屎腸球菌對凡納濱對蝦生長、非特異免疫及抗病力的影響?

汪仕爽，羅 凱，王明陽，魏 聰，李 麗，2，董雙林，2，劉清兵，田相利，2??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.青島瑞滋集團(tuán)有限公司，山東 青島 266408)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)俗稱南美白對蝦，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)，與斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)和羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)同為世界三大蝦類養(yǎng)殖品種[1]。作為中國重要的養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)品種之一，凡納濱對蝦的養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量一直處于高速增長狀態(tài)。據(jù)統(tǒng)計，2020年中國凡納濱對蝦的總產(chǎn)量高達(dá)186萬t[2]。然而，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大和集約化程度的加劇，水質(zhì)惡化和病害頻發(fā)成為制約我國對蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要因素[3]。在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，常用抗生素和化學(xué)藥物防治對蝦的細(xì)菌性疾病，但長期使用抗生素易造成養(yǎng)殖生物的腸道菌群失調(diào)，抗生素的長期使用也容易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，并在機(jī)體內(nèi)殘留，危及人體健康[3-5]。

益生菌作為抗生素綠色友好的替代品之一，近年來一直是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)研究的熱點(diǎn)[3,6-7]。水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的益生菌包括芽孢桿菌、乳酸菌、光合細(xì)菌和酵母等，已被廣泛研究并應(yīng)用于飼料添加劑或作為水質(zhì)改良劑[7]。乳酸菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中最受關(guān)注的益生菌之一，其益生作用主要包括促進(jìn)養(yǎng)殖動物腸道消化吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)、提高非特異性免疫力等[6-8]。屎腸球菌(Enterococcusfaecium)是常見的乳酸菌之一，其代謝可產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素和過氧化氫等物質(zhì)，益生作用已在畜禽和反芻動物養(yǎng)殖中得到明確驗(yàn)證，可有效抑制有害微生物的生長，維持腸道菌群平衡，增強(qiáng)機(jī)體免疫反應(yīng)，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并具有改善機(jī)體生長性能的效果[9-12]。然而，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，與其他益生菌相比，盡管屎腸球菌也具有一定的實(shí)際應(yīng)用，但對其合理的使用劑量及其益生作用的相關(guān)研究目前還少見報道。

本研究以凡納濱對蝦為研究對象，評估了5種不同添加濃度的屎腸球菌對幼蝦的生長、非特異性免疫指標(biāo)和抗病力的影響，旨在為屎腸球菌在凡納濱對蝦養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康凡納濱對蝦購自青島正大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。本研究中對蝦原養(yǎng)殖海水鹽度為18左右，但實(shí)驗(yàn)基地所用海水鹽度為30左右，故對蝦暫養(yǎng)期間海水鹽度每日升高2對對蝦進(jìn)行高鹽度訓(xùn)化，直至鹽度30，并繼續(xù)暫養(yǎng)2周。暫養(yǎng)結(jié)束后，對蝦禁食處理24 h，后隨機(jī)挑選450尾健康、大小均勻的對蝦(0.94±0.20)g，均勻分配到45 L水族箱中，每個水族箱密度為15尾。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株和實(shí)驗(yàn)設(shè)計

實(shí)驗(yàn)用屎腸球菌(E.faecium，編號：HK)來自中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室，該菌株分離自健康凡納濱對蝦腸道，其16S rRNA序列的NCBI登陸號為ON076015。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中用加強(qiáng)培養(yǎng)基將屎腸球菌株活化培養(yǎng)24 h，直至其生長到對數(shù)期。將屎腸球菌液在4 ℃，3 000 r·min-1條件下離心10 min收獲菌體。之后，用無菌生理鹽水漂洗2～3次屎腸球菌體，并用無菌生理鹽水制成濃度為1×109cfu/mL的屎腸球菌懸液備用。將屎腸球菌液稀釋或濃縮到所需濃度。

本研究分別設(shè)置了5個不同的屎腸球菌添加濃度，分別為1×108、1×109、1×1010、1×1011和1×1012cfu/kg(分別記為FSA、FSB、FSC、FSD和FSE)，以商品飼料作為對照(CON)，實(shí)驗(yàn)周期為42 d。

