacter saccharivorans發(fā)酵廢棄酒糟，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為1.24 g/L；張沙沙等[18]利用木薯水解液為發(fā)酵培養(yǎng)基，將細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量提高到5.75 g/L，但是單位體積產(chǎn)量仍然不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)需要。王英男等[19]以乳清液為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的顯著提升，但是原料成本過高，且資源局限。另一方面，我國釀酒工業(yè)發(fā)達(dá)，廢棄酒糟產(chǎn)量巨大，酒糟中殘留的淀粉、蛋白質(zhì)和氨基酸豐富，具有開發(fā)為細(xì)菌纖維素生產(chǎn)原料的潛力。賀富強(qiáng)等[20]用白酒糟酶解液作為促進(jìn)劑添加到細(xì)菌纖維素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，研究表明，酒糟中含有促進(jìn)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量提升的活性因子，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為4.84 g/L，較對照提升了135.3%。馬霞等[21]采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了細(xì)菌纖維素的發(fā)酵條件，并添加黃酒酒糟浸出液，在發(fā)酵溫度30 ℃的條件下，培養(yǎng)7 d后的細(xì)菌纖維素產(chǎn)量為14.44 g/L，較優(yōu)化前提高了1.5倍。

在研究文獻(xiàn)和前期工作的基礎(chǔ)上，認(rèn)為利用自有的高性能細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌株，可以將黃酒酒糟酶解液作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并充分發(fā)揮酒糟中活性因子的促進(jìn)作用，只需添加部分營養(yǎng)物，實(shí)現(xiàn)細(xì)菌纖維素的高產(chǎn)，降低原料成本。因此，本研究將通過對黃酒酒糟酶解液發(fā)酵生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的工藝條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，以期為細(xì)菌纖維素的低成本高產(chǎn)發(fā)酵開辟一條新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

新鮮黃酒酒糟：浙江嘉善黃酒股份有限公司；紅茶（金駿眉900）：福建南平市一杯香茶葉有限公司；木葡糖酸醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）BC19-2：本實(shí)驗(yàn)室馴化，菌體濃度為108個(gè)/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

蔗糖：云南滇鵬糖業(yè)有限公司；葡萄糖、檸檬酸、氫氧化鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母膏：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨：杭州微生物試劑有限公司；無水乙醇、乙酸：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；葡糖淀粉酶（酶活260 000 U/mL）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司。所用試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

細(xì)菌纖維素發(fā)酵初始培養(yǎng)基：蔗糖10 g，紅茶2 g，水100 mL，pH 5.0。煮沸后采用三層紗布過濾后取上清液，冷卻至室溫。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；THZ-92B臺(tái)式恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；WB-6數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州邁諾儀器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酒糟酶解液的制備

將新鮮的黃酒酒糟用攪拌器打碎，按照酒糟干質(zhì)量加入3倍質(zhì)量的水，然后加入總體積0.5%的葡糖淀粉酶（酶活260 000 U/mL），充分?jǐn)嚢杈鶆?，在酶解溫?0 ℃條件下酶解3 h后用紗布過濾制得酒糟酶解液，備用。

1.3.2 細(xì)菌纖維素的發(fā)酵制備

于配制好的細(xì)菌纖維素發(fā)酵初始培養(yǎng)基中接種6%實(shí)驗(yàn)室保存的木葡糖酸醋桿菌BC19-2，25 ℃恒溫靜置培養(yǎng)5 d，待培養(yǎng)液表面長出細(xì)菌纖維素膜，定期稱量并計(jì)算細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。

1.3.3 細(xì)菌纖維素的制備條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

家庭也有用缸貯藏番茄的，其方法是將缸沖刷干凈，然后把選好的番茄裝入缸內(nèi)，裝缸時(shí)以3～4個(gè)果高為一層，每層之間要設(shè)支架隔離以防擠壓損傷，裝滿后用塑料薄膜封缸口，15～20天打開檢查一次，迅速挑出爛果實(shí)，然后重新裝缸密封，繼續(xù)貯藏。