1.3 飼料制備

本研究選用青島正大農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司凡納濱對蝦商品配合飼料作為基礎(chǔ)飼料(飼料主要成分見表1)，制備了不同屎腸球菌添加濃度的實(shí)驗(yàn)飼料。具體方法為：先將海藻酸鈉和蒸餾水以3.15 g∶100 mL比例混勻，于90 ℃電磁爐下加熱至完全溶解，然后將溶解后的海藻酸鈉和魚油以100 mL∶4.2 mL比例混勻；之后，將重懸后的菌體用30 mL注射器均勻噴灑到飼料表面，混勻后再按一定比例添加海藻酸鈉和魚油混合物；最后，將配合飼料揉搓均勻并陰干保存于4 ℃冰箱備用。對照組除不添加菌液之外，其他配制與處理組相同。

表1 基礎(chǔ)飼料主要成分

1.4 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間，每天投喂4次，投喂時間分別為10：00、14：00、18：00和22：00。每天的具體投喂量視對蝦攝食情況而定，總投喂量為對蝦體質(zhì)量的4%～5%。每次投喂1 h后或換水前收集水族箱中的殘餌和糞便。經(jīng)淡水沖洗2次去除鹽分后，置于80 ℃烘箱中烘干并稱重記錄。實(shí)驗(yàn)期間，每日換水1次，換水量1/3～1/2。

1.5 樣品采集與處理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對對蝦進(jìn)行稱重記錄。對蝦饑餓24 h后，每個水族箱采集10尾對蝦，每個處理組共采集50尾對蝦，分別采集對蝦的血液和肝胰腺樣品。血液在4 ℃冰箱靜置過夜離心(3 000 r·min-1，10 min)后，將離心管中上層血清取出置于-80 ℃冰箱備用待測。用滅菌的剪刀和鑷子采集對蝦肝胰腺和腸道，肝胰腺剪碎后充分浸潤到含有RNA保護(hù)液的滅菌離心管中。RNA保護(hù)液中的樣品于4 ℃冰箱靜置24 h后，保存在-80 ℃冰箱備用待測。

1.6 指標(biāo)測定

1.6.1 生長指標(biāo) 對蝦的生長情況通過成活率、特定生長率和飼料效率等確定，具體公式如下：

成活率(SR)=(實(shí)驗(yàn)后對蝦數(shù)量/實(shí)驗(yàn)前放養(yǎng)數(shù)量)×100%；

(1)

特定生長率(SGR)=[(lnWt-lnW0)/t]×100%；

(2)

飼料效率(FER)=(Wt-W0)/Wf×100%。

(3)

式中：W0、Wt分別為對蝦初體質(zhì)量和末體質(zhì)量(g)；t為實(shí)驗(yàn)周期(d)；Wf為實(shí)驗(yàn)期間投入的飼料量(g)。

1.6.2 血清非特異性免疫指標(biāo) 對蝦血清用于測定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutse，SOD)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，AKP)、酸性磷酸酶(Acid phosphatase，ACP)、溶菌酶(Lysozyme，LZM)、酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)和總一氧化氮合酶(Total nitric oxide synthase，TNOS)。測定所使用的試劑盒購置于南京建成生物有限公司，并嚴(yán)格參照對應(yīng)的說明書進(jìn)行測定。

1.6.3 免疫信號通路相關(guān)基因表達(dá) 肝胰腺組織樣品總RNA以Trizol法提取，并用瓊脂凝膠電泳檢測總 RNA 的完整度。用Thermo NanoDrope 2000微量紫外分光光度計檢測樣品中總RNA的濃度和純度是否達(dá)到實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，之后按照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄樣品總RNA從而得到cDNA。利用熒光實(shí)時定量 PCR 方法測定各處理對蝦肝胰腺中相關(guān)免疫基因的表達(dá)水平，即SOD、LZM、proPO、LGBP、HSP70、Imd、Toll、Relish、TOR、4E-BP、eIF4E1α和eIF4E2。具體測定步驟按照SYBRQR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)Kit(TaKaRa, Japan)試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系總量為20 μL，包括10 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)，0.5 μL正向引物(濃度10 μmol·L-1)，0.5 μL反向引物(濃度 10 μmol·L-1)，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ(50×)，3.0 μL cDNA，5.6 μL DEPC 處理水。qPCR反應(yīng)程序設(shè)定如下：95 ℃持續(xù)30 s；95 ℃持續(xù)10 s，降至60 ℃持續(xù)1 min，共40個循環(huán)；95 ℃持續(xù)15 s，降至60 ℃持續(xù)1 min，最后95 ℃持續(xù)15 s。擴(kuò)增結(jié)束后，采用2-ΔΔCt相對定量的方法計算各處理凡納濱對蝦肝胰腺相關(guān)免疫基因的相對表達(dá)量。引物擴(kuò)增效率整體范圍在90%～110%之間。本研究qRT-PCR 使用的引物序列詳見表2。

表2 實(shí)時熒光定量使用的引物序列

1.6.4 攻毒實(shí)驗(yàn) 攻毒實(shí)驗(yàn)所使用的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)由中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院養(yǎng)殖生態(tài)實(shí)驗(yàn)室分離于患病凡納濱對蝦。培養(yǎng)條件為：TSB 培養(yǎng)基，28 ℃，18～24 h。培養(yǎng)數(shù)代后用血球計數(shù)板法與平板培養(yǎng)法相結(jié)合的方法共同統(tǒng)計有效活菌數(shù)量。正式攻毒實(shí)驗(yàn)開始前，參考實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果，根據(jù)對蝦規(guī)格，以每尾對蝦25 μL的注射量，分別設(shè)置了1×107～5×107cfu·mL-15個不同的副溶血弧菌濃度梯度，進(jìn)行了14 d預(yù)實(shí)驗(yàn)，最終確定副溶血弧菌的半數(shù)致死濃度為2×107cfu·mL-1。從對照組和各處理組隨機(jī)挑選24尾對蝦進(jìn)行正式攻毒實(shí)驗(yàn)，為期14 d。每個處理設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)8尾對蝦，弧菌注射濃度為2×107cfu·mL-1，每日觀察和統(tǒng)計各處理組中對蝦狀態(tài)和日死亡數(shù)量情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

通過 SPSS 22.0 軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)在滿足方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析和 Tukey’s 多重比較分析，顯著性水平為P<0.05。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±S.E.M)來表示。

2 結(jié)果

2.1 對蝦生長情況

飼料中添加不同濃度屎腸球菌HK下凡納濱對蝦生長情況如表 3所示。對蝦成活率在80.0%～92.0%之間，各處理組間差異不顯著(P>0.05)。FSB和FSC組對蝦末體質(zhì)量和特定生長率均顯著高于對照組，其中，F(xiàn)SC組對蝦特定生長率顯著高于其他處理組，F(xiàn)SC組飼料效率顯著高于FSA組和對照組(P<0.05)，其他各組組間差異不顯著(P>0.05)。

表3 凡納濱對蝦的成活率、生長率和飼料效率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)

2.2 血清非特異性免疫指標(biāo)

飼料中添加不同濃度屎腸球菌HK對凡納濱對蝦非特異性免疫指標(biāo)的影響如圖1所示。其中FSC組對蝦血清中堿性磷酸酶活性顯著高于對照、FSA、FSB和FSD組(P<0.05)。除FSC組外，其他各處理組與對照組差異不顯著(P>0.05，見圖1A)。

(FSA、FSB、FSC、FSD和FSE分別表示添加濃度為1.0×108、1.0×109、1.0×1010、1.0×1011和1.0×1012 cfu/kg的屎腸球菌HK處理組，CON為對照組。圖中不同的字母表示相互之間差異顯著(P<0.05)。下圖同。FSA, FSB, FSC, FSD and FSE are treatments groups fed with different doses of E. faecium, i.e., 1.0×108, 1.0×109, 1.0×1010, 1.0×1011 and 1.0×1012 cfu/kg feed, and CON is the control group.Data with different letters means significant difference with each other(P<0.05).The same as follows.)

除FSA組，各處理組酸性磷酸酶活性顯著高于對照組，其中，F(xiàn)SC組顯著高于其他各處理組(P<0.05)，但FSA組與對照組差異不顯著(P>0.05，見圖1B)。

除FSE組，各處理組超氧化物歧化酶和酚氧化酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，而FSA、FSB、FSC與FSD組超氧化物歧化酶活性組間差異不顯著(P>0.05)。以FSC組酚氧化酶活性最高，但與FSB組差異不顯著(P>0.05，見圖1C—D)。

FSC和FSD組總一氧化氮合酶活性和溶菌酶濃度顯著高于對照組(P<0.05)，但兩組組間差異不顯著，且FSA、FSB和FSE組與對照組組間差異不顯著(P>0.05，見圖1E—F)。

2.3 SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因表達(dá)水平比較

分析了FSA、FSB、FSC、FSD、FSE組與對照組對蝦肝胰腺SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因相對表達(dá)量情況(見圖2)?？梢钥闯?，F(xiàn)SC、FSD和FSE組5個基因的相對表達(dá)量均顯著高于對照組(P<0.05)，但FSA組的SOD和LGBP和FSB組的LGBP表達(dá)水平與對照相差不大(P>0.05)。FSC組SOD、LZM和proPO相對基因表達(dá)量顯著高于FSA、FSB和FSE組，F(xiàn)SE組LGBP和HSP70相對基因表達(dá)量顯著高于其他各處理組(P<0.05)。