分別考察不同培養(yǎng)基組成的碳源（2%、4%、6%、8%、10%的蔗糖、葡萄糖、新鮮黃酒酒糟酶解液），氮源（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的復(fù)合氮源（酵母膏∶蛋白胨=1∶1）、硝酸銨及1 g/100 mL、1.5 g/100 mL、2 g/100 mL、2.5 g/100 mL、3 g/100 mL的紅茶）；初始pH（3、4、5、6、7）、培養(yǎng)溫度（20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃）、接種量（2%、4%、6%、8%、10%）；黃酒酒糟酶解液酶解時(shí)間（0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h）、酶解液體積分?jǐn)?shù)（10%、30%、50%、70%、90%）對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響。

1.3.4 測定方法

采用稱質(zhì)量法（濕質(zhì)量）測定細(xì)菌纖維素產(chǎn)量：取出纖維素膜，沖洗干凈；而用酒糟酶解液發(fā)酵而成的細(xì)菌纖維素膜背面會(huì)殘留一層酒糟渣顆粒，需用手輕輕搓洗干凈，之后置于紗布上方瀝干20 min后稱質(zhì)量[22]。

1.3.5 細(xì)菌纖維素膜的表征

參考張雯等[23]的方法并做適當(dāng)?shù)男薷模簩l(fā)酵完成后所得到的細(xì)菌纖維素膜清洗干凈之后，浸泡于0.1 mol/L的NaOH中，置于燒杯內(nèi)在水浴鍋中90 ℃水浴加熱。反復(fù)換堿液若干次直至纖維素膜呈半透明狀。將膜取出用蒸餾水洗凈，放入冰箱-18 ℃預(yù)凍至定型，進(jìn)行真空冷凍干燥，制得凍干的細(xì)菌纖維素膜。參照文獻(xiàn)[22]進(jìn)行電鏡檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組成對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.1.1 碳源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

由圖1可知，隨著碳源添加量的增加，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量也均有所增加，但在添加量達(dá)到6%之后，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量趨于平穩(wěn)。由此可以看出，在碳源濃度較低時(shí)，隨著碳源添加量的增加，木葡糖酸醋桿菌生長更快，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量越高；另一方面，3種碳源中以酒糟酶解液為碳源時(shí)細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最大（24.8 g/L），以蔗糖為碳源時(shí)產(chǎn)量最小。基于對細(xì)菌纖維素發(fā)酵初始培養(yǎng)基的比較，進(jìn)一步考察了3種碳源添加量均為10%時(shí)細(xì)菌纖維素的發(fā)酵能力，酒糟酶解液產(chǎn)細(xì)菌纖維素能力最強(qiáng)（24.6 g/L），葡萄糖次之（23.2 g/L），蔗糖最低（20.8 g/L），因此，最佳碳源為酒糟酶解液，最佳添加量為6%。

圖1 不同碳源添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon source addition on bacterial cellulose yield

2.1.2 氮源對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

圖2 不同氮源添加量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of different nitrogen source addition on bacterial cellulose yield

2.2 培養(yǎng)條件對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.2.1 初始pH值對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

由圖3可知，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量在培養(yǎng)基初始pH值為6時(shí)達(dá)到最高。木葡糖酸醋桿菌是醋酸菌屬，喜好偏弱酸性的環(huán)境，太高或太低的pH值都會(huì)對菌種的生長與產(chǎn)細(xì)菌纖維素能力產(chǎn)生負(fù)面影響[24]。因此，最佳初始pH值為6。

圖3 初始pH值對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of initial pH value on bacterial cellulose yield

2.2.2 培養(yǎng)溫度對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

由圖4可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量增高，在30 ℃時(shí)達(dá)到峰值；溫度繼續(xù)升高時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量則會(huì)減少；培養(yǎng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，木葡糖酸醋桿菌便不再產(chǎn)細(xì)菌纖維素。由此可見，低溫時(shí)木葡糖酸醋桿菌生長緩慢，細(xì)菌纖維素形成耗時(shí)長，而溫度過高則會(huì)導(dǎo)致木葡糖酸醋桿菌休眠或死亡，無法產(chǎn)生細(xì)菌纖維素[25]。因此，最佳培養(yǎng)溫度為30 ℃。