圖2 屎腸球菌HK不同添加濃度對凡納濱對蝦肝胰腺 SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因相對表達(dá)量的影響

2.4 Imd、Toll和Relish基因表達(dá)水平比較

比較分析了FSA、FSB、FSC、FSD、FSE組與對照組對蝦肝胰腺Imd、Toll和Relish基因相對表達(dá)量情況(見圖3)。可以看出，F(xiàn)SA、FSB、FSC、FSD組對蝦肝胰腺Imd、Toll和Relish基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，但FSE組Toll和Relish基因相對表達(dá)量與對照組差異不大(P>0.05)。不同處理組比較，F(xiàn)SC組Imd、Toll和Relish基因相對表達(dá)量顯著高于FSD和FSE組(P<0.05)，Imd和Relish基因相對表達(dá)量顯著高于FSA組，但與FSB組差異不顯著，Toll基因表達(dá)量與FSA和FSB組差異不顯著(P>0.05)。

2.5 mTOR信號通路基因表達(dá)水平比較

本研究對比了FSA、FSB、FSC、FSD、FSE組與對照組對蝦肝胰腺TOR、4E-BP、elF4E2和elF4E1α相對基因表達(dá)情況(見圖4)?？梢钥闯?，F(xiàn)SB、FSC和FSD組TOR、4E-BP、elF4E2和elF4E1α相對基因表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)SA和FSE組與對照組TOR和elF4E1α相對基因表達(dá)量差異不顯著，F(xiàn)SE組與對照組elF4E2基因表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。FSA和FSE組4E-BP相對基因表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)，F(xiàn)SA組elF4E2基因相對表達(dá)量顯著高于對照組(P<0.05)。

圖4 屎腸球菌HK不同添加濃度對凡納濱對蝦肝胰腺mTOR信號通路相關(guān)基因相對表達(dá)量的影響

2.6 抗病力

凡納濱對蝦副溶血弧菌攻毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示?？梢钥闯觯現(xiàn)SC組對蝦積累死亡率顯著低于FSA組和對照組(P<0.05)，其他各處理組間差異不顯著(P>0.05)。

圖5 副溶血弧菌攻毒凡納濱對蝦累計死亡率

3 討論

3.1 飼料中添加屎腸球菌HK對凡納濱對蝦生長的影響

近年來，隨著人們對抗生素不合理使用所導(dǎo)致的細(xì)菌耐藥性的負(fù)面作用影響以及“替抗”、“禁抗”相關(guān)規(guī)范與政策的相繼出臺，作為一種新型的水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中受到廣泛的關(guān)注，已成為抗生素最有力的替代者之一[16-17]。乳酸菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用最廣泛的益生菌之一，其益生作用主要包括促進(jìn)養(yǎng)殖動物腸道消化吸收、調(diào)節(jié)腸道菌群穩(wěn)態(tài)、提高非特異性免疫力等[6-8,18-19]。作為乳酸菌的屎腸球菌在畜牧行業(yè)應(yīng)用廣泛[20-23]，盡管在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也有一定的實(shí)際應(yīng)用，但與其他乳酸菌比較，對其合理的使用劑量及其益生作用的相關(guān)研究目前尚少見報道?，F(xiàn)有研究表明，屎腸球菌具有耐熱性強(qiáng)、耐藥性強(qiáng)、胃酸及黏附力強(qiáng)等生物學(xué)特性[24]，為其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適宜濃度的屎腸球菌HK可顯著提高凡納濱對蝦的生長和飼料效率，尤其是在1×1010cfu/kg添加劑量下，對蝦體現(xiàn)出最佳的生長性能。從已有的屎腸球菌在水產(chǎn)動物中的研究報道看，以每4天潑灑一次1×107cfu/mL屎腸球菌ZJ4或間歇性投喂添加5×109cfu/kg商品化屎腸球菌飼料均顯著提高了尼羅羅非魚(Oreochromisniloti-cus)的生長性能[25-26]，投喂添加5×1011cfu/kg屎腸球菌CGMCC1.2136也可顯著提高擬鯉(Rutilusrutiluscaspicus)的生長速率。而利用屎腸球菌發(fā)酵的豆粕，則可通過提高魚體抗氧化能力、降低炎性反應(yīng)及調(diào)節(jié)腸道菌群等一定程度上抵消因豆粕替代部分魚粉后對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)的生理上產(chǎn)生的負(fù)面影響[27]。可以看出，屎腸球菌的合理應(yīng)用可有效改善水產(chǎn)動物的生長性能，但由于屎腸球菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中研究與應(yīng)用的數(shù)據(jù)有限，其合理的使用劑量以及應(yīng)用方式尚需進(jìn)一步研究確定。

3.2 飼料中添加屎腸球菌HK對凡納濱對蝦血清非特異性免疫酶活性的影響

甲殼動物缺乏適應(yīng)性免疫，完全依靠先天免疫系統(tǒng)，其免疫系統(tǒng)主要由細(xì)胞免疫和體液免疫構(gòu)成[28-29]。對蝦血清中的非特異免疫酶和免疫因子在非特異性免疫中發(fā)揮著重要作用，例如堿性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LZM)總一氧化氮合酶(T-NOS)和凝集素等[30-32]。一般認(rèn)為，AKP和ACP參與水生動物的免疫防御，屬于能夠水解有機(jī)磷脂的磷酸酶[31-32]。同時，AKP與甲殼動物鈣、磷的吸收和甲殼素的形成和分泌直接相關(guān)，并參與免疫系統(tǒng)催化和代謝[33-34]。ACP是機(jī)體巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，且可反映巨噬細(xì)胞活化程度[34]。SOD在所有細(xì)胞中普遍存在，能夠破壞氧自由基，提高機(jī)體免疫力，反映出機(jī)體的抗應(yīng)激能力[35-36]。PO由proPO系統(tǒng)產(chǎn)生，能夠去除機(jī)體中過氧化氫，與甲殼動物的免疫密切相關(guān)[37]。LZM可以破壞細(xì)菌細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1、4-糖苷鍵，從而消化分解細(xì)菌，抑制外源性微生物的生長，增強(qiáng)免疫力[31-32]。NOS催化的一氧化氮(NO)具有抗菌、抗病毒和抗寄生蟲作用[33]。適宜的益生菌可有效調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物的非特異免疫能力，但不同參數(shù)的響應(yīng)可能與益生菌類型及動物種類有關(guān)，存在較大差別。例如，Wang等研究表明，水體潑灑屎腸球菌ZJ4顯著增強(qiáng)了尼羅羅非魚髓過氧化氫酶和吞噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性[25]。飼料中添加5×1011cfu/kg屎腸球菌CGMCC1.2136則有效提高了擬鯉血清中總免疫球蛋白含量、AKP和LZM活性，添加5×1010cfu/kg屎腸球菌W24后烏鱧(Channaargus)肝臟和腸道中SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物(GSH-Px)等抗氧化能力參數(shù)顯著增強(qiáng)[38]，但Natori的研究僅發(fā)現(xiàn)間歇投喂5×109cfu/kg屎腸球菌可提高尼羅羅非魚呼吸爆發(fā)活性[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加一定濃度的屎腸球菌可不同程度地提高凡納濱對蝦血清免疫相關(guān)酶活，但對蝦非特異免疫反應(yīng)可能存在明顯的劑量效應(yīng)。在1×108cfu/kg屎腸球菌低添加量下，對蝦血清AKP、ACP、T-NOS活性及LZM含量與對照組差異不顯著，1×1012cfu/kg屎腸球菌高添加量下，AKP、SOD、PO、T-NOS活性和LZM含量與對照組也差異不大。相比較，添加1×1010cfu/kg和1×1011cfu/kg屎腸球菌則可有效提高對蝦血清非特異免疫能力，對蝦血清中AKP、ACP、SOD、PO、T-NOS活性和LZM濃度顯著高于對照組。

3.3 屎腸球菌不同添加濃度對對蝦免疫相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

甲殼類動物具備多種由外源性病原體激活的防御機(jī)制。如多種防御分子，包括Toll受體、凝集素、脂多糖(LPS)、β-1, 3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)、含硫酯蛋白(TEPs)、酚氧化酶原(proPO)、免疫蛋白等體液因子及機(jī)制[36-40]。此外，脂多糖和β-1, 3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)是重要的模式識別蛋白(PRPs)，可識別革蘭氏陰性菌的脂多糖和β-1，3-葡聚糖(βG)，從而激活對蝦的先天免疫[41]。同時，先天免疫可以激活相關(guān)的免疫基因來抵御微生物的入侵。在本研究中，F(xiàn)SC、FSD和FSE組肝胰腺組織中SOD、LZM、proPO、LGBP和HSP70基因的相對表達(dá)量均顯著上調(diào)。這些結(jié)果與其他學(xué)者的研究一致，即一定濃度的屎腸球菌可以有效提高水生動物的免疫和抗應(yīng)激能力，并誘導(dǎo)免疫相關(guān)基因的表達(dá)[26,42]。5個處理組相比較，飼料中添加1×1010cfu/kg屎腸球菌HK可有效促進(jìn)對蝦肝胰腺組織中免疫基因相對表達(dá)量的提高。