圖4 培養(yǎng)溫度對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of culture temperature on bacterial cellulose yield

2.2.3 接種量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

由圖5可知，隨著菌液接種量增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量也隨之增加，當(dāng)接種量達(dá)6%后，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量達(dá)到峰值；繼續(xù)增加接種量，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量隨之減少。接種量過大將不利于細(xì)菌生長，還易引起發(fā)酵過程中溶氧不足的問題，影響產(chǎn)物細(xì)菌纖維素合成；接種量過小時(shí)木葡糖酸醋桿菌生長緩慢，培養(yǎng)時(shí)間過長，產(chǎn)物細(xì)菌纖維素生產(chǎn)效率低。因此，最佳接種量為6%。

圖5 接種量對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of inoculum on bacterial cellulose yield

2.3 酒糟酶解條件對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

2.3.1 酶解時(shí)間對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

由圖6可知，在酒糟酶解過程中，隨酶解時(shí)間增加，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量增加，在酶解3 h時(shí)達(dá)到峰值；酶解時(shí)間超過3 h之后，細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量稍有減小。因此，黃酒糟酶解處理的最佳酶解時(shí)間為3 h。

圖6 酶解時(shí)間對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of enzymatic hydrolysis time on bacterial cellulose yield

2.3.2 酒糟酶解液體積分?jǐn)?shù)對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響

由圖7可知，當(dāng)酒糟酶解液體積分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量極低；酒糟酶解液體積分?jǐn)?shù)30%后有明顯提高，酒糟酶解液體積分?jǐn)?shù)為90%時(shí)，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高，達(dá)到26.5 g/L。酒糟酶解液中含有豐富的木葡糖酸醋桿菌產(chǎn)細(xì)菌纖維素所需的營養(yǎng)物質(zhì)，濃度越高越利于菌群生長。由此可見，酒糟酶解液直接用作培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌纖維素發(fā)酵是可行的，酒糟酶解液最佳體積分?jǐn)?shù)為90%。

圖7 酶解液體積分?jǐn)?shù)對細(xì)菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of enzymatic liquid volume fraction on bacterial cellulose yield

2.4 細(xì)菌纖維素膜的含水量

通過測定發(fā)現(xiàn)，未堿洗的細(xì)菌纖維素膜含水量為92.8%；堿洗后的細(xì)菌纖維素膜含水量為99.0%。由此可知，細(xì)菌纖維素膜具有極好的持水性，堿洗后的細(xì)菌纖維素膜相較于未堿洗的細(xì)菌纖維素膜，持水性更好。

2.5 細(xì)菌纖維素膜的顯微觀察

由圖8可知，得到的細(xì)菌纖維素膜均為由纖細(xì)狀纖維絲組成的三維立體納米級網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，多孔且結(jié)構(gòu)緊密。而堿洗后再干燥的細(xì)菌纖維素膜（圖8b）相較于未堿洗直接干燥的細(xì)菌纖維素膜（圖8a），其纖維絲上附著的殘余營養(yǎng)物質(zhì)被洗去，纖維絲之間的粘連程度更低，結(jié)構(gòu)更致密，更有利于其后期作為材料的應(yīng)用。

圖8 細(xì)菌纖維素膜冷凍干燥后的掃描電鏡圖Fig.8 Scanning electron microscopy of bacterial cellulose membrane after freeze drying

3 結(jié)論

木葡糖酸醋桿菌BC19-2發(fā)酵培養(yǎng)生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的優(yōu)化條件：培養(yǎng)基組成為黃酒糟酶解液6%、紅茶2 g/100 mL；培養(yǎng)條件為初始pH 6.0、培養(yǎng)溫度30 ℃、接種量6%；黃酒糟酶解條件為酶解時(shí)間3 h，黃酒糟酶解液體積分?jǐn)?shù)90%。在此條件下細(xì)菌纖維素產(chǎn)量最高為26.5 g/L，解決了培養(yǎng)基中殘留的紅茶渣對纖維素膜品質(zhì)影響問題。堿洗后的細(xì)菌纖維素膜含水量為99%，極好的持水能力展現(xiàn)了在醫(yī)藥等領(lǐng)域的良好應(yīng)用前景。