Toll和Imd信號通路調(diào)控不同抗菌肽的基因表達(dá)水平。其中，Imd信號通路介導(dǎo)甲殼動物對革蘭氏陰性菌的先天免疫[43]。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在甲殼類動物的先天免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而Relish則是NF-κB家族的一部分。mTOR信號通路作為一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在營養(yǎng)調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長中起著重要作用[44]。此外，雷帕霉素靶蛋白(TOR)通過核糖體蛋白S6激酶多肽1(S6K1)和真核翻譯起始因子4E-結(jié)合蛋白(4E-BPS)啟動翻譯并刺激蛋白質(zhì)合成，而4E-BP參與了mTORC1的調(diào)控[45]。帽結(jié)合蛋白eIF4E，即eIF4E1、eIF4E2、eIF4E3等，不僅是細(xì)胞生長所必需的蛋白，而且與mTORC1下游細(xì)胞過程中的免疫密切相關(guān)[46]。本研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加屎腸球菌HK顯著提高了凡納濱對蝦肝胰腺器官中Toll、Imd和Relish基因的表達(dá)水平。這些結(jié)果與Sha等[47]的研究結(jié)果相似，該學(xué)者也發(fā)現(xiàn)飼料中添加屎腸球菌NRW-2可在凡納濱對蝦中誘導(dǎo)出較高的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平。mTOR信號通路與對蝦的生長和抗病性均密切相關(guān)，結(jié)合本研究各處理組對蝦生長情況及副溶血弧菌攻毒數(shù)據(jù)，表明添加1×1010cfu/kg屎腸球菌HK可誘導(dǎo)凡納濱對蝦較高的免疫相關(guān)基因表達(dá)水平，顯著提高對蝦的抗病力。

3.4 飼料中添加不同濃度屎腸球菌對凡納濱對蝦抗病力的影響

細(xì)菌性病害是對蝦養(yǎng)殖業(yè)的主要病害之一，主要包括副溶血弧菌、哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)等多個種屬，其中副溶血弧菌是一種普遍存在于海水中，對水生動物具有較高致病性的細(xì)菌之一[48-51]。世界范圍內(nèi)，副溶血弧菌導(dǎo)致的急性肝胰腺壞死病(AHPND)每年給對蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失[48]。通過合理添加益生菌、益生元和后生元等添加物，提高對蝦的免疫力和對病原菌的抵抗力，是目前對蝦健康養(yǎng)殖管理的方式之一。目前常用的益生菌(乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌等)均可不同程度地提高對蝦的抗病力。例如，李佳徽等[52]研究發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加糞腸球菌和嗜酸乳桿菌促進(jìn)了凡納濱對蝦生長性能，同時也提高了副溶血弧菌的抗病力。同樣，添加復(fù)合益生菌也可有效提高凡納濱對蝦抗副溶血弧菌感染能力[53]。本研究表明，不同添加劑量比較，添加1×1010cfu/kg屎腸球菌HK的對蝦在副溶血性弧菌攻毒后抗病力顯著提高，累積死亡率顯著降低，且與對蝦特定生長率、血清非特異性免疫酶活性和免疫相關(guān)信號通路基因表達(dá)水平等指標(biāo)的變化有較好的對應(yīng)關(guān)系。因此，在本研究中，對蝦對副溶血弧菌抗病力的提高可能與適宜濃度屎腸球菌HK添加對機(jī)體產(chǎn)生的益生作用直接相關(guān)。

4 結(jié)論

飼料中添加不同濃度屎腸球菌HK能有效促進(jìn)凡納濱對蝦的生長，提高對蝦血清的非特異性免疫酶活性和免疫相關(guān)基因表達(dá)水平，增強(qiáng)對蝦對副溶血弧菌的抗病力。以特定生長率作為評價指標(biāo)，在凡納濱對蝦的養(yǎng)殖應(yīng)用中，屎腸球菌HK在飼料中的最適添加量為1×1010cfu/kg。